Summary

CN-GELFrEE - Native נקה ג'ל eluted שבר נוזלי אלקטרופורזה מילכוד

Published: February 29, 2016
doi:

Summary

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

Abstract

קומפלקסי חלבונים לבצע המערה של תפקודים תאיים קריטיים. הבהרת הקישור לא קוולנטי שלהם ודינמיקה היא בעל חשיבות עליונה להבנת תפקידו של מתחמים במערכות ביולוגיות. בעוד האפיון הישיר של מכלולים וביומולקולרית הפך חשוב יותר ויותר בשנים האחרונות, טכניקות חלוקת יליד התואמות טכניקות ניתוח במורד זרם, כוללים ספקטרומטריית מסה, נחוצות כדי להרחיב עוד יותר את המחקרים הללו. עם זאת, השדה חסר שיטת הפרדת תפוקה גבוהה, רחבת היקף גבוהה התאוששות עבור מכלולי חלבון ילידים. כאן, אנו מציגים אלקטרופורזה מלכודת חלק נוזלי eluted ג'ל יליד ברורה (CN-GELFrEE), אשר היא שיטת הפרדת רומן אסיפות חלבון שאינו קוולנטיים. CN-GELFrEE ביצועי הפרדה הודגמו על ידי מתחמי פיצוח שחולצו מן לב עכבר. שברים נאספו מעל 2 hr ומוצגים להקות דיסקרטיות החל ~ 30 כדי 500 kDa. קוןדפוס עולה בקנה אחד של הגדלה רוחבי פס משקל מולקולרי נצפה, כל ~ 100 kDa מנעימים. יתר על כן, הניתוח מחדש הבא של שברי ילידים באמצעות SDS-PAGE הראה-משקל מולקולרי משמר בקנה אחד עם denaturation של קומפלקסי חלבונים. לכן, CN-GELFrEE הוכח להציע את היכולת לבצע הפרדות יליד ברזולוציה גבוהה גבוהה התאוששות על קומפלקסים חלבונים ממגוון משקל מולקולרי גדול, מתן שברים התואמות חלבון במורד הזרם מנתח.

Introduction

רוב התהליכים הביולוגיים קורה בתוך תא נחשבים להתבצע על ידי אסיפות חלבון ולא יחיד חלבונים 1. כתוצאה מכך, על מנת להבהיר את התפקיד ביולוגי הספציפי של למקטע חלבון בתא יש צורך להבין את יחסי הגומלין המבניים שלה עם חלבונים אחרים או הליגנדים מתחמים 2. עם זאת, לומדים חלבונים באופן מקורי, שמירת הקישור לא קוולנטי שלהם ופעילות, נותר מאתגר. אחד החסרונות של מחקרי חלבון יליד הוא טכניקת הפרדת יליד מתאימה התואמת טכניקות ניתוח חלבון במורד שונות. לכן, הריבית האחרונה טכניקות הפרדה מסוגלות מאפיינת מכלולים שאינם קוולנטיים של ביומולקולות גדלה 3 בחדות.

טכניקות הפרדת חלבון הם הכרח ביוכימיה, ביופיזיקה ומחקרים אחרים שונים. יש טכניקות הפרדת יליד נוכחיות intrinsiג ליקויים המפחיתים תאימות עם ניתוחים במורד זרם, כגון ברזולוציה נמוכה, תפוקה נמוכה, אובדן משקע, ואת הדרישה של כמויות גדולות של מדגם ראשוני. טיהור זיקת טנדם היא נפוצה ללימודי אינטראקצית חלבון, אבל זה חייבת להתבצע בנפרד לכל יעד חלבון, גורם לו להיות עולה בקנה אחד עם ניתוח תפוקה גבוהה 4. גודל דרה כרומטוגרפיה 5, ממטרים סלקטיבית עם זיקת יון כרומטוגרפיה 5 וצפיפות-שיפוע הפרדה 6 כל ספקו פרדות ילידים, אבל מטבעם טכניקות ברזולוציה נמוכה ודורשות כמויות מדגם ראשוניות גבוהות.

לחלופין, טכניקות מבוססות ג'ל, כגון כחול שפת אם (BN) ונקה שפת אם (CN) עמוד (או 1-D או 2-D), להציג ההפרדה ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, בניגוד טכניקות אחרות כאמור, הן הפרדות עמוד הילידים לשמור מסיסות קונפורמציה הילידים של r רחבange של מינים מקרומולקולה, כולל חלבונים הידרופובי. יכולת זו עוד מרחיב את הכיסוי proteome הגיע בשיטות אלה 7,8 ו מושגת באמצעות כימיה שונה בין CN ו-PAGE BN. CN-העמוד מסתמך בדרך כלל על חומרי ניקוי רך טעונים כמולקולות מובילות, החלפת צבע Coomassie הכחול-עמוד BN. BN-PAGE, למרות הקשורים ברזולוציה גבוהה יותר, יש אזהרות כגון פעילות האנזימטית מופחתת של חלבונים המופרדים 8 והיווצרות adduct Coomassie מולקולה, שהאחרון קדום רב במורד MS מנתח 9. שתי השיטות הללו, עם זאת, קשורות באופן מסורתי עם התאוששות נמוכה וכיסוי proteome צר עקב מכתים ומגבלות מיצוי ג'ל 7.

לצורך המחקר של חלבונים מפוגלים, ישנן טכניקות כמה מקיימות מסיסות מקרומולקולה בעת ביצוע חלוק ברזולוציה גבוהה עם התאוששות חלבון גבוה התואמות דiverse טכניקות ניתוח חלבון שלאחר ההפרדה. ג'ל eluted נוזלי הפרקציה מילכוד אלקטרופורזה (GELFrEE) היא אחת הטכניקות החלוקות שמתאימות לכל המאפיינים הללו. שיטה זו מיושמת בעיקר במחקרים פרוטאומיקה תפוקה גבוהה מלמעלה למטה, המציין שזה מהיר צדדי. בשנת GELFrEE, חלבונים הם מפוגלים והפרידו מבוססים על משקל מולקולרי באמצעות מטריצת ג'ל צינורי, הנקבובי של אשר ניתן לשנות על פי דרישות מדגם והתוצאות החלוקות הרצויות. שברים הם eluted בשלב נוזל, ובכך להקטין את המגבלות לשחזור משויכות SDS-PAGE, תוך שמירה ברזולוציה גבוהה. Aliquots שבר לאחר מכן ניתן לנתח על ידי עמוד 1-D לבחירת רוחב פס בעל משקל מולקולרי 11. קיים ביקוש גבוה עבור היתרונות הקשורים GELFrEE בטכניקות הפרדה הילידים. השיטה המתוארת במסמך זה, נקה Native GELFrEE (CN-GELFrEE), הוא עיבוד יליד GELFrEE. כדי להיות תואם עם ים רחבpectrum של מקרומולקולות במצב הטבעי שלהם, שיטה זו נשענת לא רק על כימית CN-העמוד הרך, אלא גם על פרדת שיפוע נקבובי, אשר מפחיתה משקעי חלבון על ידי ביטול המעבר הקשה בין porosities הנוכחי במערכות ג'ל רציפות 9. כאשר מוחלים fractionate קומפלקסי חלבונים המופקים לב עכבר, שברי eluted מוצגים התאוששות גבוהה הפרדה גבוהה ברזולוציה של מגוון רחב של משקלות מולקולריים הושגה. יתר על כן, שברים הנובעים תואמים ביותר חלבון ביוכימיות biophysical במורד הזרם מנתח.

Protocol

הערה: פרוטוקול וידאו זה מבוסס על פרסום הקשורים 9. ריאגנטים ספציפיים, חומרים וציוד דרוש כדי לבצע את כל השלבים המתוארים בפרוטוקול זה מפורטים בסעיף החומרים. המתכונים ומידע להכנת כל הפתרונות הנדרשים מפורטים בטבלה 1. 1. מי…

Representative Results

200 מיקרוגרם של חלבונים המופקים לבבות עכבר קרקע בהקפאה היו מופרדים באופן מקורי ל -14 שברים של 150 μl כל, בשיטת CN-GELFrEE בתוך שפופרת ג'ל 1-12% T. Aliquot של 10 μl של כל חלק היה לרוץ על ג'ל לוח CN-עמוד וכסף מוכתם. תיאור ברור של החלוקה והרזולוציה שהושגה עם חלוקת CN-GELFrEE מ?…

Discussion

CN-GELFrEE נגזר יליד ברור (CN) מערכת חיץ עמוד המשתמשת תערובת של anionic ודטרגנטים ניטראלי כמולקולות מובילות 9 עבור חלוקת חלבון בעל משקל מולקולרי מבוססת באמצעות מטריקס ג'ל. היישום של CN-GELFrEE כדי לחלץ חלבון לב עכבר יליד שנוצר שברים מורכבים נמוכים עם רוחבי פס דיסקרטי תוך שמ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

קק קרן סיפקה מימון בנדיבות עבור עבודה זו. חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי מענק מחקר FAPERJ 100.039 / 2014 מהממשלה של ריו דה ז'נרו מדינה – ברזיל עבור RDM, מדע בלי מלגת גבולות 88888.075416 / 2013-00 מן לתיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה, תחת הממשלה של ברזיל, עבור HSS, את מלגת מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע תחת מספר המילגה 2014171659 עבור OSS, ועל ידי מענק מחקר CNPq 202,011 / 2012-7 מממשלת ברזיל עבור LHFDVPCH הוא הנמען של כימיה של החיים של אוניברסיטת Northwestern תהליכים מכון דוקטורים אחוות פרס.

Materials

Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Name Company Catalog Number Comments
Materials
15 mL conical tube Any supplier n/a
30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 mL Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

Referencias

  1. Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
  3. Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  4. Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
  6. Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  7. Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
  8. Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  9. Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
  10. Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
  11. Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
  12. Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).

Play Video

Citar este artículo
Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE – Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

View Video