Usando Tomoauto: Un protocolo para la de alto rendimiento automatizado tomografía crioelectrónica

Summary

Se presenta un protocolo sobre cómo utilizar la crio-tomografía electrónica de alto rendimiento para determinar alta resolución en las estructuras in situ de máquinas moleculares. El protocolo permite que grandes cantidades de datos a procesar, evita los cuellos de botella comunes y reduce el tiempo de inactividad de los recursos, lo que permite al usuario centrarse en cuestiones biológicas importantes.

Abstract

La tomografía crioelectrónica (Cryo-ET) es una poderosa técnica de imagen tridimensional (3-D) para visualizar complejos macromoleculares en su contexto nativo a nivel molecular. La técnica consiste inicialmente en preservar la muestra en su estado nativo congelando rápidamente la muestra en hielo vítreo, luego recolectar una serie de micrografías desde diferentes ángulos a gran aumento y, finalmente, reconstruir computacionalmente un mapa de densidad en 3D. El espécimen congelado e hidratado es extremadamente sensible al haz de electrones, por lo que las micrografías se recogen a dosis muy bajas de electrones para limitar el daño por radiación. Como resultado, el criotomógrafo en bruto tiene una relación señal/ruido muy baja, caracterizada por una imagen intrínsecamente ruidosa. Para visualizar mejor los sujetos de interés, se utilizan el análisis de imágenes convencional y el promedio de subtomografías, en los que se extraen subtomografías del sujeto de la tomografía inicial y se alinean y promedian para mejorar tanto el contraste como la resolución. Los grandes conjuntos de datos de series de inclinación son esenciales para comprender y resolver los complejos en diferentes estados, condiciones o mutaciones, así como para obtener una colección lo suficientemente grande de subtomogramas para promediar y clasificar. La recopilación y el procesamiento de estos datos pueden ser un obstáculo importante que impida un análisis posterior. Aquí describimos un protocolo crio-ET de alto rendimiento basado en un microscopio crioelectrónico de 300 kV controlado por computadora, una cámara de dispositivo de detección directa (DDD) y una biblioteca de software de envoltura de tubería de procesamiento de imágenes semiautomatizada altamente efectiva desarrollada internamente por TomoRt. Este protocolo se ha utilizado eficazmente para visualizar el sistema de secreción de tipo III (T3SS) intacto en minicélulas de Shigella flexneri. Puede ser aplicable a cualquier proyecto apto para crio-ET.

Introduction

Tipo III sistemas de secreción (T3SS) son determinantes de virulencia esenciales para muchos patógenos Gram-negativas. El injectisome, también conocido como el complejo de la aguja, es la máquina T3SS centro requerida para la translocación directa de proteínas efectoras de la bacteria en las células huésped eucariotas ^{1, 2.} El injectisome comprende una aguja extracelular, un cuerpo basal, y un complejo citoplásmico también conocida como el complejo de clasificación ^3. Estudios previos han dilucidado estructuras 3-D de injectisomes purificados de Salmonella y Shigella, junto con las estructuras atómicas de las principales proteí....

Protocol

1. Preparación Minicell

1. Para hacer S. minicélulas flexneri, transforman 1 l de plásmido pBS58, que expresa constitutivamente genes de división celular de Escherichia coli ftsQ, FtsA y FtsZ desde un mínimo de copias espectinomicina resistentes plásmido en 5 l electrocompetente estreptomicina resistentes serotipo 5 bis (M90T-Sm) células por electroporación a 2,5 kV durante 5 ms en 1 cubetas mm.
2. Almacene las muestras minicélula a -80 ° C en glicerol al 15% en un 1,5 ml microtubo criogénico. Cuando esté listo para su uso, raspar aproximadamente 5 l de células de la microtubo unthawed utilizando una punta d....

Results

Las muestras de minicélulas S. flexneri fueron recogidos y tratados como se muestra en la figura esquemática 1 utilizando tomoauto siguiendo la tubería se detalla en la figura 2. Inclinación de la serie se recogieron usando SerialEM ^10, que permite la adquisición de inclinación de la serie de alto rendimiento en los puntos designados por el usuario en los mapas de montaje de baja ma.......

Discussion

El alto rendimiento método descrito aquí nos permitió procesar 1,917 crio tilt-serie y producir más de 4.500 sub-tomografías del S. intacta flexneri injectisome ^19. Los datos obtenidos llevaron a la caracterización detallada de en injectisome situ, incluyendo el citoplasmática de clasificación compleja. El método también se utilizó para visualizar varias células mutantes con deleción específica de los componentes de proteína putativa, que ayudó a dilucidar la compo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glicerol	Sigma-Aldrich	G9012
Caldo de soja Tyrptic	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Aparato de electroporación	Bio-rad	165-2100
1 mm Cubeta	BTX	45-0124
1,5 ml Tubo criogénico	Thermoscientific	5000-1020
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Rejillas de carbono	Quantifoil (Ciencias de la Microscopía Electrónica)	Q2100CR2	R2/2 Dispositivo
descarga incandescente	comercial interna		disponible
Desecador de vacío	Sigma-Aldrich Z119016		Utilizado en el dispositivo de descarga de brillo interno
Generador de alta frecuencia	Productos electrotécnicos	BD-10A	utilizados en el dispositivo de descarga incandescente interno. PRECAUCIÓN: Este dispositivo genera altos voltajes.
Pinzas de centrífuga
	Dumont (Ciencias de la Microscopía Electrónica)	72705-D	Estilo 5 Oro Colional
Antimagnético	Aurion		BSA 10nm
Papel de filtro	Whatman		#2
Etano	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrógeno	Matheson Tri-Gas	UN1977
Dispositivo de émbolo	comercial interna		disponible
Caja de almacenamiento de red criogénica	de la Microscopía Electrónica 71166-30
Microscopio electrónico de transmisión	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Dispositivo de detección directa Cámara	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM alternativas: Tomografía UCSF, Leginon, Tomografía por lotes FEI
Software de corrección de movimiento inducido por haz	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html requiere >2 GB de GPU
	Nvidia Software de alineación de la serie TiltAlternativas a http://bio3d.colorado.edu/IMOD IMOD		: XMIPP, Protomo
Software de modelado automático de marcadores fiduciales	a IMOD		: RAPTOR (incluido en IMOD0 (utilizable en tomoauto)
Software de determinación CTF	a IMOD		: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Utilizable en tomoauto)
Software de reconstrucción de la serie	Tilt Tomo3D		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternativas: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Software de procesamiento automatizado de la serie Tilt	https://github.com/DustinMorado/tomoauto tomoauto
	i3		http://www.electrontomography.org Alternativas: IMOD
Software de promediado de subvolúmenes	Alternativas a i3		: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org