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Artículo de método

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

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DOI:

10.3791/53561

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1 de enero de 2016

 , 
1Department of Surgery, Division of Otolaryngology, Southern Illinois University, School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Southern Illinois University, School of Medicine

En este artículo

Resumen

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti adultos como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y de base). También demostramos un procedimiento de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio de las células ciliadas, células de soporte, y otros tipos de células que se encuentra en la cóclea.

Resumen

El órgano de Corti, alojado en la cóclea del oído interno, contiene células ciliadas mecanosensoriales y células de soporte circundantes que están organizadas en forma de espiral y tienen un gradiente tonotópico para la detección del sonido. La cóclea del ratón mide aproximadamente 6 mm de largo y, a menudo, se divide en tres vueltas (ápice, medio y base) para su análisis. Para investigar la pérdida celular, la división celular o la expresión génica en mosaico, es útil la preparación de todo el montaje o la superficie de la cóclea. Este método de disección permite la visualización de todas las células dentro del órgano de Corti cuando se combina con inmunotinción y microscopía confocal para obtener imágenes de células en diferentes planos del eje z. También se pueden obtener múltiples secciones transversales ópticas a partir de estas imágenes de pila z. Además, el método de disección de montaje completo se puede utilizar para la microscopía electrónica de barrido, aunque se necesita un método de fijación diferente. Aquí, presentamos un método para aislar el órgano de Corti como tres vueltas cocleares intactas (ápice, medio y base). Este método se puede utilizar para ratones desde la semana de edad hasta la edad adulta y difiere de la técnica utilizada para muestras neonatales en las que la calcificación de la cóclea es incompleta. Se puede utilizar una versión ligeramente modificada para la disección de la cóclea de rata. También demostramos un procedimiento para la inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia.

Introducción

La cóclea en forma de espiral del oído interno, contenida dentro del hueso temporal, alberga el órgano de Corti, el órgano final sensorial auditiva en mamíferos. La cóclea está tonotópicamente organizado y comúnmente dividido en apical, media y basal turnos correspondientes a diferentes regiones de frecuencia con detección de sonido de alta frecuencia en la base y detección de baja frecuencia en el vértice 1. Las células ciliadas, las células mechanosensory del órgano de Corti, corren a lo largo de la cóclea, que es de aproximadamente 6 mm de largo en ratones 2,3. Estas células convierten la energía mecánica de las ondas de sonido, que se transmiten a través del laberinto membranoso lleno de líquido, en señales neurales que son procesados ​​por las estructuras auditivas centrales. La técnica descrita aquí proporciona un método para preparar preparaciones completas de órgano de Corti después de la calcificación de la cóclea es completa (para las muestras que van desde una semana de edad hasta la edad adulta). También presentamos un método para immunostacaniza todo ello montado tejido coclear. Preparaciones completas cocleares son cruciales para la visualización de todas las células del cabello y que rodea las células de apoyo en sus disposiciones espaciales naturales y permiten el análisis en tres dimensiones con el uso de la microscopía confocal.

Drs. Hans Engstrom y Harlow Ades describen originalmente montar todo un método de disección coclear en 1966. Se detallan a una técnica para fijar rápidamente y diseccionar cochleae calcificado sumergido en líquido de una variedad de mamíferos, conservando intactas segmentos cortos del órgano de Corti para el análisis microscópico 4. La disección de un sin fijar, cóclea rata calcificada también se ha ilustrado en un video instructivo 5. Drs. Barbara Bohne y Gary Harding de la Universidad de Washington hicieron varias modificaciones importantes a este método. En su versión del método de montaje en toda coclear, el hueso temporal fue descalcificada, incrustado en plástico y cinco medias vueltas o diez cuartos de vueltas fueron disecciónted 6,7. Dr. Charles Liberman y sus colegas de Eaton Peabody laboratorios, Massachusetts ojo y Ear Infirmary, modificaron esta técnica por lo que no se requiere que la incrustación de plástico 8. Además modificación de la técnica se produjo en el laboratorio del Dr. Jian Zuo en el Hospital de Investigación Infantil St. Jude 9-12 que informó al método de disección que aquí se presenta. Utilizamos una estrategia diferente para acceder al órgano de Corti que Bohne y Liberman, que permite el aislamiento de apical completa, media y vueltas basales. Así, el tejido diseccionado es más grande y menos probabilidades de ser perdido o dañado durante el proceso de disección o de inmunotinción. Además, el método actual facilita la medición de la distancia desde la punta apical o basal gancho para identificar una región de frecuencia.

Aunque muchos laboratorios realizan inmunotinción del tejido coclear, no está claro dónde se originó este método. Como resultado de ello hay varias recetas para el bloqueo de buffers y tampones de incubación de anticuerpos que pueden afectar el desempeño de los anticuerpos primarios individuales. A continuación, presentamos un método para inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia que es aplicable a los anticuerpos más comúnmente utilizados en el campo auditivo.

La forma compleja de la cóclea, delicada estructura del órgano de Corti, y encajamiento ósea proporcionan un desafío para el análisis histológico y bioquímico. Una variedad de técnicas se utilizan actualmente en el campo de audición para superar estas características difíciles y visualizar las células dentro del órgano de Corti, cada técnica con sus propias ventajas y desventajas. El protocolo que aquí se presenta permite la disección para el conjunto de montaje de la cóclea del ratón adulto y, con una ligera modificación, potencialmente se puede utilizar para examinar las estructuras críticas dentro de las cócleas de una variedad de otros organismos modelo utilizados en el campo.

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Protocolo

Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Facultad de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois.

1. Extracción de Huesos temporales

  1. Identificar los temporales en la base del cráneo del ratón 13 y raspar los nervios craneales utilizando fórceps patrón estándar.
  2. Coloque fórceps patrón estándar en la punta de la cápsula ótica y con el pulgar de la mano opuesta presione hacia abajo en el canal semicircular posterior para desalojar la cóclea encapsulado.
  3. Liberar la mitad inferior del hueso temporal del cráneo de forma manual con el pulgar y el dedo índice o usando 10,5 cm tijeras finas.

2. Post-fix temporales Huesos

  1. Coloque huesos temporales en 2 ml tubos de microcentrífuga que contiene 250 - 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en solución salina tamponada con fosfato 10 mM (PBS) de pH 7,4 y incubcomió a temperatura ambiente durante 2-20 horas.
    NOTA: No se necesita una apertura de la tapa apical o inyección de PFA en la ronda o la ventana oval. Recomendar el uso libre, ultra-pura, microscopía electrónica (EM) de grado metanol PFA que se puede comprar en una concentración del 16% en viales de vidrio. Una vez que se abrió un vial y se diluyó 1: 4 en PBS, por lo que una solución al 4%, que puede ser utilizado para un máximo de 2 semanas cuando se almacena a 4 ° C (Algunos anticuerpos requieren la fijación a corto y otros pueden tolerar O / N (O / N) de fijación).

3. decalcify temporales Huesos

  1. Después de la fijación, retire PFA con una pipeta y reemplazar con 120 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), un poco más de 2 ml. Asegúrese de llenar todo el tubo de microcentrífuga de 2 ml para evitar las burbujas de aire cuando el tubo está cerrado.
    1. Si no descalcificación inmediatamente, vuelva PFA con pH 7,4 y almacenar muestras de PBS 10 mM a 4 o C.
      NOTA: Después de la fijación, huesos temporales se pueden almacenar durante variable asciende de tiempo antes de descalcificación en función de los antígenos que se examina.
  2. Colocar los tubos en extremo-extremo sobre los rotadores y giran a 4 rpm a temperatura ambiente. Cambie solución de EDTA al día usando una pipeta. Longitud de descalcificación depende de la edad de la muestra y la preferencia del científico que hace la disección.
    1. Incubar huesos temporales en EDTA usando las siguientes directrices para los tiempos de incubación:
      Para las muestras de día postnatal (P) 8 a P15: 2 - 4 horas; Para muestras P15 a P21: O / N; Para muestras P21 a P30: 2 O / N; Para muestras mayores de P30: 3 o más O / N.
      NOTA: Los tiempos de descalcificación están sujetas a la preferencia de los usuarios y se puede ampliar según sea necesario. Tiempo de descalcificación se puede reducir cambiando la solución de EDTA dos veces al día, alrededor de 8 horas de diferencia. Algunos laboratorios añadir 1% PFA a la solución de EDTA cuando descalcificación por más de 3 días para evitar la contaminación.
  3. Para determinar si la muestra se descalcificar adecuadamente, coloque huesos temporales ona de silicio impregnados de elastómero plato de disección y presione suavemente con fórceps en la cóclea en forma de caracol. Si el tejido es spongey, a continuación, la descalcificación es completa.
  4. Una vez descalcificación, retire EDTA con una pipeta y añadir 500 -1000 l de 10 mM PBS pH 7,4. Almacene las muestras a 4 ° C hasta el momento de diseccionar.

4. Crear recubierto de elastómero de silicona Dish Disección

  1. Combinar la base y agente de curado de un kit encapsulante elastómero de silicona de acuerdo con las instrucciones del fabricante y mezclar bien.
  2. Añadir aproximadamente 2-3 cucharadas de polvo de carbón hasta que la solución es de color negro y mezclar bien.
    NOTA: tinta líquida o carbón vegetal líquido no se mezclan con la solución y no se puede utilizar. Kits encapsulantes elastómero de silicona se pueden comprar en negro, lo que permite el paso 4.2 para ser omitido.
  3. Vierta la solución en 60 mm de vidrio o placas de Petri de plástico, lo suficientemente satisfactorios para cubrir el fondo. Si bubbles están presentes, soplo de aire en la superficie. Deje reposar por lo menos 24 horas a temperatura ambiente para ajustar.
    NOTA: los platos impregnados de elastómero de silicona se puede utilizar en varias ocasiones durante años. Sin embargo, no use etanol para la limpieza, ya que esto hará que el elastómero de silicona de roer.

5. Todo el montaje Disección de la cóclea (por P7 y muestras de edad avanzada)

  1. Separar la espira basal de vueltas medias / apicales
    1. Coloque un hueso temporal descalcificada en un plato de la disección con recubrimiento de elastómero de silicona rellena dos tercios de su capacidad con 10 mM de PBS pH 7,4 y el uso de un microscopio de disección estéreo para los siguientes pasos.
    2. Sostenga el hueso temporal en la región vestibular con # 4 o # 5 pinzas de joyero recta y usando 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, cortar el exceso de tejido cápsula ótica largo de los lados y por encima del ápice.
    3. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, inserte una hoja en la ventana oval y hacer varios pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral / lateralpared de la espira basal.
    4. El uso de 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, inserte una hoja en la región acaba de cortar y colocar la otra hoja en la parte externa del hueso temporal, medial a la ventana oval. Este corte separa la espira basal de giros medio y apical.
  2. La disección completa de la espira basal.
    1. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, cortar las fibras nerviosas del ganglio espiral que se conectan a la modiolo para liberar la tensión en la espira basal y corte por debajo de la espira basal de separar de los órganos vestibulares.
    2. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, hacer una serie de pequeños cortes para retirar el ligamento espiral / pared lateral de ambos por encima y por debajo del órgano de Corti. Utilice # 4 o # 5 pinzas de joyero recta para guiar el tejido. Fijar las fibras nerviosas del ganglio espiral en el elastómero de silicona recubierto con plato de disección, pero no aferrarse a esta región como el tejido se rompa.
    3. Durante los pasos anteriores, algunos de los Membran de Reissnere a menudo será eliminado. Si alguna sigue siendo, sujete la membrana de Reissner con pinzas # 4 o # 5 de joyero recta y alejarse del órgano de Corti.
      NOTA: La membrana tectorial rara vez es visible y por lo general flota lejos sin necesidad de un paso específico para su eliminación.
    4. Finalmente hacer varios recortes para reducir el espesor de los axones del ganglio espiral, para hacer la vuelta lo más plano posible y utilizar # 4 o # 5 pinzas de joyero directamente a transferir la espira basal diseccionado, agarrando los axones restantes del ganglio espiral, a una placa de 48 pocillos (o cámara de diapositivas) que contiene ~ 500 l de 10 mM de PBS pH 7,4.
  3. Media separada y vueltas apical
    1. Coloque los dos tercios restantes de la cóclea, con el lado apical hacia abajo.
    2. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, inserte una hoja en la escala media, donde el giro medio utilizado para conectarse a la espira basal, y hacer varios pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral / de la pared lateral del XXe espira media.
    3. El uso de 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, inserte una hoja en la región acaba de cortar con el giro medio colocado en la parte superior de la hoja, y coloque la otra hoja en la parte exterior del laberinto óseo, en un ángulo de 90 ° de la punta apical. Esto separa la espira media de la vuelta apical.
  4. La disección completa de la espira media de una manera similar a la vuelta basal (consulte los pasos 5.2.2 al 5.2.4).
  5. La disección completa de la vuelta apical.
    1. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, abra la tapa que cubre el turno apical. Disección completa de una manera similar a la espira basal (consulte los pasos 5.2.2 a 5.2.4).
      NOTA: disecado giros cocleares pueden almacenarse en 10 mM PBS pH 7,4 en una placa de 48 pocillos (o cámara de diapositivas) a 4 ° C durante varias semanas antes de la inmunotinción. Sin embargo PBS se evaporará y necesita ser repuesto periódicamente y almacenamiento de más de 2 - 3 semanas puede dar lugar a crecimiento bacteriano o fúngico en eltejido que puede disminuir la calidad de la imagen. Se recomienda el almacenamiento a largo plazo de las muestras como los temporales no seccionada.

6. La inmunotinción con marcado con fluorescencia Anticuerpos

  1. Después de la disección, almacenar cada vez coclear en un pozo independiente en una placa de 48 pocillos (o diapositiva de cámara), sumergido en ~ 500 l de 10 mM PBS pH 7,4. Para cada uno de los siguientes pasos el giro coclear debe ser sumergido en un líquido, no flotante en la parte superior o pegada a un lado del pozo.
    NOTA: Al retirar el líquido de cada pocillo, es fácil perder los giros cocleares o encárgate de la punta de la pipeta. Cambio de soluciones con una punta de pipeta 200 l usando un alcance de la disección ayudará a prevenir esto.
  2. Con una pipeta, retire PBS de cada pocillo y reemplazar con ~ 200 - 300 l por pocillo de bloquear / solución de permeabilización (1% Triton X-100, 1% de albúmina de suero bovino (BSA), y 10% de suero normal de cabra (NGS) diluido en PBS 10 mM pH 7,4). Incubar 1 hora a temperatura ambiente en un rotador 3D.
    NOTA: Si cualquier anticuerpo primario utilizado fue hecha en un huésped de cabra, entonces será necesario un anticuerpo secundario de cabra anti-NGS y NO se debe utilizar para cualquiera de los pasos. Suero de caballo normal puede ser utilizado como un reemplazo para NGS.
  3. Eliminar la solución de bloqueo / permeabilización utilizando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de solución de anticuerpo primario (0,1% Triton X-100, 1% de BSA, y 5% NGS diluidos en PBS 10 mM pH 7,4). El factor de dilución para cada anticuerpo primario varía. Incubar O / N (mínimo 14 horas) a 4 ° C en un rotador 3D.
    NOTA: Si se utiliza más de un anticuerpo primario, todas se pueden combinar en la misma solución para la incubación, sólo asegúrese de que cada anticuerpo primario tiene un host diferente.
  4. Retire solución de anticuerpo primario utilizando una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Cada lavado incuba un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente en un rotador 3D.
  5. Retire última PBS lavado usando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de una solución de anticuerpo secundario (0,1% Triton X-100, 1% de BSA, y el 5% NGS diluidos en PBS 10 mM pH 7,4). El factor de dilución para cada fluorescentemente etiquetado anticuerpo secundario es generalmente de 1: 500 o 1: 1000. Coloque la placa de 48 pocillos en un cuadro negro para proteger fluorescente etiquetados anticuerpos secundarios de la luz. Incubar 2-3 horas a temperatura ambiente en un rotador 3D.
    NOTA: Si se necesita más de un anticuerpo secundario, que se pueden combinar en la misma solución para la incubación. Asegúrese de que no hay posibilidad de etiquetado cruz (ej., El uso de anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo y pollo anti-cabra)
  6. Retire solución de anticuerpo secundario con una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Incubar cada lavado durante un mínimo de 5 min a RT en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz.
  7. Retire último lavado PBS utilizando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de CEOShst 33342 (diluido 1: 2000 en PBS 10 mM pH 7,4) para etiquetar los núcleos. Incubar 15 - 20 min a TA en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz. No incubar más de 20 min.
  8. Retire la solución Hoechst utilizando una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Incubar cada lavado durante un mínimo de 5 min a RT en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz.
  9. Todos los pasos se pueden extender, excepto la incubación Hoechst, por varias horas si es necesario. Para detener la reacción en cualquier momento, simplemente sumergir las muestras en ~ 500 ul de PBS 10 mM pH 7,4 y almacenar la placa 48 -bien (o diapositiva de cámara) a 4 ° C hasta que esté listo para reanudar las horas de protocolo o de 1 - 2 días después .

7. Monte Coclear Activa Diapositivas

  1. Etiquetar los portaobjetos con información pertinente acerca de la muestra y los anticuerpos utilizados.
  2. Pipeta ~ 50 l de los medios de montaje en cada diapositiva y tener cuidadopara evitar burbujas. Centrifugar el tubo que contiene el medio de montaje para eliminar las burbujas.
  3. Usando # 4 o # 5 pinzas de joyero recta, sujete los axones del ganglio espiral para transferir suavemente una vuelta coclear de la placa de 48 pocillos a la diapositiva y el lugar en los medios de montaje. Monte una vuelta coclear por diapositiva para evitar exposición a la luz y fotoblanqueo durante el proceso de obtención de imágenes.
  4. Utilice un microscopio de disección estéreo para asegurar que a su vez coclear no se dobla, tuerce, o cerca de una burbuja de aire. Si se produce alguna de estas condiciones, fórceps uso # 4 o # 5 de joyero directamente a reposicionar el turno coclear.
  5. Coloque un extremo de un cubreobjetos sobre el portaobjetos y suelte suavemente para dejar caer el cubreobjetos.
  6. Utilice un microscopio de disección estéreo para asegurarse de que la vuelta coclear no se dobla, tuerce, o cerca de una burbuja de aire. Si se produce alguna de estas condiciones, mueva suavemente el cubreobjetos de ida y vuelta para volver a colocar el turno coclear.
  7. Colocar los portaobjetosen una carpeta de diapositivas para que queden planos. Deje de montaje cura medios O / N a temperatura ambiente (mantener en la oscuridad)
  8. Cubreobjetos sello con esmalte transparente de uñas y almacenar a temperatura ambiente o -20 ° C hasta el fotografiado. Las diapositivas se pueden almacenar en una carpeta de diapositivas o caja de portaobjetos.
    NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a largo plazo a -20 ° C o -80 ° C y la fluorescencia se mantendrá durante varios meses.
  9. Diapositivas de imágenes utilizando un microscopio confocal con la longitud de onda apropiada basada en los anticuerpos secundarios utilizados durante el procedimiento de inmunotinción. Ajustes de brillo y contraste se pueden realizar utilizando el software de imagen proporcionada por el vendedor confocal.

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Resultados

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y base) a partir de tejido coclear que está calcificada, con escalones de disección clave presentados en la Figura 1. Durante la primera semana postnatal del desarrollo, la calcificación de la cóclea del ratón es incompleta y un método de disección más simple puede ser utilizado 13. Utilizando el método de disección neonatal todo el montaje ...

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Discusión

Hay varios pasos críticos para el éxito de la disección de todo el montaje y la inmunotinción. Sin embargo antes de que cualquiera de estos métodos se llevan a cabo, se requiere la fijación adecuada del tejido coclear. Recomendamos el uso de metanol libre, ultra-pura, EM grado PFA. PFA hecha de polvo puede tener trazas de metanol y un pH inestable que disminuye la calidad de inmunofluorescencia. Otros grupos también han demostrado que las disecciones similares son posibles utilizando fijadores que no contienen for...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de la Oficina de Investigación Naval (N000141310569). El equipo del Centro Nacional de Recursos de Investigación de Recursos de Investigación en Salud (S10RR027716) de la Facultad de Medicina del Sur de Illinois contó con el apoyo del Centro Nacional de Recursos de Investigación de Salud ().

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pinzas de patrón estándarFine Science Tools11000-12se puede comprar a otros proveedores
Tijeras finas de 10,5 cmFine Science Tools14060-11se puede comprar a otros proveedores
Tubos de microcentrífuga de 2 ml MidSciAVSS2000se puede comprar a otros proveedores
16% de formaldehído, sin metanol, ultra puro, EM gradePolysciences18814TÓXICO -- use guantes y no se puede desechar en el fregadero. Se puede comprar a otros proveedores.
PBS pH 7.4 SigmaP3813-10PAKse puede comprar de otros proveedores
EDTAFisher BP118-500se puede comprar de otros proveedores
rotador de tubo de extremo a extremoFisher05-450-127se puede comprar de otros proveedores Placa de
Petri de 60 mmFisher50-202-037se puede comprar de otros proveedores
Kit de encapsulante de silicona Dow Corning Sylgard 184Ellsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KG
carbón activadoFisherAC134372500se puede comprar de otros proveedores
microscopio de disección estereoscópicaZeissStemi 2000se puede comprar de otros proveedores
Pinzas de joyero Dumont #4Herramientas de ciencia fina11241-30
Pinzas de joyero Dumont #5 Herramientas deciencia fina11251-20
Tijeras de resorte Vannas de 2,5 mmFine Science Tools15001-08curvo 
Tijeras de resorte Vannas-Tubingen de 5 mmFine Science Tools15003-08placas rectas
de 48 pocillosFisher08-772-52se puede comprar a otros proveedores
portaobjetos de cámara de 8 pocillosFisher1256518se puede comprar a otros proveedores
Triton X-100SigmaX100-500se puede comprar a otros proveedores
BSA, fracción VFisherBP1605se puede comprar de otros proveedores
NGSVector labsS-1000se puede comprar de otros proveedores
NHSVector labsS-2000se puede comprar de otros proveedores
3D rotatorMidsciR3D-710se puede comprar de otros proveedores
Western blot incub box XLLicor929-97401
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570se puede comprar a otros proveedores
Medios de montaje antidecoloración de oro prolongadoLife TechnologiesP36930se puede comprar a otros proveedores, pero los medios de montaje varían en su capacidad para proteger contra el fotoblanqueo
Superfrost Plus SlidesFisher12-550-15se puede comprar de otros
proveedorescubreobjetos 22 x 22 x 1Fisher12-548-Bse puede comprar a otros proveedores
esmalte de uñastransparente Farmaciase puede comprar a otros proveedores Carpeta de
cartón para diapositivasFisher12-587-10se puede comprar a otros proveedores
Caja de plástico para diapositivasFisher03-448-10se puede comprar a otros proveedores
local

Referencias

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