Una estrategia para validar el papel de callosa mediada Plasmodesmal de apertura de puerta en la respuesta Tropic

Resumen

En este artículo se describen los métodos para seleccionar los genes que controlan la permeabilidad plasmodesmal y el gradiente de ahí auxina durante la respuesta trópico. Esto incluye la medición del grado de respuesta trópico en hipocotilo de Arabidopsis thaliana y comprobar la permeabilidad plasmodesmal por el ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico carga (HPTS) y la evaluación del nivel de fin de callosa.

Resumen

La hormona vegetal auxina juega un papel importante en muchos procesos de crecimiento y desarrollo, incluyendo las respuestas trópico a la luz y la gravedad. El establecimiento de un gradiente de auxina es un evento clave que conduce a phototropism y gravitropismo. Anteriormente, se demostró que el transporte de auxina polar (PAT) para establecer un gradiente de auxina en diferentes dominios celulares de las plantas. Sin embargo, Han et al. Demostró recientemente que para la formación adecuada gradiente de auxina, plasmodesmal conectividad symplasmic callose mediada entre las células adyacentes es también un factor crítico. En este manuscrito, la estrategia para dilucidar el papel de determinados genes, que pueden afectar phototropism y gravitropismo alterando la conectividad symplasmic través de la modulación de la síntesis de callosa plasmodesmal, se discute. El primer paso es para detectar respuestas trópico aberrantes de 3 días de edad, las plántulas etioladas de mutantes o sobre-expresión líneas de un gen junto con el tipo salvaje. Esta selección preliminarpuede conducir a la identificación de una serie de genes que funcionan en PAT o controlan la conectividad symplasmic. La segunda selección implica la clasificación de los candidatos que muestran respuestas alteradas trópico al afectar la conectividad symplasmic. Para hacer frente a estos candidatos, se examinaron el movimiento de un trazador symplasmic y la deposición de callosa plasmodesmal. Esta estrategia sería útil explorar nuevos genes candidatos que pueden regular la conectividad symplasmic directa o indirectamente durante las respuestas tropicales y otros procesos de desarrollo.

Introducción

Las plantas, como organismos vivos sésiles, han desarrollado una red altamente sofisticada de señalización célula a célula para hacer frente a diversos estímulos ambientales. respuestas Tropic son uno de los fenómenos por los que las plantas responden a los estímulos ambientales. Las plantas muestran dos principales respuestas trópico, phototropism y gravitropismo. plantas fotosintéticas se doblan hacia la fuente de luz por phototropism para cosechar el máximo de energía. Del mismo modo, gravitropismo hace que las plantas a crecer hacia el centro de gravedad. El mecanismo fundamental que lleva a este tipo de respuestas trópico implica la formación del gradiente asimé....

Protocolo

1. La selección de mutantes con alteración de las respuestas Phototropic y gravitrópica

1. Preparar 1x Murashige y Skoog (MS), pH 5,7, con 0,8% de agar Un día antes del experimento.
   1. Añadir 800 ml de agua doblemente destilada a un matraz cónico de 2 litros y se agita con una barra magnética.
   2. Añadir 4,4 g de sal de MS al matraz cónico.
   3. Añadir 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) y se agita hasta que todas las sales se disuelven completamente.
   4. Se ajusta el pH del medio a 5,7 con 1 M de KOH.
   5. Pasar el medio de un cilindro de masa y llevar a un volumen final de 1 litro con _ddH2O
   6. Verter....

Resultados

En la configuración actual, dexametasona (DEX) inducible RNAi líneas de AtGSL8 [en adelante dsGSL8 (+ dex / -DEX)] se utilizaron, como gsl8 homocigotos mutantes de inserción de T-ADN son de plántulas letal ^18. Tres días de edad, las plántulas de ahiladas dsGSL8 y plántulas de tipo salvaje con Dex ± fueron expuestos a estímulos phototropic y gravitrópica. Se encontró que dsGSL8 (+ DEX) plántulas eran defectuosas en phototropism y gra.......

Discusión

En este manuscrito, una estrategia para la pantalla líneas mutantes / sobre-expresión que son defectuosos en las respuestas fototrópicos y gravitrópica debido a la alteración de callose PD y, por lo tanto, PD SEL se describe en detalle. la síntesis y la degradación de callosa PD se lleva a cabo principalmente por sintasas callose y β-1,3-glucanasas, pero la regulación de estas enzimas es controlada por muchos factores aguas arriba. Para buscar estos factores corriente arriba o candidatos que están directamente involucra.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HPTS (8-hidroxipireno -1,3,6-sal trisódica del ácido trisulfónico)	Sigma	H1529-1G	Colorante fluorescente como trazador siplásmico
LE Agarosa	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Utilizado para el bloque de agarosa HPTS
Horno de microondas	LG-Goldstar		Máquina para hervir gel de agarosa
Matraz cónico de vidrio de 100 ml	Dong Kwang	A0205	Utilizado para hervir HPTS agarosa placa de Petri de gel
(35 mm x 10 mm)	SPL ciencias de la vida	SPL10035	Se utiliza para hacer bloques de agarosa HPTS y lavar muestras de plantas
Portaobjetos de cubierta de microscopio y portaobjetos de vidrio (24 mm x 50 mm)	Cristalería de laboratorio Marienfeld	101222	Se utiliza para bloques de agarosa HPTS y preparación de muestras microscópicas
Placas medianas MS 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL ciencias de la vida	SPL11125	Placas para hacer medio de agar MS
Tijeras	Alemania Inoxidable	HSB 942-11	Se utiliza para extirpar la región del gancho de muestras de plantas
Murashige y Skoog (MS) mezcla de sales basales	Duchefa	P10453.01	MS medio que incluye vitaminas.
(N-morfolino) ácido etanosulfónico (MES) monohidrato	Bioshop	3G30212	Para hacer medios MS.
Agar vegetal	Duchefa	P1001.1000	Para solidificar medios MS.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	Para lavar el tampón de tinción azul de anilina y el tinte HPTS de forma plácida.
1 ml Puntas azules	Sorenson	10040
Pipeta de 1 ml	BioPette	L-1101-2
Cinta quirúrgica	MIcropore	1530-0	Para sellar la placa MS
Azul de anilina (azul de metilo)	Sigma	M5528-25G	Se utiliza para preparar el tampón de tinción azul de anilina.
Glycine	Bioshop	GLN001	Se utiliza para preparar tampón de tinción de azul de anilina.
DDG	Sigma	D8375-1G	Se utiliza para la inhibición de las calosa sintasas.
Microscopio confocal	Olympus FV1000MPE	SIM	Para comprobar la tinción con azul de anilina y el resultado de la carga de colorante HPTS.
Agitador	I laboratorio	K400	Para mezclar la solución de medios.
Papel de aluminio	SW papel		Para envolver platos en condiciones oscuras.
Hipoclorito de sodio	Samjin Industry		Para semillas esterilizadas en superficie

de cocción