Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

Summary

Aquí, presentamos el protocolo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratones, un modelo experimental que recrea las características vasculares de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) neovascular. Una vez dominado, puede inducir de forma fiable y eficaz la CNV como sistema modelo para probar diversas medidas experimentales.

Abstract

El modelo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratón ha sido un modelo crucial para la investigación de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) neovascular. Al administrar una lesión selectiva con láser en el EPR y la membrana de Bruch, el procedimiento induce la angiogénesis, modelando la patología distintiva observada en la DMAE neovascular.

Desarrollado por primera vez en primates no humanos, el modelo CNV inducido por láser ha llegado a implementarse en muchas otras especies, la más reciente de las cuales es el ratón. Los experimentos con ratones son ventajosamente más rentables, los experimentos se pueden ejecutar en una línea de tiempo mucho más rápida y permiten el uso de varios modelos transgénicos. Sin embargo, el tamaño en miniatura del ojo del ratón plantea un desafío particular al realizar el procedimiento. La manipulación del ojo para visualizar la retina requiere la práctica de habilidades de destreza fina, así como la coordinación simultánea mano-ojo-pie para operar el láser. Sin embargo, una vez dominado, el modelo se puede aplicar para estudiar muchos aspectos de la DMAE neovascular, como los mecanismos moleculares, el efecto de las manipulaciones genéticas y los efectos del tratamiento farmacológico.

El modelo de CNV inducido por láser, aunque útil, no es un modelo perfecto de la enfermedad. Por lo demás, el ojo del ratón de tipo salvaje está sano, y el entorno corio-retiniano no imita los cambios patológicos en la DMAE humana. Además, la angiogénesis inducida por lesiones no refleja las mismas vías que la angiogénesis que ocurre en un estado de enfermedad crónica y relacionada con la edad como en la DMAE.

A pesar de sus deficiencias, el modelo de CNV inducido por láser es uno de los mejores métodos disponibles actualmente para estudiar la patología debilitante de la DMAE neovascular. Su implementación ha llevado a una comprensión más profunda de la patogénesis de la DMAE, además de contribuir al desarrollo de muchas de las terapias disponibles actualmente para la DMAE.

Introduction

Edad relacionados con la degeneración macular (AMD) es una de las principales causas de ceguera en personas mayores de 50 ^1.3. AMD se puede clasificar en dos formas: atrófica ("secar") y AMD neovascular ("húmeda") de AMD. El primero se caracteriza por la atrofia geográfica del epitelio pigmentario de la retina (RPE), coriocapilar, y los fotorreceptores, mientras que el último se caracteriza por la invasión de vasos anormales de la coroides en las capas externas de la retina causando fugas, hemorragia y fibrosis, y en última instancia que conduce a la ceguera ^1,2. De las dos formas, AMD neovascular da cuenta de la mayoría de la pérdida de visión ....

Protocol

Todos los animales son tratados de acuerdo con la Guía del Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 2013 Edition, la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y aprobada por el Animal Institucional Cuidado y el empleo Comisión de la Universidad Northwestern.

Nota: El siguiente procedimiento se puede realizar en su totalidad con un operador; sin embargo, se llevó a cabo mucho más eficiente con dos operadores con las tareas se dividen en consecuencia.

1. Prepare la estación láser y Pre-láser

1. Coloque el láser y l....

Results

La cuantificación de las lesiones CNV se puede realizar mediante el análisis de coroides-plana montada utilizando la tinción de inmunofluorescencia para etiquetar los vasos de la CNV. Los dos métodos utilizados con mayor frecuencia de la preparación del tejido son etiquetado FITC-dextrano, hecho a través de la perfusión inmediatamente antes del sacrificio de los animales, o post-mortem inmuno-tinción con un marcador de células endoteliales. Ambos métodos se han descrito anteriormente en detalle ^13,14,21;

Discussion

Existen múltiples factores que pueden afectar la entrega de láser y la consiguiente desarrollo de la lesión NVC tras éxito láser inducción. Estos factores deben ser controlados por y estandarizados con el fin de tener los resultados más confiables. El más pertinente de estos factores son la selección del ratón (genotipo, edad y sexo), la selección de anestésico, y la configuración de láser.

El modelo específico de ratón utilizada puede tener un efecto significativo en el curso del desarrollo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Láser oftálmico de argón de 532 nm (verde)	IRIDEX	GLx	cualquier láser de argón oftálmico de 532 nm (verde) se puede utilizar
hendidura	Carl Zeiss	30SL-M	cualquier lámpara de hendidura puede utilizarse siempre que sea compatible con el láser
tribromoetanol	Sigma	T48402-25G	utilizado para fabricar anestésico
alcohol terc-amílico	Sigma	152463-1L	utilizado para hacer anestésico
viales de vidrio ámbar + septos	Wheaton	WH-223696	almacenamiento de tribromoetanol
	VWR	82003-820	varios
1% Tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	dilatación pupilar
0,5% Clorhidrato de tetracaína	Alcon	0065-0741-12	anestesia tópica
lágrimas artificiales	Alcon	58768-788-25 bomba de terapia de	hidratación
(para calentar animales)	Kent Scientific	HTP-1500	utilizado para mantener la temperatura corporal de los animales
almohadilla de calentamiento	Kent Scientific	TPZ-0510EA mantiene la	temperatura corporal del animal
30 G agujas de insulina	BD	328418	inyección de anestesia
	Báscula de pesaje americana	AWS-1KG-BLK	Pesaje de ratón
cubreobjetos (25 mm x 25 mm)	VWR		48366089 aplanar la córnea para visualizar la retina del ratón
xilacina	obtenida de la institución	anestesia	la institución
ketamina	obtenida	de la	la anestesia
Volocity	PerkinElmer		utilizada para la reconstrucción volumétrica
ImageJ	Institutos Nacionales de Salud		utilizados para el análisis de imágenes