Artículo de método

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

DOI:

10.3791/53604

⸱

5 de febrero de 2016

 ,  ,  , 
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

En este artículo

Resumen

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Establecimos el sistema fotoconvertible PSmOrange como una herramienta potente, sencilla y económica para el seguimiento de células in vivo en fondos transgénicos GFP. Este protocolo describe su aplicación en el sistema modelo de pez cebra.

Resumen

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El rápido desarrollo de embriones transparentes de pez cebra (Danio rerio) en combinación con marcajes fluorescentes de células y tejidos permite visualizar los procesos de desarrollo tal como ocurren en el animal vivo. Las células de interés pueden marcarse mediante el uso de un promotor específico de tejido para impulsar la expresión de una proteína fluorescente (FP) para la generación de líneas transgénicas. El uso de proteínas fotoconvertibles fluorescentes para este propósito también permite seguir con precisión estructuras definidas dentro del dominio de expresión. Al iluminar la proteína en la región de interés, cambia su espectro de emisión y resalta una célula o grupo de células en particular dejando a otras células transgénicas en su color original. Una limitación importante es la falta de promotores conocidos para un gran número de tejidos en el pez cebra. Por el contrario, las cribas trampa de genes y potenciadores han generado enormes recursos transgénicos etiquetando discretamente literalmente todas las estructuras embrionarias, en su mayoría con GFP o, en menor medida, con FP rojos o amarillos. Un enfoque para seguir estructuras definidas en tales contextos transgénicos sería introducir adicionalmente una proteína fotoconvertible ubicua, que podría convertirse en la(s) célula(s) de interés. Sin embargo, las proteínas fotoconvertibles disponibles implican un estado de emisión verde y/o menos frecuentemente rojo1 y, por lo tanto, a menudo no se pueden utilizar para rastrear células en el fondo FP de las líneas transgénicas existentes. Para evitar este problema, hemos establecido el sistema PSmOrange para el pez cebra2,3. La simple microinyección de ARNm sintético que codifica una forma nuclear de esta proteína marca todos los núcleos celulares con fluorescencia naranja/roja. Tras la fotoconversión dirigida de la proteína, cambia su espectro de emisión a rojo lejano. La eficiencia cuántica y la estabilidad de la proteína hacen de PSmOrange una excelente herramienta de seguimiento celular para el pez cebra y posiblemente otras especies de teleósteos.

Introducción

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La mejora exponencial de las técnicas de imagen permite seguir los procesos de desarrollo durante períodos de tiempo de hasta unos cuatro días consecutivos3. En el pez cebra y en muchos otros sistemas de modelos animales, células, tejidos, estructuras axonales o vasculares específicas están marcadas por proteínas transgénicas verdes o, a veces, rojas o amarillas fluorescentes para facilitar la visualización. Sin embargo, en la mayoría de las líneas transgénicas, el transgén no se expresa específicamente en las células de interés, sino también en estructuras adicionales, lo que dificulta el seguimiento preciso de, por ejemplo, células individuales o grupos de células.

Las proteínas fotoconvertibles fluorescentes son muy adecuadas para el seguimiento celular durante el desarrollo embrionario. Los requisitos previos para la aplicación de tales proteínas son una naturaleza de larga vida, un rango de emisión bien separado en el momento de la conversión y una fluorescencia brillante. Las proteínas fotoconvertibles disponibles comprenden aquellas que cambian su rango de emisión tras la conversión, como Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 o Dendra27 y otras que solo son fluorescentes cuando se fotoactivan (PAmCherry8, PAGFP9 o PATagRFP10). Sin embargo, sus aplicaciones para rastrear células en animales transgénicos PF existentes son limitadas, ya que a menudo implican un estado fluorescente verde o no cumplen todos los criterios anteriores. Recientemente, Subach y sus colegas informaron de la proteína PSmOrange, que cambia su emisión de naranja/rojo a rojo lejano tras la fotoconversión y se aplicó con éxito en células en cultivo y células cultivadas inyectadas en ratones2.

Para investigar la idoneidad de la proteína para el seguimiento celular en un embrión vivo, generamos una construcción de expresión para la microinyección de H2B-PSmOrange marcado nuclearmente en embriones de pez cebra. Descubrimos que la proteína cumple con todos los requisitos previos para un seguimiento celular exitoso en fondos transgénicos GFP durante los primeros 4 (y posiblemente más) días del desarrollo embrionario del pez cebra. Durante este tiempo, la mayoría de los eventos migratorios de células se completan en los peces, lo que hace que el sistema PSmOrange sea una excelente adición al conjunto de herramientas del pez cebra.

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Protocolo

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1. H2B-PSmOrange mRNA Transcripción in vitro y de purificación de ARNm

  1. Linealizar el H2B-PSmOrange contiene pCS2 + plásmido usando la enzima de restricción NotI de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    Nota: Realice los siguientes pasos utilizando protecciones apropiadas, tales como guantes y bata de laboratorio para evitar la contaminación y la degradación del ARNm.
  2. Se purifica el ADN linealizado utilizando un kit de purificación de los métodos basados ​​en fenol-cloroformo o PCR de acuerdo con protocolos de los fabricantes.
  3. Usar 1 mg de ADN plantilla linealizado para Sp6-mRNA transcripción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Eliminar el ADN mediante la adición de 1,0 U de RNasa libre de DNasa I durante 10-20 min a 37 ° C.
  5. Limpiar el ARNm utilizando una ARN kit de limpieza de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  6. Para aumentar la pureza y la concentración de ARNm, precipitar el ARNm mediante la adición de acetato de 6 l de sodio (3,0 M, pH 5,2) y 150 l 96% de etanol. Incubar la msolución ixed a -20 ° C durante al menos 30 min y hasta 24 hr.
  7. Recoger el mRNA haciendo girar la solución a 18.407 xg durante 45 min a 4 ° C. Desechar el líquido y resuspender el ARNm en 150 l de 70% de etanol. Mezclar y centrifugar la solución para un 15 minutos adicionales a 4 ° C. Desechar el líquido, secar el sedimento durante 5 minutos en hielo y volver a suspender el ARNm en 20 ultrapura l RNasa libre de agua.
  8. Evaluar la concentración y la pureza del mRNA por medición fotométrica de una dilución 1: 100 de ARNm (ARNm 1 l en 99 l ultrapura RNasa libre de agua).
  9. Para el almacenamiento a corto plazo, mantener la solución de ARNm a -20 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener el ARNm a -80 ° C.

2.-H2B PSmOrange ARNm microinyección en embriones de pez cebra

  1. Configurar el apareamiento pares de la noche antes de la inyección utilizando tg (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) de pescado transgénico doble (o cualquier otro pez transgénico GFP). Deja a los peces separados por colocar un espaciadorentre ellos para controlar el tiempo de apareamiento.
  2. Retire el separador de la mañana de la inyección y dejar que el compañero de pescado durante 20 minutos.
  3. Durante el tiempo de apareamiento, diluir el ARNm H2B-PSmOrange a la concentración final de 130 pg / nl (en RNasa libre de agua) y la transferencia de 6 l de solución inyectable en un capilar de microinyección con una punta de microloader. Compruebe el volumen de inyección con un portaobjetos de vidrio calibrado. Ajustar la presión de inyección para inyectar solución 2 mRNA nl (260 pg).
  4. Recoger los huevos en una placa de Petri de plástico esterilizada que contiene embriones 1x (E3) medio.
  5. Transferir 20 a 30 embriones a un plato de inyección usando una pipeta de plástico pasteur.
  6. Inyectar 2 mRNA nl solución en la célula o justo por debajo de la celda que contiene en la yema en el estadio de una célula 11.
  7. Transferencia de embriones inyectados en una placa de Petri que contiene medio 1x E3, eliminan embriones fertilizados se desarrollan con normalidad o no crecen y ellos a 28 ° C.
    Nota: Protección contra la luz of los embriones no se requiere durante todo el experimento.
  8. Elevar embriones de pez cebra en medio 1x E3 y añadir PTU 0,2 mM (1-fenil-2 tiourea) después de la gastrulación para inhibir la pigmentación. Cambiar el medio dos veces por día para reducir al mínimo el peligro de contaminaciones bacterianas.

3. Incorporación de embriones

  1. Seleccione la GFP (verde) y PSmOrange co-expresión de los embriones (naranja / rojo) usando un microscopio binocular equipado con una lámpara de fluorescencia y filtros de emisión adecuadas. La transferencia de los embriones positivos en una placa de Petri estéril que contiene el medio 1x E3.
  2. Embriones Dechorionate bajo un microscopio estereoscópico con fórceps 12.
  3. Transferencia de un embrión en un tubo de 1,5 ml que contiene 1,0 ml de pre-calentado 1,0% de agarosa de bajo punto de fusión (LMA) preparada en agua ultrapura mediante el uso de una pipeta de punta de corte (P200). Nota: Se calienta la LMA a 80 ° C y enfriar durante 3-5 minutos a temperatura ambiente antes de clavarse el embrión.
  4. Transferir el embrión en 150 l MLA en unacámaras cubreobjetos y ajustar la orientación del embrión, por ejemplo, el lado dorsal hacia abajo en el experimento descrito para la invertida láser confocal de barrido microscopio A1R + (o cualquier otro microscopio adecuado), usando una punta de plástico fino. Cuando la MLA se polimeriza, llenar la cámara con agua que contiene el pescado PTU 0,2 mM y 0,02% de acetato de 3-aminobenzoato metanosulfonato (Tricaína) para la anestesia.
  5. Antes de obtener imágenes de la muestra, esperar 15 minutos para determinar el efecto de Tricaína. La anestesia evita los movimientos de embriones, que pueden ser monitorizados mediante un microscopio estereoscópico equipado con iluminación de campo claro.
    Nota: Las cámaras se pueden reutilizar dos veces.

4. PSmOrange Fotoconversión

  1. Colocar la muestra bajo el microscopio confocal y escanear la muestra para identificar el área a photoconvert usando 488 nm y 561 nm láser para la formación de imágenes GFP y PSmOrange respectivamente.
    Nota: Utilice la invertida microscopio confocal de barrido láser A1R + de la sta invertidage TiEcontrolled por el software de imágenes de microscopio y equipada con 488 nm, 561 nm y 640 nm para los láseres de fotoconversión y de imagen. Sin embargo, la aplicación es, sin duda no se limita a este microscopio siempre que las líneas de láser para la conversión y de formación de imágenes están disponibles.
    1. Ponga el objetivo 20X de aire en su lugar (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
    2. Utilice los siguientes ajustes del microscopio para detectar la proteína PSmOrange antes de fotoconversión: 561 nm láser, 0,74 mW medida en el plano de enfoque por encima del objetivo.
      Nota: Esto corresponde a 40% en este sistema (medición en el plano de enfoque es la única manera de determinar la potencia efectiva). Ajustar la potencia del láser de acuerdo con las necesidades experimentales como la eficacia de las inyecciones de H2B-PSmOrange puede variar.
    3. Añadir un factor de zoom para resaltar el área de interés. ampliaciones más altas reducen el tiempo de adquisición de imágenes y, por tanto, la fototoxicidad.
  2. Adquirir un z-pila que cubre la estructuras de interés utilizando 488 nm y 561 nm láseres en modo secuencial (modo de línea 1-> 4). Z fijar el paso entre 1,0 y 2,0 micras. promedio de la línea y la frecuencia de exploración se pueden utilizar para optimizar la calidad de la imagen.
  3. Analiza la muestra y seleccionar la región de la herramienta de interés (ROI) para resaltar el área de photoconvert. Fijar el retorno de la inversión como zona de estimulación. Seleccione el módulo de fotos de activación / Blanqueamiento, activar el láser de 488 nm marcando la casilla respectiva y ajustar el láser de 488 nm a 80% (potencia del láser 1 mW medida en el objetivo). Ajuste la velocidad de barrido a 0,5 seg / marco.
  4. Abra la utilidad de fotoconversión (ND estimulación) y especificar la configuración de fotoconversión.
    1. Haga clic en el comando "Añadir" para especificar el protocolo de fotoconversión.
    2. Set "Fase" 1 en el menú "Adquisición / Estimulación" a la "adquisición" e indicar el número de imágenes que se adquirió antes de fotoconversión en el menú de "bucles".
    3. Ajuste "Fase" 2 a "St.imulation "e introduzca el número de eventos de estimulación a realizar.
    4. Ajuste "Fase" 3 como se describe para la "Fase" 1. Si lo desea, introduzca una espera "Fase" después de "Fase" 2 se introduce el tiempo de espera antes de la última ronda de adquisición de imágenes.
    5. Una vez establecidos todos los parámetros, aplicar el ajuste de la estimulación y ejecutar la fotoconversión.
      Nota: la potencia del láser, la frecuencia de exploración y el número de iteraciones para cada ronda de fotoconversión puede variar y diferir de embrión a embrión. Un entorno para empezar se muestra en la Tabla 1.
  5. Adquirir una pila Z final utilizando 488 nm, 561 nm y 640 nm láseres que aplican los ajustes que el anterior. Ajuste el láser de 640 nm para la visualización del PSmOrange convertido mediante láser de potencia alta (hasta 4,5 mW).

5. Desmontar el embrión a partir de LMA

  1. Extraer el embrión que contiene la cámara del microscopio. Retirar con cuidado el embrión de la U de agarosacantar fórceps.
  2. Transferir el embrión en un nuevo plástico esterilizada placa de Petri o en una de 6 pocillos de la placa esterilizada que contiene 1x E3 y PTU 0,2 mM. Incubar el embrión a 28 ° C hasta la etapa de desarrollo deseado.

6. Analizar el destino de Photoconverted PSmOrange células que expresan la proteína

  1. Vuelva a insertar el embrión como se describe en los puntos 3.3 y 3.4.
  2. Colocar la muestra bajo el microscopio confocal y escanear la muestra para identificar células photoconverted (640 nm) en la estructura transgénico GFP de interés (488 nm).
  3. Adquirir un z-pila que cubre las estructuras de interés usando 488 nm, 561 nm y 640 nm láseres en modo secuencial (modo de línea 1-> 4). Z fijar el paso entre 1,0 y 2,0 micras. promedio de la línea y la frecuencia de exploración se pueden utilizar para optimizar la calidad de la imagen.
  4. Utilice uno de los siguientes métodos para identificar células que co-expresan GFP y la proteína photoconverted.
    1. automática por encargo Fiji ImagenJ 3 Macro
      1. Convolve la pila original usando el plugin "desenfoque gaussiano" (Proceso → → → Filtros desenfoque gaussiano) y restar las pilas lisas de la original utilizando el plug-in "Calculadora de imagen" (→ Proceso → Calculadora de imagen). Utilice este paso para visualizar las estructuras de interés y reducir el tiempo de cálculo para el análisis.
      2. Aplicar umbrales específicos a los canales verde y rojo lejano con el fin de resaltar las células photoconverted (→ Imagen → Ajustar → Umbral). Utilice la herramienta de "Analizar Partículas" para detectar las zonas de umbral con un ajuste adecuado (→ → Analizar Analizar Partículas).
      3. Abrir el plugin "Calculadora de imagen" y mostrar las regiones de interés se superponen en el canal verde y rojo lejano en (→ Proceso → Calculadora de imagen) de color amarillo.
    2. software de imágenes del microscopio para la evaluación de datos 3D
      1. Mostrar la pila de3D utilizando la opción de vista show de volumen (3D → Menú de visualización → Mostrar vista de volumen). Utilice la interfaz gráfica para seleccionar los canales verde, rojo y rojo lejano, ajustar el brillo y el contraste y recortar la pila 3D para resaltar el área photoconverted (Figura 1).
        Nota: métodos similares para analizar los datos están disponibles en la mayor parte del software común para el análisis de imágenes.

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Resultados

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La Figura 1 ilustra un ejemplo del sistema de PSmOrange fotoconversión. El complejo pineal es una estructura conservada en el diencéfalo dorsal de los vertebrados. Como en muchos otros vertebrados, este complejo formado por el órgano pineal en el centro del diencéfalo y las células parapineal del lado izquierdo. Elegantes, pero que consumen mucho tiempo uncaging experimentos mostraron que las células parapineal se originan en la parte anterior del órgano pineal 13.<...

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Discusión

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embriones transgénicos portadores de reporteros fluorescentes han contribuido fundamentalmente para entender el desarrollo embrionario. Sin embargo, todavía existe la necesidad esencial de promotores para facilitar la visualización específica de estructuras particulares. En su ausencia, los investigadores se basan en técnicas tales como la fotoconversión de las proteínas fluorescentes para obtener información sobre el origen y desarrollo de su estructura de interés. Esto a su vez es un requisito previo fundamental para ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a O. Subach por proporcionar el plásmido H2B-PSmOrange original y a nuestro equipo de instalaciones de peces para el cuidado de los peces. Agradecemos al Centro de Imágenes Nikon de la Universidad de Heidelberg por el acceso a los equipos de microscopía y al software de análisis. Agradecemos el apoyo del Core Facility Live Cell Imaging Mannheim en el CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Este trabajo contó con el apoyo de Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Coordinación espacio-temporal de procesos de señalización (EcTop 2), de la Universidad de Heidelberg al C.A.B. y de la Facultad de Medicina de Mannheim de la Universidad de Heidelberg y la DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 y 298/6-1) al M.C.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de purificación de PCRQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripciónAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Kit de limpiezaQiagen74204
Plástico Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlásmidoAddgene31920El plásmido descrito en el artículo es disponible en el Carl lab
Microinyector FemtoJetEppendorf5247 000.013
Pinzas (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH AlemaniaNo Número
Nikon PLAN Apo λ Objetivo aéreo 20X Nikon GmbH AlemaniaSin número
AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Alemania/Imágenes de laboratorioSin número
NIS Elements

Referencias

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