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Artículo de método

Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

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DOI:

10.3791/53559

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21 de febrero de 2016

1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

En este artículo

Resumen

Los cilios primarios influyen en varias vías de señalización. La cóclea de mamíferos es ideal para examinar la señalización de la polaridad de las células planas (PCP). La disfunción de los cilios afecta el crecimiento coclear, el patrón celular y la orientación de las células ciliadas, lecturas de PCP. Nuestro objetivo es analizar la señalización de PCP en la cóclea de ratón mediante análisis fenotípico, inmunohistoquímica y microscopía electrónica de barrido.

Resumen

En los últimos años, los cilios primarios han emergido como reguladores clave en el desarrollo y la enfermedad al influir en numerosas vías de señalización. Una de las primeras vías de señalización que se ha demostrado que está asociada con la función ciliar fue la vía de señalización Wnt no canónica, también conocida como señalización de polaridad de células planas (PCP). Uno de los mejores lugares para estudiar los efectos de la señalización de la polaridad de las células planas (PCP) durante el desarrollo de los vertebrados es la cóclea de los mamíferos. La interrupción de la señalización de PCP en la cóclea del ratón interrumpe el crecimiento coclear, el patrón celular y la orientación de las células ciliadas, todos los cuales se ven afectados por la disfunción de los cilios. El objetivo de este protocolo es describir el análisis de la señalización de PCP en la cóclea de mamíferos en desarrollo mediante análisis fenotípico, inmunohistoquímica y microscopía electrónica de barrido. Los defectos en la convergencia y la extensión se manifiestan como un acortamiento del conducto coclear y/o cambios en el patrón celular, que se pueden cuantificar después de la disección de mutantes de ratón en desarrollo. Los cambios en la orientación del haz estereociliar y la longitud o posición de los cinecilios se pueden observar y cuantificar mediante inmunofluorescencia o microscopía electrónica de barrido (SEM). Una comprensión más profunda del papel de las proteínas ciliares en las vías de señalización celular y otros fenómenos biológicos es crucial para nuestra comprensión de la biología celular y del desarrollo, así como para el desarrollo de estrategias de tratamiento dirigidas.

Introducción

cilios primarios son apéndices largos basados ​​en microtúbulos que se extienden desde la superficie de la mayoría de células de mamífero. cilios primarios se confunde a menudo con cilios móviles, de los cuales siempre hay múltiples por célula, y cuya finalidad es mover fluido a través de superficies de la membrana. cilios primarios, por el contrario, adoptar funciones sensoriales y son por consiguiente también se hace referencia como cilios sensorial. Una vez en el olvido, este orgánulo ha sido recientemente 'redescubierto' como resultado de su asociación con una multitud de enfermedades genéticas humanas 1. Idealmente posicionado como un orgánulo de señalización, el cilio primaria se ha demostrado que regulan numerosas rutas de señalización, muchas de las cuales son importantes no sólo en la homeostasis del tejido y la enfermedad, sino también durante el desarrollo 2.

Una de las primeras vías de señalización demostrado estar asociadas con la disfunción cilios fue la vía de señalización Wnt no canónica, conocido también como vía de la polaridad celular plana (PCP) > 3. Esta cascada de señalización inicialmente identificado en Drosophila, es fundamental para la embriogénesis; en particular para los procesos de convergencia y de extensión y para la orientación correcta de las células en el plano de los epitelios 4. La señalización secuencial de un conjunto básico de proteínas reguladoras traduce las señales direccionales que en última instancia conducen a reordenamientos del citoesqueleto y dan como resultado la polarización coordinada de las células epiteliales en un plano 5. El proceso de convergencia y la extensión es absolutamente necesario para el conducto coclear para alargar y para el correcto patrón celular 6. Como esto se regula a través de la activación de la vía de PCP, uno de los fenotipos más llamativos de mutantes PCP cóclea es un conducto coclear acortado con epitelios sensoriales desorganizado 7. Del mismo modo, los mutantes de ratón, que carecen de cilios, también presentan una convergencia y la extensión fenotipo tan 8,9, aunque precisamente cómo esto está regulado aún no se ha dilucidado.

ve_content "> Debido a que los procesos de convergencia y de extensión son críticos para la derivación del conducto coclear, y el patrón celular de los epitelios sensoriales dentro del conducto coclear, la cóclea en desarrollo es un órgano ideal en el que para examinar la señalización de PCP durante el desarrollo de los vertebrados. El órgano de Corti, el término dado al epitelio sensorial especializado que recubre el conducto coclear, está compuesto por células de soporte no sensoriales y las células ciliadas mechanosensory que deben ser orientados de manera uniforme para la cóclea para funcionar 10. las células ciliadas mechanosensory se llama así debido a la manojos estereociliar que se extienden desde la placa cuticular (superficie apical) de cada una de las células ciliadas sensoriales 11. Estos actúan como transductores primarios de mechanosensation ya pesar de su nomenclatura como estereocilios, en realidad están compuestas por microvellosidades a base de filamentos de actina modificado. Dentro de cada pelo en forma de V haz, tres filas de estereocilios se organizan en un pa altamente ordenada y regular,ttern caso de una manera similar a la escalera. Cilios real basado en los microtúbulos, cinetocilios llamados, son necesarios para el desarrollo y orientación de los haces estereociliar 12. Sobre cada célula de pelo, una sola cinocilio está unido físicamente al haz estereocilios, centralmente situada adyacente a la fila más alta de estereocilios. La función precisa de la cinocilio no está claro, y una hipótesis es que la cinocilio 'tira' los estereocilios en forma a medida que maduran desde microvellosidades 12. En los vertebrados, cinetocilios en la cóclea solamente están presentes de forma transitoria y se retraen de las células pilosas en los ratones antes de la aparición de la audición 11,13,14.

La pérdida completa de los cilios en los resultados en desarrollo cóclea en conductos cocleares acortar gravemente, mal formado y mal orientada haces estereociliar, así como los cuerpos basales mis-posicionado 8,9. Un cilio funcional no es sólo formaba parte del axonema ciliar. Muchas proteínas asociadas con los ciliosse producen en función de los complejos localizados en subdominios cilios afines, como la basal del cuerpo, zona de transición, o axonema ciliar 15. El cuerpo básica, derivada del centríolo madre del centrosoma, es también un centro organizador de microtúbulos por los microtúbulos se extienden lejos del cilio en el cuerpo celular y puede regular el tráfico intracelular, así como el tráfico ciliar. La zona de transición ciliar es otra región donde la función ciliar se regula en función de la organización de importación y exportación de compuestos ciliares 16.

Múltiples estudios han identificado una conexión entre los cilios y Wnt no canónica (de señalización PCP), aunque el mecanismo exacto no está claro 17. La redundancia de ciliares y PCP genes y la sensibilidad de la polaridad celular a anormalidades celulares generalizadas, hacen que sea difícil para enlazar directamente a una mutación específica déficit de PCF. Una de las salidas de lectura de la señalización de PCP es el posicionamiento del cuerpo basal y primarcilio y, por lo tanto, la segregación de la primaria de los defectos secundarios es un reto. Algunos estudios en el pez cebra y el ratón mutantes han sugerido ninguna conexión entre cilios y la señalización Wnt 18-20. Las discrepancias en los datos siempre son representativas de las especies, tejidos, o las diferencias temporales que dependen de las contribuciones ciliares hacia la señalización de Wnt. Además, la capacidad de respuesta normal de Wnt podría ser retenida si cuerpos basales siguen siendo funcionales. Una comprensión más profunda de la función de las proteínas ciliares en vías de señalización celular y otros fenómenos biológicos es crucial para nuestra comprensión de la biología celular y del desarrollo, así como para el desarrollo de estrategias de tratamiento dirigidas.

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Protocolo

Uso y la eutanasia a todos los animales de conformidad con las directrices y normas institucionales y gubernamentales, más comúnmente a través de inhalación de CO2 y dislocación cervical.

1. Preparación de los reactivos

NOTA: Antes de comenzar, prepare todos los reactivos que utilizan productos químicos de grado analítico. Hacer que las soluciones de grado molecular utilizando agua destilada y desionizada a menos que se especifique lo contrario.

  1. Salina tamponada con fosfato (PBS 1x): Hacer 1 L de 1x PBS disolviendo 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 y 0,24 g KH 2 PO 4 en 1 L de H 2 O. Ajustar el pH a 7,4 con HCl. PBS no tiene que ser estéril y puede ser almacenado a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que este tampón se realiza sin CaCl 2 o MgCl 2.
  2. Paraformaldehído (PFA al 4%): Se prepara una solución al 4% de PFA en PBS 1x en una campana ventilada. Añadir 40 g de polvo de paraformaldehído a 1 l de 1x PBS. Para disolver, mezclar y calentar a aproximadamente 60 ° C,y se añade lentamente gota a gota NaOH para elevar el pH. Una vez que el polvo se haya disuelto, vuelva a ajustar el pH a 7,4 con HCl. Filtrar a través de un filtro de 0,45 M y congelar alícuotas. Descongelar una alícuota para cada experimento.
  3. tampón Triton: Preparar un M Tris-HCl 0,1 (pH 7,5), NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 solución disolviendo 8,77 g de NaCl en 1 l de 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Añadir 1 ml de Triton X-100. Agitar para disolver. Tienda tampón Triton a TA.
  4. bloque Triton: Preparar 10% de suero de cabra en tampón Triton mediante la adición de 1 ml de suero de cabra a 9 ml de tampón de Triton. Almacenar a 4 ° C. Si el uso de anticuerpos primarios planteadas en ratón, de cabra añadir fragmentos de anti-IgG de ratón Fab a una dilución de 1 en 200 al bloque de Triton para la etapa de bloqueo.
    NOTA: Si planea utilizar las muestras para microscopía electrónica de barrido (SEM), preparar reactivos adicionales que se enumeran a continuación.
  5. Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) con calcio y magnesio: obtener una solución 1X de HBSS por dilución de una solución madreen agua destilada estéril H 2 O. Como tampón HBSS es complicado de hacer y hay riesgos involucrados, es recomendable pedir una solución 10x preparado de antemano. La concentración final de HBBS tampón usado habitualmente es el siguiente: 1,26 mM CaCl 2, 0,49 mM MgCl2 -6H2O, 0,41 mM MgSO4 -7H2O, KCl 5,33 mM, KH 0,44 mM 2 PO 4, 4,17 mM NaHCO3, NaCl 137.93 mM , 0,34 mM Na 2 HPO 4, dextrosa 5,56 mM.
  6. tampón Hepes: Preparar una solución 0,1 M en HEPES 1x HBSS, disolviendo 23,8 g de HEPES en 1 l de tampón 1x HBSS.
  7. Scanning fijador microscopía electrónica (SEM Fix): Preparar fijador para SEM diluyendo electrones glutaraldehído grado microscopía (2,5%) y paraformaldehído (4%) en tampón Hepes. Añadir CaCl 2 a una concentración final de 10 mM.
  8. 1% de tetróxido de osmio (OsO4) en tampón Hepes; 1% de tetróxido de osmio en agua: Se diluye una solución madre de tetróxido de osmio en tampón Hepes, y separately en estéril destilada H 2 O, a una concentración final de 1%. El tetróxido de osmio es muy tóxico y se vende más comúnmente como una solución de 4%.
  9. 1% (w / v) de ácido tánico: Disolver 0,5 g de ácido tánico en 50 ml H destilada estéril 2 O. Filtro de esterilizar por filtración a través de un filtro de tamaño de poro 0,45.
  10. Serie calificada solución de etanol: Diluir etanol 200 proof con H 2 O destilada estéril para hacer soluciones 30, 50, 70, 90 y 95% de etanol. Para los enjuagues finales de etanol, se requiere el 100% de etanol prueba 200. Utilice una botella recién abierta de etanol de prueba 200 para los enjuagues finales.

2. Elección de Tejido

  1. Lo ideal es examinar los embriones o los cachorros jóvenes entre las edades de día embrionario 16.5 (E16.5) y después del día 3 (P3).
    NOTA: La osificación del laberinto óseo y el hueso temporal hace la disección progresivamente más difícil ya que los ratones maduros. También cinetocilios, la única verdadera cilio basadas en microtúbulos encuentran en las células ciliadas de la cóclea,retrae durante el desarrollo y ya no está presente en ratones adultos.
  2. Después de la fijación, descalcificación cochleae adulto. Lugar disecados (véase la sección 3) laberintos óseas, en 2 ml de EDTA (4,13% en PBS), pH 7,3, en un tubo de microcentrífuga durante 3 - 4 días con rotación. EDTA reponer todos los días. Después de que los tejidos se han suavizado, enjuague en 1,5 ml de PBS o más 3 veces durante 5 minutos en un nutator con aumento de la agitación.

3. La disección cóclea

  1. Eutanasia mediante dislocación cervical posterior o inhalación de CO2 (100% CO2), quitar la cabeza. Utilice una hoja de bisturí o pequeño par de tijeras, dependiendo del tamaño del animal, para diseccionar la cabeza a lo largo de la línea media sagital a partir de la nariz y que se extiende en sentido caudal. Retire el cerebro de cada mitad del cráneo con un par de pinzas. Identificar los huesos temporales, que contienen los laberintos en desarrollo óseas del oído interno (véase la flecha en la figura 1A).
  2. Use un par de deceps para aislar cuidadosamente los laberintos óseas del cráneo (huesos temporales). Hacer esto bajo un microscopio de disección. Prise el tejido óseo del cráneo mediante la ejecución de las pinzas suavemente por debajo de los laberintos óseas. En los animales hasta P4 los laberintos óseas son todavía cartilaginoso y se puede quitar fácilmente sin romperse.
  3. Después de la disección, utilice la punta de las pinzas de disección para despejar el óvalo y ventanas redondas y hacer un pequeño agujero en el vértice de la espiral coclear. Fijar los laberintos óseas antes de una nueva disección del conducto coclear. Para permitir la fácil extracción de la membrana tectorial (véase 3.7), fijar los laberintos óseas en 1,5 ml 4% PFA durante 5 min en hielo.
    NOTA: Si no se requiere la eliminación de la membrana tectoria, se recomienda la fijación más largo (ver 4.1 hasta 4.3). Breve fijación de los huesos temporales antes de la disección del conducto coclear ayuda al proceso de disección y retirada de la membrana tectorial. la disección posterior y la exposición del órgano de Corti, FurtSe requiere su fijación.
  4. diseccionar los laberintos óseas para exponer el epitelio sensorial coclear de la siguiente manera. Coloque los laberintos óseas en un plato de disección elastómero de silicona recubierto de negro que contiene PBS para facilitar la disección. Utilice pasadores minutien para inmovilizar el tejido, si es necesario. Para utilizar pasadores minutien, colocarlos a través de la porción vestibular de los laberintos óseas con la cara ventral de la espiral coclear hacia arriba.
    NOTA: silicón Negro plato de elastómero: Mezcla de silicona componente de base de elastómero con carbón en polvo para obtener un color negro opaco. Añadir el agente de curado y se vierte en una o más placas de Petri (de vidrio o plástico). Seca al vacío para eliminar las burbujas de aire atrapadas. los platos se sequen por completo antes de su uso.
  5. Utilice unas pinzas finas (# 5) para extraer el cartílago exterior exponer el conducto coclear. Comience en la ventana oval; inserte la punta inferior de la pinza en la ventana oval y suavemente forzar la apertura del cartílago, que se mueve lentamente hacia arriba, hacia laápex.
  6. Después de la exposición del conducto coclear, retire la superficie ventral, la membrana de la Reissner. Use un buen par de pinzas para pellizcar la membrana de la Reissner en la base del conducto coclear y despegarlo en un movimiento ascendente. Visualizar el aspecto dorsal del conducto coclear, incluyendo el epitelio sensorial.
  7. Retire la membrana tectoria como se describe a continuación (opcional). Para SEM o inmunohistoquímica de la cinocilio o haces estereociliar retirar la membrana tectoria.
  8. Utilice un muy buen par de pinzas (# 55 o más fino) para apretar la membrana tectoria en la base de la cóclea y la cáscara hacia arriba, hacia el ápice.
    NOTA: La membrana tectoria es ópticamente transparente que hace que sea difícil de identificar. Más a menudo que no la membrana se retira en una sola pieza y, aunque no se visualiza fácilmente, uno puede sentir la resistencia, ya que se retira del órgano expuesto de Corti.
  9. Después de exponer el órgano de Corti, fijar aún más el tejido como described continuación. Conservar la región vestibular para ayudar a las operaciones de preparación de los tejidos.

4. Fijación

  1. Por inmunohistoquímica regular de fijar los laberintos óseas disecados en 1,5 ml de PFA al 4% a 4 ° C en un nutator durante 2 horas.
    NOTA: Debido a la sensibilidad de los diferentes anticuerpos y antígenos, las variaciones en la longitud y la composición de la fijación puede ser necesaria y debe ser optimizado para cada anticuerpo.
  2. Después de la fijación, lavar las muestras de un enjuague en 1,5 ml o más PBS 3 veces durante 5 min en un nutator con aumento de la agitación. Las muestras se pueden almacenar en PBS a 4 ° C durante varias semanas antes de procesar.
  3. Si la preparación de muestras para SEM, FIX diseccionado huesos temporales en solución SEM (véase 1.7) durante 2 horas a temperatura ambiente. Lavar mediante lavado en 1,5 ml de tampón Hepes o más 3 veces durante 5 minutos en un nutator con aumento de la agitación. Tienda en tampón Hepes a 4 ° C hasta su posterior procesamiento. El almacenamiento por más de un par de semanass no es recomendable.

5. La inmunohistoquímica

  1. Realizar inmunohistoquímica en muestras disecadas en un pocillo de una placa de pocillos de fondo plano 96. Como alternativa, utilice una PCR o tubo de microcentrífuga. Es aconsejable para retener la porción vestibular del laberinto óseo para facilitar el procesamiento.
  2. Permeabilizar el tejido por incubación en 1,5 ml de tampón Triton durante 1 hora a RT en una nutator con agitación suave.
  3. Bloquear el tejido por incubación en 0,5 ml bloque Triton durante un mínimo de 1 hora a RT. Si el uso de anticuerpos primarios planteados en ratón, añadir fragmentos de IgG anti-ratón Fab al bloque a una dilución de 1 en 200 (ver sección 1.4). Esto disminuye en gran medida la unión no específica de IgG anti-ratón de tejido de ratón.
  4. Se incuba el tejido con anticuerpos primarios diluidos en Triton bloque de O / N a 4 ° C con agitación suave. dilución de anticuerpo depende de anticuerpos utilizado (ver sección 6.1). Alternativamente incubar antibodie primarias durante 2 horas a RT. Idealmente utilizar un volumen mínimo de dilución de anticuerpo primario ml 0.5. Si el anticuerpo es limitada, utilizar el volumen más pequeño de dilución de anticuerpo que envuelve completamente el tejido.
  5. Lavar el tejido mediante lavado en 1,5 ml de tampón Triton o más, un mínimo de 3 veces durante 15 minutos, en un nutator con aumento de la agitación.
  6. Incubar el tejido con anticuerpos secundarios conjugados con colorantes fluorescentes diluido a los fabricantes concentración recomendada (típicamente 1: 200 a 1: 1000) en el bloque Triton durante 1 hora a RT en una nutator. Utilizar un volumen mínimo de dilución de anticuerpo secundario 0,5 ml.
    1. Centrifugar el anticuerpo secundario diluido a 13.000 xg durante 3 min antes de su uso para minimizar la unión no específica de los agregados de anticuerpos secundarios. Proteger el tejido de la luz procedente de esta etapa en adelante para evitar photobleaching los tintes fluorescentes.
  7. Como en el paso 5.5, lavar el tejido de un enjuague en 1,5 ml o más tampón Triton, un mínimo de 3 veces por 15 min, en unanutator con aumento de la agitación. Almacenar las muestras en PBS a 4 ° C hasta que esté listo para montar.

6. Selección de Anticuerpos

NOTA: La fuente de anticuerpos recomendados y sus diluciones se enumeran en la Tabla de materiales y equipos específicos. Realice las incubaciones de anticuerpos tal como se describe en la sección 5.

  1. Para visualizar el cinocilio basado en microtúbulos, utilizar un ciliar axonema marcador tal como anti-Arl13b (1: 1000) o anti-acetilada-α-tubulina (1: 800). Visualizar el cuerpo basal utilizando un anticuerpo contra γ-tubulina (1: 200) o cualquier otro marcador centrosomal.
  2. Para visualizar los haces de actina estereociliar de filamento-rico, añadir faloidina (1: 300 - 1000) conjugado a uno de varios fluoróforos diferentes para la incubación de anticuerpo secundario. Faloidina también etiqueta otras estructuras de actina filamentosa incluyendo los filamentos de actina cortical que rodean la periferia de cada célula de pelo epitelial. Esto es útil para determinarel contorno de cada célula de pelo. Use un marcador de membrana alternativa como anti-Zo-1 (1: 500) si es necesario.
  3. Marcar las células ciliadas de la cóclea utilizando anticuerpos contra la miosina VI (1: 1.000) o miosina VIIa (1: 1.000). Estos pueden ser usados ​​si la evaluación de la longitud cóclea.

NOTA: Use anticuerpos conjugados de tinte-fluorescentes adecuados secundarios optimizados para los requisitos de microscopio.

7. Montaje e Imagen

  1. Colocar la muestra en un plato de elastómero de silicona negro que contenía PBS. Con unas pinzas finas, eliminar la región vestibular de la espiral coclear.
  2. Muy retirar con cuidado el cartílago subyacente y el mesénquima de la espiral coclear. La espiral coclear restante contiene el surco interno, órgano de Corti y el surco exterior.
  3. La transferencia de la espiral coclear en una gota de PBS colocado en un portaobjetos de microscopio. Si se desea, separar la espiral coclear en piezas equivalentes a una vuelta. Sin embargo, este paso no es necesario, y puede conducir a loss del tejido. El (lado estereocilios) superficie apical de las células ciliadas de la cóclea debe estar mirando hacia arriba, hacia el cubreobjetos.
  4. Mecha de distancia del PBS con un tejido absorbente o un pedazo de papel de filtro y suavemente cambiar la posición de la espiral coclear si el epitelio se ha desplazado y se superpone sobre sí misma.
  5. Añadir una gota de medio de montaje directamente sobre la muestra cóclea y colocar suavemente un cubreobjetos en la parte superior, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire. No se requieren espaciadores; colocar el cubreobjetos directamente sobre la muestra. Se recomienda A, no-fluorescente soluble en agua, medio de montaje semi-permanente que no requiere pasos adicionales para mantener el cubreobjetos en su lugar. Medio de montaje y cubreobjetos espesor debe corresponder al microscopio especificaciones.
  6. Utilice un microscopio de epifluorescencia o de escaneo láser confocal equipado con una gran ampliación (63 - 100X), alta apertura numérica (1.2 a 1.4) objetivos para capturar imágenes de la superficie apical de la célula de pelo coclear. uso loobjetivos wer (5 - 20X) para tomar imágenes de la espiral coclear superposición de cuantificar la longitud del conducto coclear. láseres de excitación y filtros de emisión de los partidos a fluoróforos utilizados para anticuerpos secundarios.

8. Microscopía Electrónica de Barrido

  1. Continuar desde la sección 4.3. Después de lavar las muestras SEM fijos en tampón Hepes, realice los siguientes pasos debajo de la ventilación. El siguiente protocolo funciona bien para tejido cóclea y evita el uso de revestimiento por bombardeo iónico con un metal conductor.
  2. Post-fix en 1% OSO 4 en tampón Hepes para 1 hr, seguido de 3 lavados con 1 ml de agua destilada durante 5 minutos cada uno. El volumen más pequeño de OsO4 que envuelve completamente el tejido debe ser utilizado para minimizar los residuos tóxicos. No se requiere ninguna agitación.
  3. Incubar las muestras a temperatura ambiente en cada uno de las siguientes soluciones durante 1 hora con 3 lavados con 1 ml de agua destilada durante 5 min cada uno en entre pasos: 1% de ácido tánico recién hecho en agua y filtered antes de su uso; 1% OsO4 en agua, ácido tánico 1% en agua, 1% OsO4 en agua.
  4. Deshidratar muestras a través de una serie de etanol de una incubación de 10 min en cada una de las siguientes diluciones: 30, 50, 70, 90, y 95%. No se requiere ninguna agitación.
  5. Transferir las muestras a través de tres cambios, 5 minutos cada uno, de etanol al 100% (a partir de una botella recién abierta etanol de 200 grados).
  6. Ejecutar las muestras mediante un secador de punto crítico siguiendo las instrucciones del fabricante.
  7. Montar las muestras usando adhesivo de carbón conductor en la parte superior de un talón de SEM antes de la formación de imágenes en un microscopio electrónico. Bajo un microscopio estereoscópico, utilice un par de pinzas finas y un pincel para colocar suavemente la muestra con los epitelios cocleares hacia arriba. Utilice la parte vestibular de la muestra a "ancla" el tejido para el talón. Almacenar las muestras en un desecador hasta la imagen. Realizar las imágenes de SEM como se describe en Jones (2012) 21.

9.Cuantificación

  1. Después de la preparación inmunohistoquímica, adquirir imágenes con un microscopio confocal de epifluorescencia o de escaneo láser. Después de la preparación para SEM, usar un microscopio electrónico de barrido de la imagen de los especímenes. Image la superficie apical del órgano de Corti con las células ciliadas cocleares expuestos y células de apoyo intercaladas.
  2. Definir posiciones específicas a lo largo del conducto coclear, tales como 25, 50, y 75% de la base y utilizar éstos para comparar regiones cóclea entre las muestras mutantes y de control. Analizar y comparar los mutantes cilios con sus controles de la misma camada, como las diferencias en los antecedentes genéticos pueden modificar el fenotipo coclear.
    NOTA: El órgano de Corti se desarrolla en un gradiente que se extiende desde la base hacia mediados de tanto el vértice y la base. En el ratón, el desarrollo no es completo hasta P14, por lo que es importante comparar las regiones en las etapas de desarrollo similares y posiciones.
  3. Para tomar las fotografías utilizando el software que acompaña al microscopio que allow para la cuantificación del fenotipo particular, según sea necesario (ver abajo). Utilice el software de análisis de imágenes tal como J o software Image acompaña al microscopio para medir longitudes, contar las células y determinar la localización de proteínas como se describe a continuación. Gráfico estos datos como un gráfico de barras, gráfico de dispersión, caja de transferencia o histograma, la comparación de control frente a mutante.
  4. La longitud total del conducto coclear (Figura 3A):
    1. Con un marcador de las células ciliadas o faloidina, (que marca los paquetes estereociliar), determinar y medir donde el epitelio sensorial comienza y termina. La longitud del conducto coclear a menudo se acorta en mutantes cilios.
  5. Anomalías de haces estereociliar (Figura 3 B, D, E, G):
    1. Medir la convexidad paquete (altura) como la distancia más corta entre el vértice del haz y la línea que se extiende a través de ambos extremos del haz de 'brazos', como se muestra en la Figura 3G, a la izquierda. Alternativamente, cuantificar el área deabarcada por los brazos de la célula de pelo haz estereociliar exterior como se muestra en la Figura 3G, a la derecha. Si las células del pelo con haces estereociliar circulares pueden ser identificados éstos cuentan como un porcentaje del total de células de pelo.
      NOTA: En muchos mutantes ciliares anomalías de paquetes pueden ser observados con independencia de la orientación de haz. Es difícil cuantificar con precisión las anormalidades de haces estereociliar.
  6. Orientación de los haces estereociliar (Figura 3B, C, G):
    1. Evaluar la orientación de cada haz en relación individuo a una línea que se extiende perpendicular a la fila de celdas pilar que separa las células ciliadas internas y externas. Las células con una orientación normal están alineados a lo largo de este eje perpendicular y así tener una rotación de 0 °. Determinar ángulos de rotación utilizando una notación de 360 ​​° o desviaciones absolutas de 0 °.
  7. Posicionamiento cinetocilios o estereociliar posicionamiento paquete (figura3B, F, H):
    1. Contar el porcentaje de células en las que cinetocilios faltan. Medir la distancia desde el cinocilio a la "vértice" o centro del haz. El 'vértice' del haz puede no ser fácil de definir si los paquetes son anormales, por lo que el centro del haz se pueden utilizar en su lugar.
  8. Cuantificar la posición de cinetocilios y haces de estereociliar en la superficie celular apical de pelo, mediante la superposición de una cuadrícula de posición en cada célula de pelo y marca la ubicación de cualquiera de la base de la cinocilio o el vértice / centro del haz estereociliar. Mostrar los datos como porcentaje de cada categoría que se encuentra dentro de una región específica de la red, y mediante la superposición de las ubicaciones de cada marca sobre una cuadrícula de posición.
    NOTA: En los tejidos de control, cinetocilios están siempre unido al vértice del haz estereociliar. En los mutantes cilios, cinetocilios a menudo faltan, sin embargo, todavía unido mislocalized, o incluso completamente separado de los shaz tereociliary.
  9. Cinetocilios longitud (Figura 3I):
    1. Medir la longitud de la cinocilio mediante el etiquetado con un marcador ciliar axonema. medir únicamente cinetocilios que se mantengan planos dentro de un plano confocal de 1,5 micras. Confirmar que los cilios están mintiendo plana mediante la observación de una vista en sección transversal del tejido escaneado. Comparación de diferentes muestras de edad de la misma región de la cóclea desde el cinocilio retrae durante el desarrollo.
  10. Mislocalization de las proteínas de polaridad:
    1. Después de inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra las proteínas de polaridad tales como Vangl2 y Gαi3, determinar la localización a través de formación de imágenes.

NOTA: En algunos mutantes cilios, localización de las proteínas de polaridad se interrumpe. Estos incluyen Vangl2 y Gαi3, que se ha demostrado que ser interrumpido en IFT20, Bbs8 y Bbs6 cóclea mutante.

NOTA: Otros ejemplos de cómo cuantificar y Polarit de células ciliadas pantallaY se muestran en los siguientes documentos. Curtin, et al. (2003) Current Biology 22, Montcouquiol, et al. (2003) Naturaleza 7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience 23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biología 24, mayo-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology 25, Yin et al (2012) PLoS ONE 26.

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Resultados

La disección y la cóclea Preparación del tejido

Después de la eliminación del cerebro, puesto línea media disección sagital de una cabeza P0 ratón, el laberinto óseo, visto desde atrás, puede ser visualizado (Figura 1A, flecha blanca) y se retira. La Figura 1B muestra los laberintos óseas aisladas con el cabello coclear mirando hacia arriba, ventral, (izquierda) y por detrás, ...

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Discusión

Cuando se prepara el tejido coclear para el análisis, hay algunos puntos clave a tener en cuenta. En primer lugar, las diferencias en el fondo genético puede modificar el fenotipo coclear, por lo que es necesario analizar y comparar sólo los controles de la misma camada. En segundo lugar, se requiere la eliminación completa de la membrana tectorial para obtener las mejores imágenes con inmunohistoquímica y es esencial para SEM. La membrana tectorial es una estructura opaca y puede oscurecer las células del epitelio sens...

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Divulgaciones

El autor declara que no tiene intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

El autor desea agradecer a Mateo Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer y Zoe Mann y para su evaluación crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Premio Sofja Kovalevskaya (Fundación Humbodlt) y la Universidad Johannes Gutenberg, Mainz, Alemania.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Herramientas/Equipos
Elastómero de silicona - Sylgard 184Sigma-Aldrich761028-5EAVer nota 2
Micro tijeras de disección-hoja rectaVarios
Pinzas finas (n.º 5 y 55) y pinzas romasVarios
Microscopio de disección.Varios
portaobjetos de microscopio de vidrio sin recubrimientoVarios
deslizamientos de cubierta de microscopio (22 mm y veces; 40 mm y veces; 0,15 mm)Varios
pipetas de transferenciaVarios
pines de Minutien  Fine Science Tools26002-10
Portamuestras SEMtousimis8762
Microscopía electrónica de barrido tacosTED PELLA16111
PELCO Pestañas: Adhesivo de carbonoTED PELLA16084-3
Microscopio fluorescenteVarios
Secador de puntos críticosVarios
Microscopio electrónico de barridoVarios
portaobjetos de microscopio de vidrioVarios
cubreobjetos de vidrioVarios
pañuelos Kimwipe  Varios
reactivos
de pincel
1 y veces; Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco/Life Technologies10010023
Paraformaldehído  (PFA) (Grado EM requerido para EM)VariosPrepare una solución al 4% en 1 y veces; PBS hecho fresco cada vez. Grado EM requerido para EM.
2.5% Glutaraldehído Grado1Sigma-AldrichG5882
Tris-HCl (pH 7.5)Varios
NaClVarios
CaCl 2Varios
Triton X-100Varios
Suero de cabra normalVarios
AffiniPure Fab Fragment Burro Anti-Ratón IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch715-007-003
Fluoromount-G Medios de montajeSouthernBiotech0100-01
10× Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS)Gibco/Life Technologies14065
HepesGibco/Life Technologies15630-080
Tetróxido de osmio (OsO4 )Sigma-Aldrich/Fluka Analytical75632
Ácido tánicoSigma-Aldrich403040
Etanol 200 a pruebaVarios
anticuerpos
anti Arl13bProtein Tech17711-1-APConcentración sugerida 1:1.000
anti tubulina acetilada (611-B1)Sigma-AldrichT6793Concentración sugerida 1:800
anti gamma tubulina (GTU-88)Sigma-AldrichT6557Concentración sugerida 1:200
anti Zo_1 Invitrogen40-2300Concentración sugerida 1:500
Miosina VIProteus Biosciences25-6791Concentración sugerida 1:1000
Miosina VIIaProteus Biosciences25-6790Concentración sugerida 1:1.000
anti Vangl2Merk MilliporeABN373Concentración sugerida 1:250
anti G&alfa; i3Sigma-AldrichG4040Concentración sugerida 1:250
Alexa Fluor® 488 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12379Concentración sugerida 1:300 - 1.000
Alexa Fluor® 568 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12380Concentración sugerida 1:300 - 1.000
de pintura fina

Referencias

  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7(2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378(2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7(2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839(2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988(2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925(2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B(2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C(2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

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