Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Resumen

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Resumen

Genoma de edición de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) proporciona una plataforma controlada genéticamente y clínicamente relevante de la que para comprender el desarrollo humano e investigar la fisiopatología de la enfermedad. Mediante el empleo de nucleasas específicas del lugar (SSN) para la edición del genoma, la rápida derivación de nuevas líneas HPSC albergan alteraciones genéticas específicas en un entorno de lo contrario isogénico se hace posible. Zinc dedo nucleasas (ZFNs), transcripción nucleasas tipo activador efectoras (Talens) y agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / Cas9 son los números de seguro social más utilizados. Todas estas nucleasas funcionan mediante la introducción de un descanso de ADN de doble cadena en un sitio determinado, promoviendo así la edición gen precisa en un locus genómico. Edición genoma meditado-SSN explota dos de los mecanismos de las células endógenas de reparación del ADN, de extremos no homólogos de unión (NHEJ) y homología de reparación dirigido (IDH), ya sea a introducir de inserción / deleción mutaciones o alter el genoma utilizando una plantilla de reparación homóloga en el sitio de la rotura de doble cadena. Electroporación de hPSCs es un medio eficaz para la transfección de números de Seguro Social y las plantillas de reparación que incorporen transgenes tales como reporteros fluorescentes y casetes de resistencia a antibióticos. Después de la electroporación, es posible aislar sólo aquellos hPSCs que incorporaron el constructo de reparación mediante la selección para la resistencia a los antibióticos. Para separar mecánicamente colonias HPSC y confirmando la integración adecuada en el sitio diana a través de genotipado permite el aislamiento de líneas celulares correctamente orientadas y genéticamente homogéneos. La validez de este protocolo se demuestra aquí utilizando las tres plataformas SSN incorporar EGFP y una resistencia a puromicina construyen en el locus puerto seguro AAVS1 en células madre pluripotentes humanas.

Introducción

Tecnologías de edición Genoma están evolucionando rápidamente en herramientas estándar de biología molecular y celular ^1. La ingeniería genética de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) es de particular interés ya hPSCs representan una fuente de auto-renovación de células humanas primarias genéticamente intactos. hPSCs pueden diferenciarse en diversos tipos de células para el modelado de la enfermedad o como una fuente para las terapias de trasplante de ^2,3. Ha demostrado aquí es un protocolo que utiliza tres tipos diferentes de nucleasas específicas de sitio (SSN) en conjunción con los mecanismos de reparación del ADN endógeno para la integración dirigida de un constructo indicador en el locus AAVS1. Después de la transfección de los SSN en hPSCs, demostramos cómo aislar poblaciones de células isogénicas albergar el reportero.

La capacidad de manipular genomas, específicamente los genomas de células madre pluripotentes, utilizando los SSN no es un nuevo fenómeno como la utilidad de nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y activat transcripciónnucleasas efectoras o similares (Talens) para la edición de genes se demostró hace varios años ^4-10. Sin embargo, con el advenimiento de S. pyogenes CRISPR / tecnología Cas9 ^{11-13 de} la edición gen se ha convertido en ampliamente accesible ^14. Todos los números de Seguro Social introducen una ruptura del ADN de doble cadena (DSB) en el sitio ^1,4,5,11 destino especificado que está reparado por mecanismos celulares endógenos usando reparará extremo de unión (NHEJ) u homología dirigida no homóloga (IDH) ^15. NHEJ es propenso a errores y se puede introducir mutaciones cambio de marco resulta en la pérdida de la función génica, mientras HDR permite nuevos elementos para ser introducidos a través de la co-transfección de una plantilla de reparación con el SSN. Mientras que los principios subyacentes de la reparación del ADN que facilitan la edición gen se cree que son en gran parte los mismos para cada SSN, algunas diferencias entre las plataformas pueden tenerse en cuenta. De novo diseño de ZFNs permite la flexibilidad y la nucleasa de optimización ^16, sin embargo el uso de públicamentebibliotecas de montaje disponibles y herramientas de evaluación para diseñar ZFNs individuales pueden llevar mucho tiempo. Una vez determinado el lugar deseado para la orientación mediada por ZFN, pares ZFN pueden ser diseñados con la herramienta en línea ZiFit ^17. Después de diseño, ZFNs se puede montar de forma modular a través de varias rondas de clonación plásmido ^18. Alternativamente, hay muchas ZFNs disponibles comercialmente, pre-validado ^19. Nucleasas TALE también pueden ser diseñados utilizando herramientas en línea y componentes disponibles públicamente ^17,20. Por ejemplo, Talens se puede montar rápidamente de bloques de cinco repeticiones TALE, a través del conjunto FLASH ²¹ o el uso conjunto de la puerta de oro de PCR basada jerárquica ^22. Facilidad de diseño SSN y la velocidad de la construcción utilizando CRISPR / Cas9 han hecho genoma editar una herramienta ampliamente accesible. La guía breve orientación ARN mediada de CRISPR / Cas9 también permite la multiplexación de los ARN de guía para orientar varios loci con una única construcción ^14. El diseñoCas9 para la edición de gen sólo requiere la identificación de un motivo adyacente protospacer (PAM; un trinucleótido NGG para S. pyrogenes Cas9) proximal para el locus diana. Mediante la inserción de un oligonucleótido que corresponde a los pares de bases 20 5 'de la PAM en el plásmido px330 ^14, el constructo se puede montar en un solo paso de clonación. Además de S. pyogenes Cas9, Cas9 de N. meningitidis (NmCas9) que reconoce a '(PAM) 5'-NNNNGATT-3 se ha demostrado para permitir la eficiente gen de edición en hPSCs ^23.

Además de las diferencias en la facilidad de diseño SSN, cada plataforma tiene propiedades específicas. Por ejemplo, ZFNs y Talens utilizan el dominio nucleasa FokI, que genera una de cuatro nucleótidos 5 'voladizo ^24, mientras que Cas9 se piensa sobre todo para generar embotar DSBs terminado. ZFNs, Talens, y Cas9 difieren en sus estabilidades de proteína, la tasa de encendido y apagado en el ADN objetivo, y el modo de exploración de ADN, todos los cuales could teóricamente dar lugar a pequeñas diferencias en el resultado de edición ^1. Aunque se necesitan más estudios para comprender plenamente las consecuencias de estas diferencias, se describe aquí un protocolo que es muy robusto en las tres plataformas y se puede utilizar para generar fácilmente hPSCs modificados genéticamente.

Independientemente de la opción SSN, electroporación es un procedimiento robusto para transfectar SSN y plantillas de reparación de homología en hPSCs ^25. El número de colonias supervivientes después de la selección para la resistencia a los antibióticos depende de los parámetros específicos de locus y la estrategia de edición (por ejemplo, el tamaño del inserto transgénico y el modo de selección). El protocolo descrito aquí por lo general se traduce en unos 150 a 400 colonias de células individuales derivados.

Gen-editando en el locus AAVS1 usando este protocolo se ha utilizado anteriormente para demostrar la eficacia de los SSN ^4,5. La plantilla de reparación de AAV-CAGGS-EGFP utiliza una trampa de genes strategia para conferir resistencia a puromicina de una manera específica locus. Brevemente, la plantilla de reparación contiene un sitio aceptor de empalme aguas arriba de la casete de resistencia a puromicina sin promotor. Tras la integración correcta en el primer intrón del gen PPP1R12C en el locus AAVS1, la casete de resistencia se expresa a partir del promotor del gen editado. La solidez de este ensayo AAVS1 específica nos permite comparar la eficiencia de cada plataforma SSN.

Edición de genes usando números de seguro social es de gran alcance, dada la capacidad de alterar y / o modificar teóricamente cualquier gen. La aplicación de esta estrategia para hPSCs ofrece versatilidad como hPSCs pueden diferenciarse posteriormente en una multitud de tipos de células humanas tales como las neuronas ^26, hepatocitos ^{27, 28} y cardiomiocitos. Además, el uso de células madre pluripotentes inducidas derivados del paciente permite la reparación o la introducción de mutaciones causantes de enfermedad conocidos en un fondo genético específico del paciente ²⁹ , Proporcionando una plataforma para investigar mecanismos de la enfermedad y la terapéutica de prueba utilizando las propias células del paciente ^30. En resumen, la edición de genes en hPSCs es un enfoque eficiente y versátil para la investigación de la biología básica del desarrollo humano y la enfermedad ^31.

Protocolo

Los procedimientos descritos en este manuscrito fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Supervisión de la Investigación Universidad de Berkeley de Células Madre.

1. Preparar las células madre para la edición

1. Crecer y cultivar células madre pluripotentes humanas (hPSCs) en una placa de 6 pocillos que contiene 2,4 × 10 ⁶ células / plato de ratón inactivado-C mitomicina fibroblastos embrionarios (MEF) alimentadores cultivadas en gelatina ^32. Mantener hPSCs en 3 ml de medio de células madre de embriones humanos por pozo (medios hESC) y crecer en un 37 ° C incubadora con 3% O _2/5% de CO _2.
   Nota: Para el éxito de este protocolo, no es necesario mantener hPSCs en una incubadora de bajo oxígeno; sin embargo, es importante señalar que hPSCs proliferan más rápidamente en un entorno de alto O _2, por lo que los tiempos y el número de células se deben ajustar en consecuencia. También hay que señalar que hPSCs mantienen en bajos niveles de oxígeno tienen menores tasas de diferenciación espontánea ^33.
   1. To hacer que los medios de comunicación 500 ml hESC combinan 380 ml de DMEM / F12, 75 ml de suero fetal bovino (FBS), 25 ml KnockOut suero de Reemplazo (KSR). Añadir glutamina (1 mM concentración final), 5 ml 100x ácidos no esenciales Amino, 100 unidades / ml penicilina-estreptomicina (P / S), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (4 ng / ml de concentración final), y 2- mercaptoetanol (5,5 M concentración final).
2. Cambie los medios de comunicación mediante la eliminación de todo el volumen de los medios de comunicación (3 ml) con una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplazar con medios hESC 3 ml tibia con una pipeta serológica. Repita los medios cambian todos los días hasta hPSCs son aproximadamente el 50% de confluencia (día -1).
3. Un día antes de la orientación (día -1), cambiar los medios de comunicación células madre, la eliminación de los viejos medios de comunicación y la adición de los medios de comunicación de células madre cálidos suplementado con 10 mM Y-27632.
4. También el día -1, preparar una o dos placas de 6 pocillos o de 10 cm de resistentes células alimentadoras MEF drogas de ratones DR4 (2,4 × 10 ⁶ células / placa) ^34.
   Nota: En general, las placas de 6 pocillos son adventajosos más de 10 platos cm, ya que acomodan más medios. 6 placas así también garantizar que los diferentes clones de diferentes pozos son independientes. Sin embargo, una placa de 10 cm permitirá picking más fácil, dependiendo del microscopio disponible para este proceso.

2. Edición de células madre pluripotentes

1. Preparar soluciones de transfección pipeteando 5 g cada uno de ZFN 1 y 2, TALEN 1 y 2, o 15 g de la CRISPR / Cas9 plásmido que codifica px330 (Figura 1) en un tubo de 1,5 ml. Pipetear 30 g del plásmido de reparación en este tubo también. Por último, la pipeta 1x tampón fosfato salino (PBS) en el tubo para llevar el volumen hasta 300 l.
   Nota: Preparar plásmidos como un midiprep (cualquier kit es adecuado) con una concentración mínima de 300 ng / l con el fin de mantener el volumen total de la solución de transfección de menos de 300 microlitros. No es necesario para llevar a cabo la extracción con fenol / cloroformo, para linealizar el plásmido, o utilizar un endotokit de preparación plásmido libre xin.
2. Retire el medio de hPSCs utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Pipeta 2 ml de PBS 1x caliente en cada pozo para lavar las células.
3. Retire la PBS de inmediato con una pipeta de vidrio y de vacío. Añadir solución de tripsina-EDTA 0,5 ml 0,25% directamente sobre las células en cada pocillo. Colocar en la incubadora (37 ° C / 5% de CO _2/3% O ₂₎ durante aproximadamente 10 min. o hasta capa de alimentación comienza a levantar la placa.
4. Añadir 2 ml de medio caliente esWash (470 ml DMEM / F12, 25 ml de FBS, 100 unidades / ml P / S) a cada pocillo para detener la reacción tripsina.
5. Asegurar que las células alimentadoras salir como una hoja. Pipetear los contenidos de cada pocillo en un único tubo cónico de 50 ml, la combinación de todos los pocillos. Células usando un triturado en 10 ml pipeta serológica. No es necesario para romper la capa de alimentación; hPSCs se desprenderá de la capa de alimentación por trituración suave. No debe ser de unos 15 ml de la suspensión celular.
6. Añadir 25 ml de medio esWash al tubo para llevar el voluyo hasta 40 ml en total. Permitir que grandes trozos de alimentación se asienten en el fondo del tubo de 1-2 min. Eliminar el sobrenadante (~ 38 ml) del tubo utilizando una pipeta serológica y depositar en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
7. Centrifugar durante 5 minutos a 190 x g. Eliminar el sobrenadante del tubo usando una pipeta de vidrio y de vacío. Asegúrese de no perturbar el sedimento celular. Resuspender las células en 500 l de 1x PBS. Combinar con solución de transfección del plásmido preparado con anterioridad. Contar las células en este paso. Utilice 5-10 millones de células por electroporación.
8. Pipetear toda la suspensión de 800 l en una cubeta de electroporación de 4 mm, colocar en hielo durante 3-5 minutos. Electroporar células utilizando el programa exponencial en el sistema de electroporación con los siguientes parámetros: 250 V, 500 mF, ∞ resistencia, y 4 mm de tamaño de cubeta. Después de la electroporación, coloque la cubeta de nuevo en hielo durante 3 min.
   Nota: Tenga en cuenta la constante de tiempo de la electroporación en el sistema de electroporación. La constante de tiempovaría con el número de células y la pureza del ADN. Transfecciones exitosos por lo general tienen un tiempo constante entre 10 a 14 ms cuando se utilizan las condiciones mencionadas y un pulsador de genes II. Bajar las eficiencias de electroporación pueden ocurrir cuando constantes de tiempo varía de estos valores.
9. Resuspender las células electroporadas en 18 ml cálida hESC medio suplementado con 10 mM Y-27632. Placa 3 ml de esta suspensión de células individuales en cada pocillo de una placa de 6 pocillos con células alimentadoras DR4. Retorno a la incubadora (37 ° C / 5% de CO _{2/3% O} 2).

3. Selección de colonias positivas

1. Día 2, quite todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplazar con 3 ml de medio de células madre cálidos suplementado con 10 mM Y-27632. Día 3, quite todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplace con 3 ml de medio de células madre cálida sin incluir Y-27632. Día 4, quite todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplace con 3 ml de medio de células madre cálidos suplementado con antibióticos para selectien. Retorno a la incubadora (37 ° C / 5% de CO _{2/3% O} 2).
   Nota: El tipo de antibiótico que se usa dependerá de la casete de resistencia incluido en la plantilla de reparación. Cuando se trabaja con WIBR # 3 hPSCs (NIH registro 0079), 0,5 mg / ml de puromicina, 70 mg / ml de G418 (geneticina), y 35 mg / ml de higromicina se han utilizado con éxito. Las concentraciones de la selección deben determinarse empíricamente mediante el establecimiento de la concentración mínima de antibiótico necesaria para matar las células de tipo salvaje en un plazo aproximado de una semana.
2. Días 5-12, cambian los medios de comunicación todos los días, en sustitución de los viejos medios cada vez con medios hESC cálidos suplementado con antibióticos.
   Nota: esperar una gran cantidad de muerte celular. Las colonias individuales se pondrán de manifiesto en torno días 8-10. Medios hESC Regular sin antibióticos se puede utilizar después de 12-14 días de selección continua. Si la densidad celular es alta o la muerte celular es lenta, la acidificación de los medios de comunicación debe ser evitado y que puede ser necesario aumentar las volu mediosme (hasta 4-5 ml) durante los primeros días de la selección.

4. Recoger las colonias seleccionadas (día 12-14)

1. Observe colonias en días 12-14. Observe las colonias que están listos para recoger en un microscopio de disección y asegurarse de que no contienen células que empiezan a diferenciarse. El tamaño aproximado debe ser 800-1.200 M. Si colonias alcanzan este tamaño antes del día 12, se recomienda que deben ser recogidos a continuación.
   Nota: Para cada experimento dirigido, recoger la mayor cantidad de colonias como sea necesario para asegurar el genotipo deseado se aísla. Como ejemplo, la edición AAVS1 con la plantilla de reparación de AAV-CAGGS-EGFP ha demostrado consistentemente la integración robusta, y requiere sólo 12-24 colonias para ser recogidos para obtener aproximadamente 5-10 clones heterocigótica dirigidos. Otros experimentos dirigidos pueden requerir más colonias para ser recogidos (Tabla 1). La frecuencia de los eventos de segmentación correcta, depende de factores tales como la eficiencia de la SSN para introducir un OSD, el tamaño de inserción, y la estrategia de selección. En el caso del enfoque de trampa de genes para el locus AAVS1 que aquí se presenta, el marcador de selección sólo se expresa cuando se integra correctamente en el sitio diana, reduciendo el número de colonias requerido para obtener un clon correctamente orientado.
2. Un día antes de recoger, preparar placas de 12 pocillos de MEFs (2,4 × 10 ⁶ células / placa, un pozo se utilizarán para cada colonia recogido).
3. En el día de la recolección, retire todos los soportes de las placas de 12 pocillos MEF utilizando una pipeta de vidrio y de vacío y reemplazar con 1 ml de medio de células madre. También el día de la recolección, cambiar los medios de comunicación células madre en las placas de 6 así que van a ser recogidos.
4. Tire pipetas de vidrio para la disociación mecánica de colonias individuales de la capa alimentadora. Baje las pipetas sobre un mechero Bunsen en el capó y suavizado en el punto de expansión hasta que el vidrio es maleable. Quitar rápidamente del fuego y tirar la pipeta creando además un punto angular. Rompe elapuntar aproximadamente 2 cm desde el eje doblado, dejando un estrecho canal. Pulir el extremo del canal mediante la exposición a la llama durante 1-2 seg.
   Nota: Opcionalmente recoger colonias una punta de pipeta p20, sin embargo, esto puede reducir la clonalidad de la cultura, como la punta embotada puede desalojar mayores cantidades de células de cada colonia en los medios de comunicación, potencialmente contaminante cosechas posteriores.
5. Montar dispositivo de recogida mediante la adopción de una punta de pipeta filtro p1000 y adjuntando un bulbo de succión al extremo estrecho. Inserte la pipeta de vidrio tirado en el extremo ancho.
6. Coloque una placa de 6 pocillos de hPSCs a ser recogido en el escenario de un microscopio de disección montada en una campana de cultivo de tejidos. Comprimir la bombilla del dispositivo de recogida y extirpar con cuidado y cortar una colonia individual en 10-20 piezas de igual tamaño, con cuidado de no soltar piezas en los medios de comunicación. Tome extirpados piezas HPSC de la colonia en la pipeta por la liberación de la bombilla. Trate de tomar tan poco como sea posible los medios de comunicación durante la transferencia.
7. Transfer la colonia individual a un solo pocillo de una placa de 12 pocillos MEF, comprimiendo el bulbo de nuevo directamente en el pozo, la liberación de la colonia ahora roto. Etiquete cada pocillo para permitir la identificación única de una sola célula clones derivados. Repita el procedimiento para el mayor número de colonias como sea necesario, el cambio de la pipeta de vidrio cada vez.
   Nota: Las colonias de la cosecha puede tomar algún tiempo para aprender. Se recomienda que la práctica experimentador en algunas células de control antes de intentar aislar colonias específicas.
8. Volver placas de 12 pocillos a la incubadora (37 ° C / 3% O _2/5% de CO _2), meciéndose suavemente la placa primero para evitar la acumulación de las células en el medio de cada pocillo.
9. Al día siguiente y cada día subsiguiente, eliminar todo volumen de los medios de comunicación con una pipeta de vidrio y de vacío y reemplazan con 1,5 ml de medio de células madre caliente hasta que las células son aproximadamente el 50% de confluencia (esto tarda generalmente 10-12 días).
10. Después de 10-12 días, elegir uno de dos colonias de cada pocillo y transferir a los nuevos 12 pozos placas MEF repeating pasos 4.1 a 4.8 para generar una placa de réplica.
11. Extracto de ADN (véase a continuación) a partir de las colonias restantes en cada pocillo de las placas MEF originales.
    1. Retire los medios de comunicación de todos los pozos utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Pipeta 1 ml de PBS 1x en cada pozo para lavar las células. Retire PBS con una pipeta de vidrio y de vacío. Pipetear 250 l de tampón de lisis celular (concentraciones finales en H ₂ O: Tris HCl 10 mM, EDTA 5 mM, 0,2% de SDS, NaCl 200 mM, 0,08 mg / ml de proteinasa-K) en cada pocillo. Colocar en incubadora (37 ° C / 3% O _2/5% de CO ₂₎ O / N.
    2. Al día siguiente, los contenidos de cada pocillo de pipeta en tubos de 1,5 ml individuales. Pipetear 250 l de alcohol isopropílico en cada tubo para precipitar el ADN. Agitar el tubo vigorosamente. Un precipitado blanco debe ser visible.
    3. Haga girar cada tubo hacia abajo durante 3 minutos a 13.000 rpm en una centrífuga de mesa. Después de la vuelta abajo, desechar el sobrenadante por decantación en los residuos líquidos. Un pequeño sedimento de ADN debe permanecer pegada al fondo deel tubo. Pipetear 250 l de etanol al 70% en cada tubo para lavar el sedimento de ADN. Agite vigorosamente. Haga girar cada tubo hacia abajo durante 3 minutos a 13.000 rpm en una centrífuga de mesa.
    4. Después de girar hacia abajo, desechar el sobrenadante por decantación en los residuos líquidos. Un pequeño sedimento de ADN debe permanecer pegado a la parte inferior del tubo. Pipetear a cabo el resto del sobrenadante así que no hay líquido que queda en el tubo. Deja tubo abierto a secar en mesa de trabajo durante 5-10 minutos. Después del secado, resuspender el ADN en tampón TE 250 l. Coloca a 37 ° C durante 6 horas para permitir que el ADN se disuelva.
12. Genotipo cada muestra utilizando una estrategia de transferencia de pre-optimizado PCR o el sur.
    Nota:.. Para AAVS1 focalización mediante la plantilla de reparación AAV-CAGGS-EGFP, la estrategia de transferencia de Southern se puede encontrar en Hockemeyer et al, 2009 ⁴ Un protocolo integral transferencia de Southern se puede encontrar en el sur de 2006 ³⁵ Para multiplex PCR genotipificación de. el mismo experimento, cebadores y condiciones pueden serencontrado en la Tabla 2 ^36.
13. Deseche los pozos que no están adecuadamente dirigidos y continuar cambiando los medios de comunicación células madre en células adecuadamente dirigidos todos los días. Congele por las células cuando son aproximadamente el 50% de confluencia, ver más abajo para la congelación de protocolo.
    1. Un día antes de la congelación, cambiar de medios de células madre, la eliminación de los viejos medios de comunicación y la adición de los medios de comunicación de células madre cálidos suplementado con 10 mM Y-27632.
    2. En el día de la congelación preparar 0,5 ml cada una de solución A y la solución B por pocillo de una placa de 12 pocillos que se está congelado en dos tubos cónicos de 15 ml. Soluciones Coloque sobre hielo. Solución A: 50% de células madre medios de comunicación y el 50% de SFB; Solución B: 80% de FBS y 20% dimetilsulfóxido (DMSO).
    3. Disociar colonias HPSC en células individuales antes de la congelación. Siga los pasos 2.2-2.8 para hacer esto, escalando volúmenes en consecuencia. Sedimento celular totalmente resuspender en 0,5 ml de solución A.
    4. Añadir 0,5 ml de solución B a la suspensión de células, la pipeta hacia arriba y abajo para que la suspensión celular homogénea. Take el volumen total de la suspensión de células (~ 1 ml) y depositar en un criotubo 2 ml. Tornillo tapa firmemente.
    5. Lugar criotubo en un congelador a -80ºC O / N. El día después de la congelación, a eliminar las células congeladas de -80 ° C congelador y colocar inmediatamente en el tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

Resultados

Aquí se demuestra un protocolo compatible con tres plataformas SSN diferentes para crear por ingeniería genética líneas HPSC. Nos enfocamos WIBR # 3 células madre de embriones humanos en el locus AAVS1 usando ZFNs publicados anteriormente ^{4, 5} y Talens CRISPR / Cas9s ³⁷ utilizando una plantilla de reparación que introduce un reportero EGFP y un casete de resistencia a puromicina ^4.

Nosotros cultivamos nuestros hPSCs en MEFs para un flujo de trabajo de cultivo celular que permite el mantenimiento y expansión de hPSCs no diferenciadas (Figura 2), que también es rentable y escalable. Si las células se cultivan más de lo necesario, existe el riesgo de un aumento de la diferenciación, lo que reduce el número de células pluripotentes que se transfecta y en consecuencia el número de colonias HPSC correctamente orientados obtenidos.

Nos electropcorporado 5.0 x 10 ⁶ células por plataforma SSN y chapado en las células de cada objetivo en una sola placa de 6 de DR4 MEFs. Después de la selección, cada plataforma resultó en colonias EGFP-positivas (Figura 3) y una combinación de clones no focalizados, homocigótica y heterocigótica específicas dirigidas (Figura 4A, B, Tabla 3). En las condiciones que se presentan aquí, nos encontramos con que la AAVS1 Talens resultó en la mayoría de los clones EGFP-positivas. La plantilla de reparación utilizado para este experimento consiste en un sitio aceptor de empalme aguas arriba del casete reportero y resistencia a la puromicina EGFP. Usando esta estrategia "gen-trampa" (Figura 1), el constructo debe insertar en el primer intrón del locus AAVS1, utilizando el promotor endógeno para conducir la expresión del casete de resistencia a puromicina. La falta de un promotor que dirige la expresión del gen de resistencia a puromicina dentro de la plantilla de reparación debe evitar la expresión en el evento de integración aleatoria.

Por lo tanto, esperamos que todos los clones resistentes a la puromicina se destinarían en el sitio AAVS1. Cabe señalar que un subconjunto de clones llevar integraciones aberrantes en el locus AAVS1 que son detectables por Southern blot utilizando una sonda interna, pero no por la mayoría de las estrategias de PCR (Figura 1; Figura 4C) ^4. Estos eventos de integración son muy probablemente el resultado de acontecimientos dirigidos heterólogos que conducen a múltiples integraciones del plásmido donante ^4. Escogimos 24 colonias de cada experimento SSN y encontró que todas las plataformas tuvieron eficiencias muy altas de focalización y mostraron sólo diferencias mínimas. Como interrogado por PCR, CRISPR / Cas9 dado los clones más correctamente dirigida, mientras que la plataforma TALEN tenía los clones más homocigóticamente específicas (Tabla 3).

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Figura 1. Esquema del gen editado locus AAVS1 utilizando la plantilla de reparación AAV-CAGGS-EGFP. Modificado de Hockemeyer et al., 2009. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Las colonias de células WIBR # 3. Imágenes de campo claro representativos de colonias de WIBR # 3 células madre de embriones humanos antes de la orientación. Tenga en cuenta la falta de diferenciación y la clara separación de la capa de alimentación en una colonia de ideales (izquierda) frente a uno no ideal (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. EGFP-positivas WIBR # 3 células. Imágenes representativas de WIBR # 3 células diana con una plantilla de reparación EGFP-expresión en el locus AAVS1. Imágenes de colonias representativas editadas con ZFNs, Talens y CRISPR / Cas9 se muestran. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. estrategias de genotipado para confirmar la orientación correcta. (A) genotipo resultados Representante de PCR que muestran clones específicos focalizados, heterocigotos y homocigotos en las tres plataformas SSN. WT CTL = control de tipo salvaje. (B) Repreresultados Southern blot representativas que muestran un heterocigoto dirigida clon y un clon objetivo homocigotos detectó con sonda externa a 3 '. Tamaños de los fragmentos: WT-6,5 kb, Editado-6,9 kb. (C) Resultados de Southern blot representativo que muestra un clon correctamente editado y un clon heterocigoto con un doble integración no aleatoria. Tamaños de los fragmentos:. Correctamente editados-6,9 kb, aberrante adicional integración-5 kb Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estudiar	Gen diana	Plataforma	Reparación tipo de plantilla	Nº de clones recogidos	Eficiencia Orientación
Sexton et al., 2014	TPP1	ZFN	GFP-Puro	no declarada
Sexton et al., 2014	De TERT	ZFN	Higromicina	no declarada	no declarada
Hockemeyer et al., 2009	POU5F1	ZFN	GFP-Puro	31	39,0%
Hockemeyer et al., 2009	Pitx3	ZFN	GFP-Puro	74	14,9%
Hockemeyer et al., 2011	POU5F1	TALEN	GFP-Puro	68	91,0%
Hockemeyer et al., 2011	Pitx3	TALEN	GFP-Puro	96	13,0%
Merkle et al., 2015	VASA	Cas9	Reportero-Geneticina	139	94,0%
Merkle et al. </ em>, 2015	CRH	Cas9	Reportero-Geneticina	30	93,0%
Merkle et al., 2015	HCRT	Cas9	Reportero-Geneticina	154	92,0%
Merkle et al., 2015	HMX2	Cas9	Reportero-Geneticina	11	45,0%
Forster et al., 2014	LRG5-Nterm	ZFN	GFP-Puro	no declarada	30,0%
Forster et al., 2014	LRG5-Cterm	ZFN	GFP-Puro	no declarada	14,0%
Soldner et al., 2011	SNCA	ZFN	Puro	96	1,0%

no declarada

Tabla 1. Descripción de otros genes dirigida utilizando este método, con correcorres- focalización eficiencia tomadas de estudios publicados anteriormente. ^4,5,38-41

Lugar	Secuencia	Notas
AAVS1-F imprimación	CTCTAACGCTGCCGTCTCTC	Las condiciones de PCR: T m = 57 ° C, 35 ciclos
AAVS1-WT-R imprimación	GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG	Banda WT: 1.273 pb
AAVS1 Targeted-R-imprimación	CGTCACCGCATGTTAGAAGA	Banda dirigida: 992 pb
T2-Cas9-guía	GGGCCACTAGGGACAGGAT	Malí et al., 2013
AAVS1-ZFN-Derecha	TAGGGACAGGAT	De Hockemeyer et al., 2009
AAVS1-ZFN-Izquierda	TGGGGTGTCACC	De Hockemeyer et al., 2009
AAVS1-TALEN-Derecha	TCCTAACCACTGTCTTT	De Hockemeyer et al., 2011
AAVS1-TALEN-Izquierda	CCCCTCCACCCCACAGT	De Hockemeyer et al., 2011

Tabla 2. Lista de cebadores y SSN secuencias de direccionamiento.

Orientación Construir	Número de EGFP + Colonias	Clones recogidos focalizados (PCR verificado)	Anterior Reportado Eficiencia focalización correcta (por Southern blot)
ZFN	150	86,9% (73,9% het / 13,0% homo)	56% (50% het / 6% homo)
TALEN	412	91,3% (47,8% het / 39,1% homo)	47% (37,5% het / 9,3% homo)
CRISPR-Cas9	235	95,7% (69,5% het / 26,3% homo)	no declarada

Tabla 3. números comparativos de EGFP-positivas y dirigidos TALEN, ZFN y CRISPR / colonias de células madre humanas Cas9. PCR verifican integraciones en el locus AAVS1 para este experimento se comparan con Southern blot verificado integraciones individuales adecuadas en experimentos anteriores ^4,5.

Discusión

El método que aquí se presenta para el aislamiento de poblaciones homogéneas de células madre pluripotentes humanos de genes-editado es un enfoque poderoso para la generación de líneas isogénicas HPSC que se diferencian sólo en el locus diana. Estas células son un sistema ideal para sondear los mecanismos de la diferenciación celular y el desarrollo humanos, así como para la comprensión de la fisiopatología de las enfermedades monogénicas en un entorno genético controlada. Como se ha demostrado aquí, es posible utilizar independientes tres estrategias de diseño SSN (ZFNs, Talens, y CRISPR / Cas9) para lograr la integración dirigida en el locus AAVS1. Cada una de estas metodologías tiene sus propias ventajas y desventajas. Una ventaja potencial de ZFNs y, en cierta medida, Talens es su flexibilidad de diseño, lo que permite la ingeniería iterativo con el fin de mejorar los dominios de nucleasas individuales ⁴² de unión a ADN. Esta optimización nucleasa podría aumentar la especificidad de ZFNs y Talens más allá de lo que se puede lograr con el CRISistema de SPR / Cas9. Tal selectividad puede ser importante para aplicaciones clínicas que requieran un alto grado de especificidad de diana. La ventaja principal del sistema / Cas9 CRISPR es su facilidad de uso. Aunque kits de construcción TALEN y ZFN se han puesto a disposición del público (es decir, a través de Addgene ^21), / SSN basados ​​Cas9 CRISPR son significativamente más fáciles de construir, como la única personalización necesaria es un par de oligonucleótidos 20 base (cuando se utiliza el plásmido px330 diseño de ^14). Esta simplicidad resulta ser ventajoso para los laboratorios de investigación que buscan incluir la edición genoma en sus estudios.

Hay técnicas de transfección alternativos, incluyendo nucleofection ^43, para crear genes editado HPSC líneas; Sin embargo electroporación ha demostrado ser eficaz ^4,5,25 consistente y costo. Nucleofection se puede utilizar para transfectar directamente Cas9-guía complejos de ribonucleoproteínas ARN en el núcleo, el aumento de la eficiencia SSN unad fidelidad ^44. Creciendo hPSCs en MEFs es un método robusto y de bajo costo para mantener hPSCs en un estado pluripotente sin diferenciación excesiva. Además, permite el fácil aislamiento de colonias genéticamente idénticos. Alternativamente, es posible hPSCs de cultivo sin MEFs, sin embargo estas condiciones de cultivo pueden ser más caros que los cultivos basados ​​alimentadoras. Además, todo el proceso es escalable, lo que permite el aislamiento de edición de eventos muy raros o la generación de muchas líneas celulares distintas en experimentos paralelos de edición.

El protocolo descrito aquí es robusto; sin embargo, hay varios pasos clave que afectan a la eficiencia con la que clones editado correctamente se pueden obtener. El componente más crítico para este método es que tiene MEFs de alta calidad y resistentes MEFs DR4 drogas. La supervivencia de hPSCs individuales es tenue, y MEFs baja calidad impedirá el aislamiento de líneas diferenciadas HPSC. En segundo lugar, el uso de Y-27632 es tambiénclave para permitir solo la supervivencia celular sin generar una presión selectiva para las células con un cariotipo anormal ^45. En tercer lugar, recogiendo colonias bien espaciadas garantiza homogeneidad genética de las líneas celulares derivadas. Finalmente, es importante preparar pipetas de vidrio de modo que la abertura es lo suficientemente pequeño para romper la colonia en muchos pedazos más pequeños, asegurando que múltiples colonias crecerán en el nuevo pozo. Esto permite la recogida de subclones bien espaciadas para una placa de réplica para tener en la cultura, dejando la placa original de colonias aisladas para el genotipado. Una parte difícil en este protocolo es el manual tirando de las pipetas de vidrio; esta debe ser practicado de antemano. Cabe señalar que existen múltiples técnicas de picking clon que no requieren una pipeta de vidrio. Se anima a los experimentadores para encontrar el que funciona mejor para ellos.

Existen limitaciones a este protocolo que puede ser superado por modificaciones sencillas. Un experimento destinado a oólo perturbar el lugar de interés sin reparación o aquel cuya reparación plantilla no contiene un casete de selección, debe utilizar otro método de enriquecimiento para las células que fueron editadas. Tenga en cuenta que el número de colonias que deben ser recogidos para encontrar un clon positivo aumenta en gran medida en ausencia de selección. Una estrategia para mejorar la eficiencia es para co-transfectar un plásmido no integrador que expresa una proteína fluorescente. Después de permitir que las células se recuperen durante dos días, las células diana pueden ser ordenados en la fluorescencia positiva utilizando fluorescencia de clasificación de células activadas y replated ^29. Este proceso enriquece para células que han sido transfectadas con los plásmidos por electroporación y por lo tanto aumenta la probabilidad de un evento de edición concurrente en la célula.

Las técnicas descritas aquí se pueden extender para utilizar varios RNAs guía para orientar de forma simultánea varios ^14,46,47 loci. Muchos protocolos se han establecido para diferenciar hPSCsen distintos tipos de células, lo que permite varias manipulaciones genéticas en los tipos de células de interés ^30. En general, hemos demostrado el potencial para la edición genoma eficientes en hPSCs independientemente de la elección SSN. Proponemos que esta técnica se puede adaptar para crear líneas isogénicas HPSC que han sido editados-gen en cualquier locus genómico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12	Life Technologies	11320082
Suero fetal bovino (HI)	Life Technologies	10082-147
Suero knockout	Life Technologies	10828-028
Factor de crecimiento de fibroblastos - básico	Life Technologies	PHG0261
Pluma/Estreptococo	Life Technologies	15140-122
Glutamina	Life Technologies	25030-081
MEM NEAA	Life Technologies	11140-050
2-mercaptoetanol	Life Technologies	21985-023
Y-27632	Calbiochem	688000
Placas de 6 pocillos	Corning	3506
Placas de 12 pocillos	Corning	3512
4 mm Cubetas de electroporación	Bio-rad	165-2081
X-cel gene pulsador II	Bio-rad	165-2661
0,25% Tripsina-EDTA	Life Technologies	25200-056
10× Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH7.4	Life Technologies	70011-044
Puromicina	Life Technologies	A11138-02
Pipetas Pasteur, taponadas	VWR	14672-412
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	S5941
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Proteinasa-K	Life Technologies	AM2544
Etanol	VWR	TX89125-172SFU
Alcohol isopropílico	VWR	MK303216
TE Buffer	Life Technologies	12090-015
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
1.8 ml Tubos criogénicos	ThermoScientific	377267