Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

Summary

Describimos dos métodos complementarios que utilizan el indicador de ciclo celular de ubiquitinación por fluorescencia (FUCCI) y el análisis de imágenes o citometría de flujo para identificar y aislar células en las regiones internas G1 detenidas y proliferantes externas de los esferoides 3D.

Abstract

< clase p='jove_content'>Los esferoides tumorales tridimensionales (3D) se utilizan en la investigación del cáncer como un modelo más preciso del microambiente tumoral in vivo, en comparación con el cultivo celular bidimensional (2D) tradicional. El modelo esferoide es capaz de imitar los efectos de la interacción célula-célula, la hipoxia y la privación de nutrientes, y la penetración de fármacos. Una característica de este modelo es el desarrollo de un núcleo necrótico, rodeado por un anillo de células detenidas G1, con células proliferantes en las capas externas del esferoide. De interés en el campo del cáncer es cómo las diferentes regiones del esferoide responden a las terapias farmacológicas, así como a la manipulación genética o ambiental. Describimos aquí el uso del sistema indicador de ciclo celular de ubiquitinación por fluorescencia (FUCCI) junto con la citometría y el análisis de imágenes utilizando software comercial para caracterizar el estado del ciclo celular de las células con respecto a su posición dentro de los esferoides de melanoma. Estos métodos se pueden utilizar para rastrear los cambios en el estado del ciclo celular, la expresión de genes/proteínas o la viabilidad celular en diferentes subregiones de esferoides tumorales a lo largo del tiempo y en diferentes condiciones.

Introduction

Esferoides multicelulares 3D se han conocido como un modelo de tumor durante décadas, sin embargo, es sólo recientemente que han llegado a ser de uso más común a medida un modelo in vitro para muchos cánceres sólidos. Ellos se utilizan cada vez en las pantallas de descubrimiento de fármacos de alto rendimiento como un intermediario entre el complejo, costoso y lento en modelos in vivo y el simple, el modelo de monocapa 2D bajo coste ^6.1. Los estudios realizados en la cultura 2D a menudo no pueden ser replicados en vivo. Modelos Esferoide de muchos tipos de cáncer son capaces de imitar las características de crec....

Protocol

1. FUCCI Transducción y Cultivo Celular

1. FUCCI transducción
   1. Crear líneas celulares que expresan establemente el FUCCI construye mKO2-hCdt1 (30-120) y MAG-hGem (1-100) ¹⁵ utilizando lentivirus co-transducción de lo descrito previamente ^7.
      Nota: El sistema FUCCI ya está disponible comercialmente.
   2. Generar sub-clones con fluorescencia brillante por la clasificación de una sola célula. Ordenar células individuales positivas tanto para AG y KO (amarillo) por fluorescencia de células activadas por la clasificación en una placa de 96 pocillos como se describió previamente ^7,16.
2. Cultivo d....

Results

Hay varios métodos de producción de esferoides tumorales, este protocolo utiliza el método de crecimiento no adherente, donde las células se cultivan en agar o agarosa ^3,7,9. La figura 1 muestra un ejemplo de un esferoide melanoma C8161 después de 3 días en agar. Esferoides C8161 forman esferoides de tamaño regular con un diámetro de 500 a 600 m (media = 565, SD = 19, n = 3) después de 3 días. Otras líneas celulares de melanoma que formarán esferoides incluyen: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1.......

Discussion

Análisis de imágenes semi-automatizado identifica la región G1 arrestado interior esferoide, y la proliferación de las capas exteriores. Este método puede ser utilizado en esferoides en vivo usando una sección óptica, o en secciones esferoide fijos, para identificar los cambios en no sólo el ciclo celular, pero la expresión del marcador (a través de inmunofluorescencia), la muerte celular, o la morfología celular en estas diferentes regiones. Motilidad celular dentro de las diferentes regiones esferoide también puede se.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarosa de bajo punto de fusión	Life Technologies	16520-050	Para el corte de
agar noble	Sigma	A5431	Para la fabricación de esferoides
agarosa para esferoides	Fisher Scientific	BP1356-100	Para la fabricación de esferoides
0,05% tripsina/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalina	Sigma	HT5014-1CS	PRECAUCIÓN: Nocivo, corrosivo. Utilice equipo de protección personal, haga   no respira humos (abierto en un armario de gases).
vivos/muertos cerca de IR	Life Technologies	L10119
vibratome	Products International, Inc
taza de coulture	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Molde para seccionar esferoides
hemocitómetro	Sigma Z359629
placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos	Invitro	FAL353072
colagenasa	Sigma	C5138
microscopio confocal	Leica	TCS SP5
Analizador de citómetro de flujo	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Software de imagen
flowjo	Tree Star		Software de citometría Flow
Grasa de vacío	Sigma	Z273554
Medios de montaje	Vector Laboratorios	H1000
FUCCI (construcciones comerciales)	Life Technologies	P36238	Solo transfección transitoria
Filtro de células 70 μ m	In Vitro	FAL352350
Tubos de fondo redondo de 5 ml (estériles)	In Vitro	FAL352003
Tubos de fondo redondo de 5 ml (no estériles)	In Vitro	FAL352008