Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad

Resumen

Este manuscrito describe cómo preparar biochips fluídicos con células epiteliales branquiales de trucha arco iris para su uso en un sensor de impedancia de sustrato de celda eléctrica portátil de campo. También se describe el protocolo para realizar una prueba rápida de toxicidad del agua potable con el sensor.

Resumen

Este manuscrito describe cómo preparar biochips fluídicos con células epiteliales branquiales de trucha arco iris (RTgill-W1) para su uso en un sensor portátil de toxicidad del agua de campo. Se forma una monocapa de células RTgill-W1 en los electrodos de detección encerrados dentro de los biochips. A continuación, los biochips se utilizan para realizar pruebas en un dispositivo portátil de detección de impedancia de sustrato eléctrico (ECIS) diseñado para pruebas rápidas de toxicidad del agua potable. El manuscrito describe además cómo realizar una prueba de toxicidad utilizando los biochips preparados. Una muestra de agua de control y la muestra de agua de prueba se mezclan con medios en polvo previamente medidos y se inyectan en canales separados del biochip. Las lecturas de impedancia de los electrodos de detección en cada uno de los canales del biochip se miden y comparan mediante un programa de software estadístico automatizado. La pantalla del instrumento ECIS indicará "Contaminación detectada" o "No se detectó contaminación" dentro de una hora después de la inyección de la muestra. Las ventajas son la facilidad de uso y la rápida respuesta a un amplio espectro de productos químicos orgánicos e inorgánicos en concentraciones que son relevantes para los problemas de salud humana, así como la estabilidad a largo plazo de los biochips almacenados en un estado listo para las pruebas. Las limitaciones son el requisito de almacenamiento en frío de los biochips y la sensibilidad limitada a los plaguicidas inhibidores de la colinesterasa. Las aplicaciones de este detector de toxicidad son para pruebas rápidas portátiles de suministros de agua potable por parte del personal de Medicina Preventiva del Ejército o para su uso en instalaciones municipales de tratamiento de agua.

Introducción

El objetivo general fue desarrollar un método para la siembra de células, el almacenamiento y la prueba de biochips de fluidos en el biosensor ECIS. El objetivo para el desarrollo de este biosensor era para satisfacer las especificaciones del Ejército de EE.UU. para un dispositivo portátil de campo que podría detectar la posible contaminación de los suministros de agua potable que se utiliza por los soldados. Los requisitos para el sensor de toxicidad fueron que podría detectar un amplio espectro de compuestos industriales tóxicos rápidamente (dentro de una hora) a concentraciones relevantes para la salud humana, que el dispositivo sea de campo portátil, y los componentes biológicos tendría una vida útil de al menos nueve meses. Refrigeración, pero no helada, de los componentes perecederos era aceptable.

Históricamente, las tecnologías de campo portátiles de análisis de agua con un componente biológico para ellos (tales como anticuerpos, enzimas o ácidos nucleicos) han sido específico del analito ^1-3. La desventaja de estos tipos de biosensores es que van a ONLy detectar un tipo de producto químico a la vez. Se necesitan sensores múltiples si se sospecha de que más de un producto químico está presente. Si un sensor específico no está en el repertorio de evaluación, los contaminantes químicos en el agua podrían fácilmente no se detectan.

sensores de toxicidad de base amplia, por el contrario, tienen el potencial para llenar esta brecha tecnológica. Estos por lo general tienen un componente celular a ellos ^4-8. Las ventajas de los biosensores de toxicidad son de amplia base que pueden detectar la presencia de una amplia variedad de contaminantes químicos, incluidas las mezclas y las incógnitas, en un período relativamente corto de tiempo ^5,9,10.

El concepto de usar la medición de la impedancia eléctrica de monocapas de células como una posible toxicidad sensor, que también se conoce como eléctrico de pila de sustrato de impedancia de detección (IEM), fue descrito por primera vez por Giaever y Keese ^11. Durante las últimas dos décadas se ha demostrado que es un indicador sensible de VIAB célulaility y la citotoxicidad. Básicamente, la monocapa de células que se adhiere a los electrodos en los biochips se expone a alta frecuencia y baja tensión y la señal de corriente alterna amperaje. La monocapa confluente de células impide el flujo de electrones. Cuando se ve comprometida la integridad de la monocapa celular (como cuando se introduce una sustancia química tóxica), el sensor ECIS registra un cambio en la impedancia eléctrica ^11-14. La figura 1 ilustra el principio de ECIS en relación con la monocapa de células en el biochip .

Figura 1:.. Principio de ECIS Ilustración de una monocapa de células en un biochip con lector de ECIS simplificado esquema eléctrico Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

12. Estas células no eran prácticos para el uso en el campo, sin embargo, debido a que requiere cambios frecuentes de medios de comunicación, tenía una vida útil limitada, y se requiere un ambiente artificial _{de CO2} y una temperatura de 37 ° C de incubación. Se descubrió que una línea celular disponible en el mercado derivado de las células epiteliales de la trucha arco iris de enmalle (células RTgill 1 W-) podría ponerse a prueba a una temperatura ambiente de CO ambiente _2, formado una monocapa confluente en los biochips, podría ser almacenado a temperaturas de refrigeración, y tenido una respuesta rápida (1 hora o menos) a un amplio espectro de productos químicos en concentraciones relevantes para la salud humana ^12. Aplicaciones de las células RTgill-W1 en toxicología, así como en investigación básica, son revisados ​​por Lee et al. ¹⁵

Los métodos para la siembra, el almacenamiento y la prueba de biochips de fluidos que contienenmonocapas de células RTgill-W1 en biochips de fluidos en un biosensor ECIS se describen aquí. Los biochips de fluidos se pueden almacenar durante un máximo de 9 meses en un estado refrigerado y pueden ser enviados en un contenedor de almacenamiento en frío, para la prueba de supplies.The de agua potable que acompañan a los lectores ECIS, o unidades de prueba, se envían por separado. Los biochips tienen dos componentes a ellos; una capa de policarbonato superior con dos canales de fluido separados, y una capa inferior electrónica que contiene cuatro electrodos por canal para detección de impedancia. Hay 10 electrodos de trabajo por la almohadilla; cada electrodo es de 250 micras de diámetro. Los biochips reunidos tienen conexiones de electrodo de oro para adquirir lecturas de impedancia cuando se inserta en la unidad de prueba ECIS. Cada uno de los dos canales en forma de U de fluidos cerrados llevará a cabo 2 ml de la suspensión celular RTgill-W1. La figura 2 muestra un biochip fluídico en el lector ECIS con una ampliación de una células confluentes en un único electrodo de detección.

Figura 2:.. Biochip neumático en ECIS lector área ampliada muestra una monocapa confluente de células RTgill-W1 en un único electrodo de detección Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. Preparación de la Prueba de Materiales

NOTA: Con el fin de preparar los biochips para la prueba, varios matraces confluentes de células RTgill-W1 tiene que estar listo. Una buena estimación de la cantidad de frascos que se necesita es un confluente T175 matraz durante 16 biochips para ser sembradas.

1. Realice los siguientes pasos en un armario de clase II biológica de seguridad (biohood) utilizando una técnica aséptica. Utilizar etanol al 70% para la desinfección del biohood y cualquier material colocado en la campana.
   1. Preparar sustrato fibronectina para los biochips fluídicos descongelando un vial 1 mg de fibronectina y diluir en 100 ml de estériles L 15-media para una concentración de 10 mg / ml. Congelar en alícuotas de 40 ml en tubos de 50 ml cónicos de polipropileno estériles a -20 ° C. Descongelar a temperatura ambiente varias horas antes de sembrar los biochips. Una vez descongelado, no volver a congelar.
   2. Preparar medios de cultivo celular mediante la adición de 50 ml de suero bovino fetal, 5 ml de 200 mM de una sup L-alanil-L-glutaminacomplemento, y 5 ml de una solución de penicilina / estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / ml y / ml 10 000 g de estreptomicina) stock a 500 ml de L 15-media. Esto dará lugar a 560 ml de medio de cultivo celular que contiene 9% de suero. Refrigerar.
      Nota: Este será el medio de cultivo celular completo que se utiliza para los frascos de cultivo y los biochips.
2. Los viales en polvo Medios
   1. Preparar con anticipación viales de 0,1 copita de tapa a presión que contienen 60 mg ± 0,5% de polvo de L-15ex usando un dispensador de polvo automatizado. Etiquetar los viales con la fecha en que se dispensa el polvo y viales refrigerar (en cantidades de 50) en bolsas de plástico metalizadas pueden volver a cerrar; que contienen cada uno tres 1 g de gel de sílice paquetes de desecación.
      Nota: Los viales de L-15ex medios de comunicación en polvo se pueden hacer y se almacenan durante un máximo de 9 meses antes de la prueba.
3. Hacer una solución de 100 ml de 20% de lejía por dilución de lejía de uso doméstico con agua desionizada (DI). Estiman que se necesitarán 5 ml de solución de cloro por cada biochip.
4. Hacer conjuntos de tubos biochip mediante la reducción de 27 mm secciones de tubo biocompatible autoclavable (2 secciones para cada biochip para ser sembradas) y colocar los dos extremos del tubo con accesorios Luer de policarbonato de deslizamiento. Coloque los conjuntos de tubos en una bolsa de autoclave y la autoclave durante 8 minutos a 134 ° C. También tapones autoclave biochip (2 por biochip) en una bolsa separada en la misma configuración.
5. agua DI autoclave durante 30 minutos at121 ° C.
   Nota: Esta agua será utilizada para el lavado biochips después de la siembra. Estiman que serán necesarios 10 ml por cada biochip.
   Nota: El volumen real de cada canal de biochip es de 2 ml, pero 5 ml de agua estéril se aclara a través de cada canal después de la eliminación de la solución de lejía.
6. Hacer conjuntos de tubos de inyección de la jeringa mediante la reducción de 27 mm secciones de tubo biocompatible y fijar accesorios de deslizamiento luer macho a ambos extremos de la tubería. Coloque los conjuntos de tubos en una bolsa de esterilización de papel sellado térmico y autoclave durante 8 minutos a 134 y# 176; C.

2. Procedimiento neumático biochip Siembra

Nota: Realizar todos los procedimientos en los que los biochips o los medios de comunicación se maneja de una cabina de seguridad biológica clase II utilizando una técnica aséptica.

1. Veinticuatro horas antes de la siembra programada, eliminar los biochips de envasado fabricante en el biohood y colocar en estuches de instrumentos de plástico esterilizados.
2. Esterilizar los biochips utilizando una solución de lejía al 20% de la siguiente
   Nota: Históricamente, este procedimiento de blanqueo ha impedido el crecimiento de hongos en los biochips durante el almacenamiento a largo plazo en el caso de que la esterilización por plasma de los biochips hecho por el fabricante no era eficaz.
   1. El uso de un 20 ml de jeringa estéril con una tubería de inyección de jeringa conjunto unido y trabajando en el biohood, inyectar 2 ml de la solución de cloro 20% en cada canal del biochip. Permitir a los biochips para sentarse durante 1 hora con la solución de cloro.
   2. Después de una hora, asp vacíoiRate la solución de cloro de ambos canales a través de un conjunto de deslizamiento luer macho estéril conectada a la tubería de succión de vacío. Utilice uno de los conjuntos de tubos biochip como un drenaje que se enjuaguen los biochips.
   3. Con una jeringa de 20 ml estéril conectada a un conjunto de inyección jeringa estéril, enjuague cada canal del chip con 5 ml de agua estéril, permitiendo que el exceso de agua se drene en un recipiente en el biohood. Entonces vacío aspirado fuera del agua como se acaba de describir para el blanqueo y coloque los biochips de nuevo en las cajas de los instrumentos de plástico y dejar en el biohood hasta sembrada con células al día siguiente.
3. Sesenta minutos antes de la siembra de los biochips, inyectar 2 ml de la solución de fibronectina 10 mg / ml en cada canal del biochip. Dejar los biochips en el biohood de 60 min, y luego la aspiradora aspirado fuera de la fibronectina (como se describe en el paso 2.2.3) antes de la siembra el biochip con las células. Coloque dos secciones de los conjuntos de tubos estériles biochip (consultela sección 1.4) en los puertos de los biochips.
4. Trypsinize uno confluentes RTgill-W1 matraz T175 por cada 16 biochips utilizando procedimientos descritos en la descripción del producto de lámina de la American Type Culture Collection (ATCC) ^16.
   1. Aspirar los medios de comunicación del matraz (s) confluente de células.
   2. Enjuagar la capa de células con 15 ml de PBS y luego aspirar fuera.
   3. Añadir 6 ml de tripsina / EDTA a la capa de células en cada matraz T175 y permiten a las células trypsinize de ~ 5 min.
   4. Añadir 15 ml de medio de cultivo celular completo L-15 a cada matraz para detener la tripsinización.
   5. Se combinan las suspensiones de células en un recipiente estéril desechable.
      Nota: El tamaño del envase puede variar de 150-500 ml, dependiendo de la cantidad de biochips se sembró. Estiman que se necesitarán 5 ml de suspensión celular por biochip.
5. Retire ~ 1 ml de la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga para el recuento. El uso de un microscopio de campo claro con un objecti 10Xve y un hemocitómetro, el recuento una alícuota de 10 l de las células y calcular el volumen de completa L-15 medios de cultivo celular necesaria para alcanzar una suspensión de células de 2,5 x 10 ⁵ células / ml.
   Nota: Si se utiliza la suspensión de células para sembrar matraces para continuar con la cultura, este sería el momento para hacerlo. Ajustar la concentración de la suspensión de células usando completa medios de cultivo celular L-15.
6. El uso de un estériles de 20 ml syringeattached a un conjunto de tubería de inyección de jeringa estéril (ver sección 1.6), inyectar 2,5 ml de la suspensión celular en el puerto exterior de cada canal del biochip (es decir, los puertos que no tienen el tubo adjunto), permitiendo que algunos de la suspensión de células extra para fluir fuera de la tubería en un contenedor de residuos en el biohood.
   Nota: Esto asegurará que todo el canal y el tubo conectado se llena de la suspensión celular.
   1. Crear un bucle cerrado para cada canal de biochip mediante la inserción del extremo libre de la manguera con el Fitti luerng en los puertos exteriores para cada canal.
   2. Limpie cualquier exceso de los medios de comunicación fuera de los circuitos cerrados con una toalla de papel humedecido con 70% de etanol y colocar los biochips de nuevo en la caja de plástico en un 20 ° C incubadora. Dé a cada biochip un número de identificación único.
7. En los días 4 y 7, eliminar los biochips de la 20 ° C incubadora y reponer los medios de comunicación en todos los biochips con medios de cultivo celular completo L-15 de temperatura-equilibrada. Seguir el mismo procedimiento que en el paso 2.6, salvo el uso justo L-15 medios de cultivo celular en vez (sin suspensión de células). Coloque los biochips de nuevo en la incubadora de 20 ° C después de la alimentación el día 4.
   1. Después de la alimentación el día 7, retirar y desechar las mangueras de los chips e insertar los tapones de drenaje tratadas en autoclave en los biochips.
   2. Coloque los biochips en una caja en un incubador a 6 ° hasta que se usaron para la prueba.
      Nota: Las fichas se pueden almacenar a temperaturas de refrigeración para un máximo de 9 meses y siguen siendo viables para i prueban los lectores ECIS.

3. Prueba de ECIS con biochips

1. Preparar sustancias químicas de prueba si se utiliza. (Ver Brennan, et al., 2012 ⁷ para la preparación de productos químicos de ensayo).
2. Retire lector de ECIS y materiales de prueba a partir de la caja de transporte. Retirar un biochip preparado desde el 6 ° C incubadora. Coloque el biochip en una toalla de papel. Encender el lector de ECIS.
3. El uso de jeringas de 10 ml, dispensar 10 ml de agua de control en un 0,5 oz marcado frasco de plástico transparente de control y 10 ml de la muestra de ensayo en un 0,5 oz jarra de prueba clara plástica etiquetada.
   Nota: 1) Asegúrese de eliminar las burbujas para una medición precisa. 2) Las jeringas y frascos están codificados por color; azul para el control y el rojo para la prueba.
4. Retire los dos viales de medios de comunicación en polvo de las bolsas de papel de aluminio. Abre uno de los viales de comunicación en polvo (el uso de herramientas de usos múltiples, si es necesario) y verter todo el contenido de un vial en el frasco con agua de control, dejando caer todo el frasco ensolución también. Repita este procedimiento con la jarra de prueba. Tapar y agitar los frascos para asegurar que el polvo se disuelva.
5. Llenar cada uno de los colores jeringas de 10 ml con 9 ml de cualquiera de control (jeringa azul) o soluciones de respectivos viales de prueba (jeringa rojo). Eliminar las burbujas de aire de las jeringas.
6. Retire los tapones de los puertos de biochips y conectar el desagüe.
7. Coloque el biochip en la bandeja de plástico extraíble en el lector ECIS y cierre la tapa.
8. Adjuntar jeringas llenas a los puertos de biochips exteriores y conecte el émbolo de la jeringa.
9. En la pantalla principal, seleccione "SIGUIENTE" para iniciar la pre-prueba.
   Nota: El software lector comprobará impedancias. Si impedancias están dentro del rango establecido por el usuario (por lo general entre 1.000 y 3.000 ohmios) la pantalla se registrará "Cartucho Passed" como se indica en la figura 3, e instruir al usuario que seleccione "Siguiente" y el software pasará a la etapa 3.10). Si las impedancias no están dentro deel rango de ajuste debido a un biochip defectuoso o conexión defectuosa del biochip para el lector (por lo general debido a una mala alineación de los electrodos), a continuación, la pantalla se registrará "Cartucho Error" y el usuario tendrá la opción de "Cancelar" o "Verificar" la prueba.
   1. Seleccione "Cancelar" para volver al paso 3.9). Seleccione "Verificar" para continuar con el paso 3.10) después de recibir un mensaje de "Cartucho Passed" y seleccionar "Siguiente".
      Nota: Es mejor tomar el biochip y visualmente inspeccione si tiene defectos o fugas si un "cartucho falló" mensaje es recibido antes de proceder a un nuevo biochip.

Figura 3:. ECIS lector de pantalla de un biochip con lecturas de la impedancia aceptables La captura de pantalla muestra las lecturas de impedancia en ohmios iniciales de cada uno de los 4 coNTROL electrodos (CE) y 4 electrodos de muestras de ensayo (SE) dentro del biochip de fluidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

10. Cuando se le solicite por el lector, introducir información de la muestra usando un teclado en pantalla y luego seleccione "Aceptar" cuando haya terminado.
    Nota: El software lector de ECIS sellará automáticamente cada conjunto de datos con la fecha, hora y otra información introducida por el usuario; tales como el número biochip, y el tipo de producto químico y la concentración. Dos minutos de datos de impedancia se recoge del biochip insertado y un temporizador en la pantalla de cuenta regresiva del tiempo.
11. Después de dos minutos cuando se lo solicite instrucciones que aparecen en pantalla que parpadean dentro de un cuadro rojo, pulsar "NEXT". Cuando se le pregunte por una caja verde parpadeante "inyectar muestras ahora", inyectar el control y los medios de prueba desde las jeringas unidas simultáneamente en el biochip channels. Deje las jeringas en su lugar en los biochips cuando haya terminado.
    Nota: Los valores de impedancia serán recogidos una vez por minuto durante 60 minutos. Si el software lector de ECIS determina que el canal de tratamiento es estadísticamente diferente del canal de control en cualquier punto entre 10 y 60 minutos después del comienzo de la prueba, a continuación, la visualización en pantalla indicará que la muestra está "contaminado". Si el tratamiento no es diferente de la del canal de control, a continuación, la pantalla indicará "no hay contaminación detectado" al final de la prueba de funcionamiento.
12. resultados de las pruebas de récords como contaminada o no contaminados para cada muestra.
13. Al final de la prueba de funcionamiento, retirar y desechar el biochip. Enjuague y seque al aire las jeringas, viales de ensayo y bandeja de plástico extraíble que albergaba el biochip durante las pruebas.
    Nota: El lector de ECIS tiene 4 GB de almacenamiento a bordo para el software operativo, los modelos de control y los archivos de prueba generados a partir de la ejecución de un ensayo. Esto permite varios THousand archivos de prueba para ser almacenados en el lector. Los archivos pueden ser recuperados con una unidad de salto USB y transferir a un ordenador para su posterior análisis con fines de investigación, si se desea.

Resultados

La tecnología ECIS se describe en el presente documento se sometió a pruebas en la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) patrocinada Testing Programa de Tecnología y Evaluación (TTEP). Se seleccionaron trece productos químicos para probar como representantes de un amplio espectro de compuestos industriales tóxicos que podrían ser posibles contaminantes del agua potable. Durante las pruebas, 9 de los 13 fueron detectados por ECIS dentro de una hora a concentraciones que son relevantes para la salud humana ^8. La Tabla 1 muestra los resultados de este ensayo contaminante. La figura 4 es representativo de lo que es un "contaminado" resultado será similar en la pantalla lector de ECIS. En su mayor parte, las impedancias celulares disminuyeron para las muestras contaminadas, en comparación con los controles. En ocasiones, ciertos compuestos pueden causar un aumento en la impedancia.

También se resumen en la Tabla 1 Figura 5) para una captura de pantalla representativa de "No hay contaminación detectado".

Figura 4: ECIS lector de pantalla de un "contaminado" Muestra de agua Un ejemplo de gráficos normalizados de impedancia y los resultados de una muestra de agua que estaba contaminada.. Las líneas azules representan impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de control; líneas rojas representan las impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de la muestra de prueba. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: ECIS lector de pantalla de un "no hay contaminación detectado" Muestra de agua Un ejemplo de gráficos normalizados de impedancia y los resultados de una muestra de agua que no estaba contaminada.. Las líneas azules representan impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de control; líneas rojas representan las impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de la muestra de prueba. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Categoría	contaminante	Concentración ensayada (mg / L) 1			Detectado ≤1 hora n = 4/4 virutas
Los pesticidas	aldicarb	0.17			no
	Arsen ic (arsenito de sodio)	4.5			sí
	Azida (azida de sodio)	46.7			sí
	fenamifos	0.56			no
	metamidofos	1.4			no
	El metil paratión	33.6			sí
	Paraquat (dicloruro de)	4.6			no
	Pentaclorofenato (sodio)	71.9			sí
Productos químicos industriales	Amoníaco	924			sí
	Copper (sulfato de cobre II)	103			sí
	El cianuro (sodio)	sí
	Mercurio (cloruro)	24.7			sí
	tolueno	444			sí
El agua limpia 2	ninguna	N / A			no
1 concentraciones ensayadas son los mismos que en el manuscrito por Widder, et al. (2014).
2 40 muestras de agua limpia se llevaron a cabo sin contaminación.

3 "> 14

Tabla 1: Los contaminantes en muestras de agua detectado por ECIS.

Discusión

La tecnología ECIS tuvo un buen desempeño en un entorno de laboratorio y fue capaz de detectar posibles contaminantes del agua en concentraciones que son relevantes para la salud humana. La portabilidad y el embalaje de la tecnología hace que sea propicio para el uso en el campo.

Los pasos críticos en el protocolo para el éxito de la tecnología son los siguientes: 1) Mantener condiciones asépticas durante el cultivo, la siembra, y la alimentación de los biochips, 2) Mantener los biochips sembradas en condiciones refrigeradas hasta que esté listo para la prueba ya que las células RTgill-W1 no sobrevivir mucho tiempo una vez que se someten a temperaturas por encima de 25 ° C, 3) pesar con precisión la L-15ex en los viales de los medios en polvo y medir con precisión las muestras de agua para evitar la producción de falsos positivos, que pueden ser causados ​​por un cambio en la osmolalidad de los medios de comunicación en lugar de la toxicidad de la muestra, 4) Siga las instrucciones del usuario en la pantalla ECIS para ejecutar las pruebas. El software en el lector alertará al usuario si un biochip es inaceptable para las pruebas (en base a las lecturas iniciales de impedancia) cuando el biochip se inserta primero en el lector. Si los niveles de impedancia son inaceptables para la prueba, el software no permitirá que el usuario para proceder con la prueba hasta que se utiliza un nuevo biochip. Las razones para las lecturas de impedancia inaceptables son por lo general debido a una ligera falta de alineación de los electrodos biochip con los pasadores lector ECIS o fugas de fluido a lo largo de uno de los bordes de encolado del biochip.

Hay algunos límites a esta tecnología debido a que el sensor de ECIS sólo se ha probado con agua potable y no con las aguas superficiales. Las células RTgill-W1 que se encuentran en el biochip no pueden tolerar la congelación o las temperaturas muy por encima de 25 ° C durante períodos prolongados de tiempo (período de tiempo puede ser de horas o días dependiendo de la temperatura. Los biochips funcionan mejor en un rango de temperatura de refrigeración de ⁷ temperatura ambiente. Ellos están listos para su uso inmediato, sin embargo, justo después de haber sido removed de una cámara frigorífica. contenedores portátiles de almacenamiento en frío son utilizados actualmente por personal del Ejército en el campo de los suministros sensibles a la temperatura. Estos mismos contenedores se pueden utilizar para el transporte biochip cabeza de serie.

Otro límite para esta tecnología es que a pesar de que es un sensor de toxicidad de banda ancha, no responden bien, en todo caso, a los compuestos inhibidores de la colinesterasa, tales como algunos pesticidas. Para llenar este vacío capacidad, el sensor ECIS está diseñado para ser utilizado conjuntamente con un ensayo de prueba rápida de pesticidas disponibles en el comercio cuando el análisis de muestras de agua con el fin de proporcionar al usuario una gama más amplia de pruebas de toxicidad. El kit es un ensayo enzimático rápido diseñado para detectar pesticidas organofosforados y carbamatos dentro de 30 min.

El sensor de ECIS complementa el wqas-PM (Sistema de Análisis de la Calidad del Agua - Medicina Preventiva) Sistema de prueba de agua en el campo, utilizado actualmente por personal de medicina preventiva para detectar militares, Arsenic, plomo, o cianuro en una muestra de agua potable. Aunque el sensor ECIS no va a identificar lo que es el contaminante, se indicará si ciertos metales o compuestos orgánicos están presentes, lo que indica que el agua puede no ser adecuado para el consumo humano. Los resultados de la prueba ECIS están disponibles dentro de una hora. Las muestras de agua a continuación, pueden ser enviados para su posterior análisis para la identificación del contaminante, si se obtiene un resultado positivo de la prueba.

Como se describió anteriormente, el lector ECIS está diseñado para ser parte de un sistema que incluye un kit de ACE enzimática separado con el fin de cubrir un amplio espectro de detección de contaminantes. Ambos de estos lectores están siendo empaquetados en una caja resistente para transporte de campo para uso en campo por los soldados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suero fetal bovino	Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com	16000-085	Store @ -20 °C. Descongele @ temperatura ambiente antes de usar. Ingrediente para medios completos de cultivo celular L-15 (10%).
Fibronectina, plasma bovino	EMD Millipore Corp.    www.emdmillipore.com	341631-1 mg	Almacenar @ -20 °C. Descongelar @ temperatura ambiente antes de usar. Mezcle con medios L-15 para una concentración de 10 μ g/ml y congelar @ -20 ° C en alícuotas. Uso como sustrato para biochips.
Medios L-15 sin L-glutamina	Lonza  www.lonzabioscience.com	12-700F	Medios basales para cultivo celular y alimentación de biochips. Almacenar a 6 °C.
L-15ex medios en polvo con rojo fenol	US Biological              www.usbio.net	L1501	se pesan en alícuotas de 60 mg en viales de 0,1 dram y se almacenan a 6 & grados; C en bolsas de aluminio con paquetes desecantes. Vida útil de nueve meses. Mezclado con 10 ml de muestra de agua para pruebas en biochips.
PBS, sin Ca2+ o Mg2+	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-516F	Almacene a temperatura ambiente. Se utiliza para enjuagar medios cuando se tripsinizan matraces de cultivo celular.
Tripsina, EDTA	Lonza  www.lonzabioscience.com	CC-5012	Almacene @ -20 °C. Descongele a temperatura ambiente y úselo para tripsinizar matraces de cultivo celular.
Matraces de cultivo T175	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-30	Se utiliza para el cultivo de células RTgill-W1.
Lejía	Chlorox		Diluido al 20% con millique o agua destilada para la limpieza de chips ECIS. Cualquier lejía doméstica es aceptable.
Alcohol etílico			Para desinfectar las superficies de la biocampana y cualquier material que se coloque en la biocapucha.
Celdas branquiales de trucha arco iris (RTgill-W1)	Colección de Cultivo de Tejidos de Tipo Americano                      www.atcc.org	CRL-2523	Células cultivadas y utilizadas para biosensores (biochips de siembra).
Suplemento GlutaMAX-1, 200 mM	Lonza  www.lonzabioscience.com	35050-061	Conservar a temperatura ambiente. Ingrediente para medios completos de cultivo celular L-15 (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10K	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-602E	Store @ -20 °C. Descongele @ temperatura ambiente antes de usar. Ingrediente para medios completos de cultivo celular L-15 (1%).
Tubería BPT de piscifactoría	U.S. Plastic Corp.          www.usplastic.com	57317	Corte en tramos de 27 mm y esterilizado en autoclave. Se utiliza para sembrar biochips con células y como un circuito cerrado entre cambios de medios.
Accesorios luer de policarbonato para conjuntos de tubos de Pharmed	Value Plastics	MTLS210-9	Asegurado a cada extremo de la tubería de piscifactoría cortada para su inserción en bichips.
Jeringas de 20 ml, punta deslizante	VWR Scientific          us.vwr.com	BD302831	Se utiliza para la inyección de suspensión celular para la siembra de chips ECIS, así como para la alimentación de chips.
Microviales de polipropileno con tapa a presión de 0.1 dram	Botellas, frascos y tubos, Inc.    www.bottlesjarsandtubes.com	30600	Se utiliza para almacenar alícuotas de 60 mg de medios en polvo L-15ex.
Biochips ECIS fluidos Lexan de 60 milésimas de pulgada	Nanohmics, Inc.		Hecho a medida por Nanohmics, Inc. Las células RTgill-W1 se inyectarán en los biochips y los chips sembrados se colocarán en el lector ECIS para su prueba.
Caja de instrumentos de plástico esterilizable en autoclave 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"	Medi-Dose EPS        medidose.com	IB701	Se utiliza para almacenar lo siguiente: tapones esterilizados en autoclave, biochips que se han limpiado, biochips con semillas.
Bolsas de esterilización de papel termoselladas, 7 y frac12; ” x 13"	CardinalHealth              www.cardinalhealth.com	90713	Se utiliza para el autoclave de tubos, accesorios y tapones.
Dosificador de polvo automatizado Quantos	Mettler Toledo            www.mt.com	QB5	Dispensación automatizada de 60 mg de alícuotas de L-15ex en polvo en viales de 0,1 dram.
Lector ECIS	Nanohmics, Inc.		Hecho a medida por Nanohmics, Inc. El biochip sembrado se inserta en el lector para realizar pruebas de toxicidad del agua.
3 x 5 bolsas resellables de polipropileno metalizado de 2,5 milésimas de pulgada	Uline                                www.uline.com	S-16893	Embalaje y almacenamiento tanto para biochips sembrados como para viales de medios L-15ex en polvo.
Leatherman squirt ps4	Amazon		Se utiliza para abrir viales de medios en polvo.
1 g de paquetes de desecante de gel de sílice	Uline                                www.uline.com	S-3902	Coloque en bolsas de polipropileno con viales de medios en polvo L-15ex para evitar que el polvo acumule humedad.
Frascos estériles de 250 o 500 ml de Nalgene	Fisher Scientific www.fishersci.com	09-740-25C o E	Suspensiones celulares Hold para la siembra de chips ECIS en biohood.
Tapones para biochips	Nanohmics, Inc.		Hecho a medida por Nanohmics, Inc. Se utiliza para sellar puertos en biochips antes de almacenarlos a 6 °C.
Desagües para biochips ECIS	Nanohmics, Inc.		Hecho a medida por Nanohmics, Inc. Colocado en 2 puertos internos en biochips antes de la inserción en el lector ECIS. Permite que el exceso de medios drene de los canales durante las inyecciones de prueba.
Hemocitómetro	Fisher Scientific www.fishersci.com	S17040	Necesario para contar células antes de ajustar la suspensión celular para su inyección en biochips.
Microscopio de campo claro con objetivo 10X	Leitz Labovert		Cualquier microscopio de campo claro es aceptable.
		seguridad biológica de clase II	Cualquier cabina de seguridad biológica de clase II en la que se pueda realizar el cultivo celular en condiciones estériles es aceptable.
Tubos de microcentrífuga, 0,6 ml	Fisher Scientific www.fishersci.com	02-681-311	Contiene 1 ml de suspensión celular antes del recuento de células.
Jeringas rojas deslizantes de 10 cc	Productos de procedimiento, Inc.            www.procedureproducts.com	S/49S 30-R	Extrae 9 ml de muestra de agua de prueba y se utiliza para inyectar la muestra en el biochip.
Jeringas azules deslizantes de 10 cc	Procedure Products, Inc.            www.procedureproducts.com	S/49S 30-B	Extrae 9 ml de muestra de agua de control y se utiliza para inyectar la muestra en el biochip.
½ oz. frasco transparente de plástico PET con tapas blancas forradas acanaladas Botella	SKS & Embalaje, Inc.              www.sks-bottle.com	0605-30	Viales de muestra utilizados para mezclar L-15ex polvo y 10 ml de muestra de agua para análisis.
Tubos de centrífuga de polipropileno cónico estéril de 50 ml	Fisher Scientific        www.fishersci.com	12-565-269	Se utiliza para contener 40 ml de alícuotas de 10 μ g/ml de fibronectina a -20 °C.
Prueba de detección de inhibidores de acetilcolinesterasa NIDS ACE	ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com	Sensor ACE-400	diseñado para la detección rápida de pesticidas en el agua potable