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Artículo de método

La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas

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DOI:

10.3791/53613

25 de abril de 2016

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo basado en la detección inmunohistológica de proteínas c-FOS, una técnica clásica utilizada para la identificación de poblaciones neuronales involucradas en respuestas fisiológicas específicas in vivo y ex vivo.

Resumen

Muchos estudios tratan de identificar y mapear las regiones del cerebro implicadas en las regulaciones fisiológicas específicas. Los c-fos proto-oncogén, un gen temprano inmediato, se expresa en neuronas en respuesta a diversos estímulos. El producto de proteína se puede detectar fácilmente con técnicas inmunohistoquímicas que conducen a la utilización de la detección de c-FOS para mapear grupos de neuronas que muestran cambios en su actividad. En este artículo, nos hemos centrado en la identificación de poblaciones neuronales del tronco cerebral implicados en la adaptación ventilatoria a la hipoxia o hipercapnia. Se describieron dos enfoques para identificar poblaciones neuronales implicadas en vivo en animales y ex vivo en las preparaciones del tronco cerebral deafferented. En vivo, los animales fueron expuestos a mezclas de gases con hipercapnia o hipoxia. Ex vivo, preparaciones deafferented fueron perfundidas con hipoxia o hipercapnia líquido cefalorraquídeo artificial. En ambos casos, ya sea de control o en los animales in vivo ex preparaciones in vivo se mantuvieron en condiciones de normoxia y normocápnicos. La comparación de estos dos enfoques permite la determinación del origen de la activación es decir, neuronal, periférico y / o central. In vivo y ex vivo, se recogieron brainstems, se fijaron, y cortados en secciones. Una vez que se prepararon secciones, la detección inmunohistoquímica de la proteína c-FOS se hizo con el fin de identificar los grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos hipóxicos o hipercapnia. Las células marcadas se contaron en estructuras respiratorias del tronco cerebral. En comparación con la condición de control, la hipoxia o hipercapnia aumentado el número de células marcadas c-fos en varios sitios del tronco cerebral específicas que son, pues, constitutiva de las vías neuronales implicados en la adaptación de la unidad central de la respiración.

Introducción

El gen c-fos se identificó por primera vez a principios de 1980 1,2 y su producto se caracterizó en 1984 como una proteína nuclear que tiene propiedades de gen activador de 3,4. Participa en los mecanismos a largo plazo asociados con la estimulación de las neuronas. De hecho, los cambios en la actividad neuronal conducen a segundo mensajero de señalización cascadas que inducen la expresión del gen temprano inmediato c-fos, que induce la producción del factor de transcripción c-FOS. Este último inicia la expresión de los genes tardíos y por lo tanto participa en las respuestas de adaptación del sistema nervioso a muchos tipos di....

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Protocolo

Nota: La detección de c-fos es un procedimiento normalizado que implica varios pasos (Figura 1). Todos los experimentos se realizaron en ratas o ratones. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en el experimento con animales Charles Darwin (ce5 / 2011/05), realizado de conformidad con la Directiva del Consejo Comunidades Europeas de 22 de septiembre, 2010 (2010/63 / UE) para el cuidado de los animales, y realizarse de conformidad con las leyes francesas para el cuidado de animales.

1. Preparación de soluciones

  1. Preparar tampón de fosfato de sodio 0,2 M: añadir 6,24 g de NaH 2

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Resultados

La detección de c-fos es una herramienta útil que permite la identificación de grupos de células activadas en condiciones específicas, tales como la hipoxia e hipercapnia vivo (Figura 2A) en o en situaciones que imitan estas condiciones ex vivo (Figura 2 B). En vivo, recién nacido, joven , o roedores adultos se colocaron en una caja hermética en que el medio gaseoso es continuamente renovada por una mezcla de gases con.......

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Discusión

C-fos es un gen temprano inmediato, y la detección de su producto, la proteína c-FOS, se utiliza clásicamente para identificar poblaciones neuronales implicados en las respuestas respiratorias específicas in vivo y ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33.

Los pasos críticos dentro del protocolo

Tenga cuidado durante la etapa de perfusión. La solución PFA 4% debe estar bien preparado y.......

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La Universidad Paris 13 apoyó este trabajo. La ASPT contó con el apoyo de una beca de la Universidad Paris 13 y de la "Association Française pour le Syndrome d'Ondine". FJ contó con el apoyo de una beca GR-Ex del Laboratorio de Excelencia. El GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) está financiado por el programa "Investissement d'avenir" de la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ref ANR-11-IDEX-0005-02).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de cultivo celular 12 pocillosCosta35/3
15 mm Insertos Netwell con malla membranade poliéster Corning3477Los insertos de pocillos de 15 mm de diámetro tienen 74µ m Fondos de malla de poliéster unidos a inserciones de poliestireno
Anticuerpo primario (anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-Fos)Santa Cruz Biotechnologysc-52
Vectastain Elite ABC KIT Laboratorios de vectoresPK-6101
(Anticuerpo secundario IgG de conejo)
NaH2PO4*2H2OSigma71505
Na2HPO4SigmaS7907
ParaformaldehídoSigmaP6148
NaOH 0.1NSigma43617
Polivinilo-PirrolidonaSigmaPVP-360
SacarosaSigmaS7903
NaClSigmaS7653
EtilenglicolSigma33068
Triton X100SigmaT8787
Trisma HClSigmaT5941
Trisma BaseSigmaT1503
3.3-diaminobenzidina tetraclorhidrato  RocklandDAB50
Sulfato de níquel y amonioAlfa Aesar12519
H2O2SigmaH1009
XilenoSigma33817
Entellan NeoMerck Millipore107961
Slide Thermo-scientific1014356190Superfrost ultraplus
Cubierta de vidrioThermoscientific Q10143263NR124 x 60mm
BSASigmaA2153

Referencias

  1. Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
  2. Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M.

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Reimpresiones y permisos

Etiquetas

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