El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

Carlo A. Beretta; Nicolas Dross; Ulrike Engel; Matthias Carl

doi:10.3791/53604

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Artículo de método

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

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DOI:

10.3791/53604

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5 de febrero de 2016

Carlo A. Beretta¹^,²^,³ , Nicolas Dross² , Ulrike Engel² , Matthias Carl¹

¹Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, ²COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, ³Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

En este artículo

Resumen

Establecimos el sistema fotoconvertible PSmOrange como una herramienta potente, sencilla y económica para el seguimiento de células in vivo en fondos transgénicos GFP. Este protocolo describe su aplicación en el sistema modelo de pez cebra.

Resumen

El rápido desarrollo de embriones transparentes de pez cebra (Danio rerio) en combinación con marcajes fluorescentes de células y tejidos permite visualizar los procesos de desarrollo tal como ocurren en el animal vivo. Las células de interés pueden marcarse mediante el uso de un promotor específico de tejido para impulsar la expresión de una proteína fluorescente (FP) para la generación de líneas transgénicas. El uso de proteínas fotoconvertibles fluorescentes para este propósito también permite seguir con precisión estructuras definidas dentro del dominio de expresión. Al iluminar la proteína en la región de interés, cambia su espectro de emisión y resalta una célula o grupo de células en particular dejando a otras células transgénicas en su color original. Una limitación importante es la falta de promotores conocidos para un gran número de tejidos en el pez cebra. Por el contrario, las cribas trampa de genes y potenciadores han generado enormes recursos transgénicos etiquetando discretamente literalmente todas las estructuras embrionarias, en su mayoría con GFP o, en menor medida, con FP rojos o amarillos. Un enfoque para seguir estructuras definidas en tales contextos transgénicos sería introducir adicionalmente una proteína fotoconvertible ubicua, que podría convertirse en la(s) célula(s) de interés. Sin embargo, las proteínas fotoconvertibles disponibles implican un estado de emisión verde y/o menos frecuentemente rojo¹ y, por lo tanto, a menudo no se pueden utilizar para rastrear células en el fondo FP de las líneas transgénicas existentes. Para evitar este problema, hemos establecido el sistema PSmOrange para el pez cebra^2,3. La simple microinyección de ARNm sintético que codifica una forma nuclear de esta proteína marca todos los núcleos celulares con fluorescencia naranja/roja. Tras la fotoconversión dirigida de la proteína, cambia su espectro de emisión a rojo lejano. La eficiencia cuántica y la estabilidad de la proteína hacen de PSmOrange una excelente herramienta de seguimiento celular para el pez cebra y posiblemente otras especies de teleósteos.

Introducción

La mejora exponencial de las técnicas de imagen permite seguir los procesos de desarrollo durante períodos de tiempo de hasta unos cuatro días consecutivos³. En el pez cebra y en muchos otros sistemas de modelos animales, células, tejidos, estructuras axonales o vasculares específicas están marcadas por proteínas transgénicas verdes o, a veces, rojas o amarillas fluorescentes para facilitar la visualización. Sin embargo, en la mayoría de las líneas transgénicas, el transgén no se expresa específicamente en las células de interés, sino también en estructuras adicionales, lo que dificulta el seguimiento preciso de, por ejemplo, células individuales o grupos d....