Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

Resumen

Los cilios primarios influyen en varias vías de señalización. La cóclea de mamíferos es ideal para examinar la señalización de la polaridad de las células planas (PCP). La disfunción de los cilios afecta el crecimiento coclear, el patrón celular y la orientación de las células ciliadas, lecturas de PCP. Nuestro objetivo es analizar la señalización de PCP en la cóclea de ratón mediante análisis fenotípico, inmunohistoquímica y microscopía electrónica de barrido.

Resumen

En los últimos años, los cilios primarios han emergido como reguladores clave en el desarrollo y la enfermedad al influir en numerosas vías de señalización. Una de las primeras vías de señalización que se ha demostrado que está asociada con la función ciliar fue la vía de señalización Wnt no canónica, también conocida como señalización de polaridad de células planas (PCP). Uno de los mejores lugares para estudiar los efectos de la señalización de la polaridad de las células planas (PCP) durante el desarrollo de los vertebrados es la cóclea de los mamíferos. La interrupción de la señalización de PCP en la cóclea del ratón interrumpe el crecimiento coclear, el patrón celular y la orientación de las células ciliadas, todos los cuales se ven afectados por la disfunción de los cilios. El objetivo de este protocolo es describir el análisis de la señalización de PCP en la cóclea de mamíferos en desarrollo mediante análisis fenotípico, inmunohistoquímica y microscopía electrónica de barrido. Los defectos en la convergencia y la extensión se manifiestan como un acortamiento del conducto coclear y/o cambios en el patrón celular, que se pueden cuantificar después de la disección de mutantes de ratón en desarrollo. Los cambios en la orientación del haz estereociliar y la longitud o posición de los cinecilios se pueden observar y cuantificar mediante inmunofluorescencia o microscopía electrónica de barrido (SEM). Una comprensión más profunda del papel de las proteínas ciliares en las vías de señalización celular y otros fenómenos biológicos es crucial para nuestra comprensión de la biología celular y del desarrollo, así como para el desarrollo de estrategias de tratamiento dirigidas.

Introducción

cilios primarios son apéndices largos basados ​​en microtúbulos que se extienden desde la superficie de la mayoría de células de mamífero. cilios primarios se confunde a menudo con cilios móviles, de los cuales siempre hay múltiples por célula, y cuya finalidad es mover fluido a través de superficies de la membrana. cilios primarios, por el contrario, adoptar funciones sensoriales y son por consiguiente también se hace referencia como cilios sensorial. Una vez en el olvido, este orgánulo ha sido recientemente 'redescubierto' como resultado de su asociación con una multitud de enfermedades genéticas humanas ^1. Idealmente posicionado como un orgánulo....

Protocolo

Uso y la eutanasia a todos los animales de conformidad con las directrices y normas institucionales y gubernamentales, más comúnmente a través de _inhalación de CO2 y dislocación cervical.

1. Preparación de los reactivos

NOTA: Antes de comenzar, prepare todos los reactivos que utilizan productos químicos de grado analítico. Hacer que las soluciones de grado molecular utilizando agua destilada y desionizada a menos que se especifique lo contrario.

1. Salina tamponada con fosfato (PBS 1x): Hacer 1 L de 1x PBS disolviendo 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO ₄ y 0,24 g KH ₂ PO ₄ en 1 L de H....

Resultados

La disección y la cóclea Preparación del tejido

Después de la eliminación del cerebro, puesto línea media disección sagital de una cabeza P0 ratón, el laberinto óseo, visto desde atrás, puede ser visualizado (Figura 1A, flecha blanca) y se retira. La Figura 1B muestra los laberintos óseas aisladas con el cabello coclear mirando hacia arriba, ventral, (izquierda) y por detrás, .......

Discusión

Cuando se prepara el tejido coclear para el análisis, hay algunos puntos clave a tener en cuenta. En primer lugar, las diferencias en el fondo genético puede modificar el fenotipo coclear, por lo que es necesario analizar y comparar sólo los controles de la misma camada. En segundo lugar, se requiere la eliminación completa de la membrana tectorial para obtener las mejores imágenes con inmunohistoquímica y es esencial para SEM. La membrana tectorial es una estructura opaca y puede oscurecer las células del epitelio sens.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Herramientas/Equipos
Elastómero de silicona - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	Ver nota 2
Micro tijeras de disección-hoja recta	Varios
Pinzas finas (n.º 5 y 55) y pinzas romas	Varios
Microscopio de disección.	Varios
portaobjetos de microscopio de vidrio sin recubrimiento	Varios
deslizamientos de cubierta de microscopio (22 mm y veces; 40 mm y veces; 0,15 mm)	Varios
pipetas de transferencia	Varios
pines de Minutien	Fine Science Tools	26002-10
Portamuestras SEM	tousimis	8762
Microscopía electrónica de barrido tacos	TED PELLA	16111
PELCO Pestañas: Adhesivo de carbono	TED PELLA	16084-3
Microscopio fluorescente	Varios
Secador de puntos críticos	Varios
Microscopio electrónico de barrido	Varios
portaobjetos de microscopio de vidrio	Varios
cubreobjetos de vidrio	Varios
pañuelos Kimwipe	Varios
reactivos
de pincel
1 y veces; Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco/Life Technologies	10010023
Paraformaldehído  (PFA) (Grado EM requerido para EM)	Varios		Prepare una solución al 4% en 1 y veces; PBS hecho fresco cada vez. Grado EM requerido para EM.
2.5% Glutaraldehído Grado1	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl (pH 7.5)	Varios
NaCl	Varios
CaCl 2	Varios
Triton X-100	Varios
Suero de cabra normal	Varios
AffiniPure Fab Fragment Burro Anti-Ratón IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G Medios de montaje	SouthernBiotech	0100-01
10× Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS)	Gibco/Life Technologies	14065
Hepes	Gibco/Life Technologies	15630-080
Tetróxido de osmio (OsO4 )	Sigma-Aldrich/Fluka Analytical	75632
Ácido tánico	Sigma-Aldrich	403040
Etanol 200 a prueba	Varios
anticuerpos
anti Arl13b	Protein Tech	17711-1-AP	Concentración sugerida 1:1.000
anti tubulina acetilada (611-B1)	Sigma-Aldrich	T6793	Concentración sugerida 1:800
anti gamma tubulina (GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557	Concentración sugerida 1:200
anti Zo_1	Invitrogen	40-2300	Concentración sugerida 1:500
Miosina VI	Proteus Biosciences	25-6791	Concentración sugerida 1:1000
Miosina VIIa	Proteus Biosciences	25-6790	Concentración sugerida 1:1.000
anti Vangl2	Merk Millipore	ABN373	Concentración sugerida 1:250
anti G&alfa; i3	Sigma-Aldrich	G4040	Concentración sugerida 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Concentración sugerida 1:300 - 1.000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Concentración sugerida 1:300 - 1.000