Artículo de método

Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa

8.3K vistas

⸱

DOI:

10.3791/53624

⸱

10 de marzo de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

En este artículo

Resumen

Para estudiar el mecanismo de utilización de lípidos en las membranas del saco vitelino durante las últimas etapas del desarrollo embrionario de las aves, establecimos un sistema primario de cultivo de células epiteliales endodérmicas embrionarias de codorniz japonesa.

Resumen

Hemos establecido un modelo de cultivo de células epiteliales endodérmico (CEE) para el estudio de la función de ciertas enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por los embriones de aves durante el desarrollo. Fertilizados huevos de codorniz japonesa se incubaron a 37 ° C durante 5 días y luego la yema se recogieron membranas de la bolsa (YSM) para establecer el sistema de cultivo CEE. Se aislaron la capa endodermo embrionario de YSM, y en rodajas la membrana en 2 - 3 mm piezas y se digirió parcialmente con colagenasa antes de la siembra en placas de cultivo de 24 pocillos. El EECs proliferan fuera del tejido y están listos para estudios de cultivo celular. Hemos encontrado que la EECs tenía características típicas de YSM in vivo, por ejemplo, la acumulación de gotitas de lípidos, esteroles expresión de O-aciltransferasa y la lipoproteína lipasa. El tratamiento de digestión parcial aumentó significativamente la tasa de éxito de la cultura CEE. Utilizando el EECs, hemos demostrado que la expresión de SOAT1 estaba regulado por el cAMP dependent proteína quinasa A vía relacionada. Este sistema de cultivo de codorniz japonesa CEE primaria es una herramienta útil para estudiar el transporte de lípidos embrionario y para aclarar el papel de los genes implicados en la mediación de la utilización de nutrientes en los ADM durante el desarrollo embrionario aviar.

Introducción

El principal recurso alimenticio del embrión aviar es yema de huevo, compuesta de 33% de lípidos, 17% de proteína, y 1% de cenizas. 1 Durante el desarrollo embrionario, la membrana del saco vitelino (YSM) crece de dentro de la cavidad abdominal embrionario y cubre gradualmente la yema superficie. Comenzando en el día embrionario 2, la expresión de genes asociados con el metabolismo de los lípidos y la angiogénesis se incrementa gradualmente en YSM, y el YSM se desarrolla lentamente proyecciones vellosidades como 8,9. Estas proyecciones aumentan la absorción de los nutrientes de la yema para apoyar el desarrollo embrionario. El YSM es un tejido extraembrionario que contiene tres capas germinales, el endodermo, mesodermo y ectodermo. 14 del ectodermo del saco vitelino se enfrenta a la albúmina y enlaces con la membrana vitelina para cubrir suavemente el saco vitelino. Las células epiteliales del endodermo se enfrentan directamente hacia la yema de huevo y sirven como portales de utilización de nutrientes. 6 A medida que se expande la YSM, células epiteliales endodérmico (EEC) puede ser dividido por Shapcorreo y funcionalidad en dos grupos, el área de vitelina y vascular del área. 7

vitelina Area se compone de células endodérmicas y está distante del embrión; área vasculosa se compone de células mesodérmicas y cubre EECs diferenciados con vasos sanguíneos y tejidos conectivos. Por el día embrionario 5, la yema está totalmente cubierto por el ectodermo y el endodermo de YSM y el área vascular ha crecido rápidamente. El YSM absorbe, recompone y libera lípidos (como yema de derivados de lipoproteínas de muy baja densidad) y las proteínas en el sistema circulatorio embrionario. 9, 2 Por lo tanto, se estableció una codorniz sistema de cultivo celular primario japonés embrionario endodérmico epitelial, para estudiar los mecanismos de lípidos utilización en YSM durante el desarrollo embrionario aviar.

Lípidos tales como triacilglicerol, lecitina, fosfolípidos y ésteres de colesterol (CE) son las fuentes primarias de energía para los embriones de aves. En las primeras etapas de desarrollo, lípidos de la yema son composed de sólo el 1,3% del CE y se eleva al 10-15% a medio plazo del desarrollo embrionario aviar 3, 11 éster de colesterol. Se sintetiza a partir del colesterol por esterol O-aciltransferasa 1 (SOAT1) en YSM embrión aviar. 4

La forma de almacenamiento de colesterol es CE, CE se realiza en las lipoproteínas, y lipoproteínas son transportados por la circulación a los tejidos. 13 Una semana antes de la eclosión hay un rápido crecimiento de los embriones de aves. Aproximadamente el 68% de los contenidos de lípidos restantes en la yema son absorbidos durante esta etapa. 10 El mecanismo por el cual la yema de los lípidos se utilizan pueden ser aclaradas por un modelo de investigación CEE. Un protocolo de cultivo CEE pollo se estableció para lograr este objetivo de investigación. 2, 9 Sin embargo, debido a la baja tasa de éxito de explantes de tejido, se necesita un procedimiento de cultivo celular CEE mejorada para estudiar la función de ciertas enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por embriones de aves durante el desarrollo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

NOTA: Este procedimiento es una modificación de un protocolo de cultivo de pollo modelo desarrollado por Bauer et al 2013 y Nakazawa et al, 2011. 2.9..

1. Preparar saludable embrionarias Día 5 Los embriones de codorniz japonesa

  1. Coloca 1 hombres y 3 mujeres sexualmente maduras codorniz japonesa juntos en la misma jaula. Suministro de alimento y agua ad libitum. Ajustar la luz en la sala de los animales a 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad.
  2. Recoger los huevos fertilizados en bolsas de plástico cada día por la tarde y mantenerlos en un 16 ° C refrigerador para retardar la tasa de crecimiento de los embriones.
  3. Después de recoger un número suficiente de huevos dentro de un período de dos semanas, se incuban los huevos fertilizados en una incubadora a 37 ° con una buena ventilación durante cinco días.

2. Preparar medio basal y soluciones de lavado

  1. Utilice DMEM / F-12 medio (ajustado a pH 7,2) como el medio de crecimiento, y la completarácon el nuevo 10% de suero de ternero recién nacido (NBCS) y 1% de Pen-Strep Ampho. Solución (PSA; penicilina, 10 5 unidades / L; estreptomicina, 100 mg / l; anfotericina B, 0,25 mg / L).
  2. Preparar la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración 10 veces para el almacenamiento; utilizar la solución de PBS 1x (que contiene NaCl, 137.93 mM; KCl, 2.667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM; Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; ajustar el pH a 7,2) para lavar y humedecer la membrana del saco vitelino, mientras separar el endodermo de yema de huevo y albúmina.
  3. Utilice medio DMEM (ajustado a pH 7,2) para volver a suspender gránulos endodermo.

3. Recogida de EECs primaria de YSMs codorniz japonesa

  1. Incubar los huevos recogidos durante 5 días (paso 1.3). Examinar los huevos por un candler huevo para confirmar el desarrollo embrionario normal.
    NOTA: En el día embrionario 5, el límite de YSM mesodermo es muy clara y las 3 capas embrionarias son menos ligada estrechamente juntos, por lo que es fácil de obendodermo Tain. Utilice sólo los huevos que presentan un desarrollo normal circulación capilar para las colecciones YSM.
  2. Limpiar la cáscara de los huevos con cuidado con el agua dulce y el 75% de etanol. Abrir la cáscara de huevo de la posición de la cámara de aire por un par de tijeras, pelar suavemente y recoger toda la YSM con fórceps y colocar en una placa de cultivo de 10 cm llena de 37 ° C 1x PBS.
  3. El uso de un par de tijeras eliminar el embrión, yema y clara de huevo, y suavemente lavar el YSM con 1x PBS tres veces y coloque YSM en solución PBS en una placa de cultivo de 10 cm.
  4. El uso de fórceps y un par de tijeras para quitar el ectodermo de YSM. Utilice 2 pinzas, una para sujetar firmemente la capa de células endodérmico, y el otro para sujetar el mesodermo capilar.
  5. Bajo un microscopio de disección, separar y separar el endodermo del borde del mesodermo en la dirección hacia el embrión. Recoger el endodermo de color amarillo claro en 50 ml tubos de centrifugación mediante un gotero y colocar en 15 ml de medio de cultivo en un wat 37 ° Cer baño hasta que se completen todas las colecciones de tejidos.

4. La digestión del endodermo rebanadas por digestión con colagenasa

  1. Recién disolver 6,5 unidades de colagenasa tipo IV en 10 ml de DMEM.
  2. Centrifugar los tubos de 50 ml (3.4) a 130 xg durante 3 min a TA. Aspirar el medio y lugar todo el endodermo en una placa de cultivo de 6 cm con una pipeta. Añadir 1 ml de solución de colagenasa a esta placa de cultivo.
  3. Cortar el endodermo recogido de 2 embriones de codorniz con un par de tijeras curvas hasta que el tamaño de cada rebanada es de aproximadamente 2 a 3 mm. Use un gotero, recoger todas las rodajas en un tubo de centrífuga de 50 ml a lo largo con 9 ml de solución de colagenasa fresco.
  4. Digerir el tejido con colagenasa durante 30 min en un baño de agua agitando 37 ° C a 175 rpm. Esta digestión parcial con colagenasa se utiliza para mejorar la proliferación de las células del explante.
  5. Centrifugar a 130 xg durante 3 min a temperatura ambiente y eliminar suavemente la fracción sobrenadante usando una pipeta. Lavar el pellet mediante suspensión en 20 ml de DMEM y eliminar la fracción de sobrenadante después de la centrifugación 130 x g durante 3 min.
  6. Vuelva a suspender el sedimento con 12 ml de medio de cultivo (DMEM / F12 con 10% NBCS y 1% PSA) y sembrar con cuidado e igualmente en una placa de 24 pocillos (de cada solución de células bien con 500 l).
  7. Incubar explantes de tejido a 37 ° C en 5% de CO2 en aire durante 2 días para permitir que las células proliferan de los tejidos.
  8. Se incuban las células durante otros 2 días y caracterizar para la viabilidad celular por un protocolo de ensayo de viabilidad celular. 15
    NOTA: Living células mantienen un ambiente reductor en el citosol. La resazurina, el ingrediente activo, es un compuesto permeable no tóxico, célula que es de color azul y virtualmente no fluorescente. Cuando se añade a los cultivos celulares, resazurina a resorufina es reducida en el citosol por las enzimas mitocondriales. Resorufina es de color rojo y altamente fluorescente. Las células viables se convierten continuamente la resazurina a resorufina, increAsing la fluorescencia general y el color del medio de cultivo células de los alrededores.
  9. Realizar endodermo células epiteliales RNA total aislamiento, transcripción inversa y cuantitativa en tiempo real PCR de la expresión de ARNm del gen marcador tal como se describe. 16,17
    1. Utilice PCR transcriptasa inversa para detectar SOAT1 mRNA (sentido: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisentido: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; producto de PCR = 168 pb) como un marcador específico de las células de la CEE. Utilice β-actina mRNA (sentido: 5'-TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisentido: 5' GTGATGGACTCTGGTGATGG-3 '; producto de PCR = 151 pb) como un gen de mantenimiento y control interno.
    2. Utilice electroforesis en gel para detectar el tamaño del producto de RT-qPCR. Preparar 1% gel de agarosa, y mezclar 10 l producto qPCR con 2 l de colorante de carga. Cargar 10 mezcla l en cada pocillo en el gel de agarosa al 1%, y ejecutar el gel por 100 V durante 30 min.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Con el fin de lograr el objetivo de establecer un modelo celular consistente y útil, necesitamos ampliar y estabilizar la tasa de proliferación y el rendimiento de EECs aviar. Se comparó la incubación directa de la endodermo sin digestión con enzimas con endodermo parcialmente digerido con enzimas proteolíticas, tales como la colagenasa o colagenasa plus 0,6 U de dispasa. Dispasa es un amino-endopeptidasa que hidroliza los enlaces peptídicos N-terminal de los residuos de aminoácidos no p...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Debido a que el sistema de cultivo anterior tiene un éxito limitado, se necesita un mejor sistema de cultivo. El endodermo codorniz japonesa YSM requiere tratamiento con enzimas proteolíticas tales como la colagenasa para aflojar las uniones célula-célula para lograr un mayor crecimiento en los explantes ex-vivo. Nuestros datos muestran que el número de células del tratamiento de digestión parcial fueron mayores que a partir del cultivo de tejido no digerido después de la siembra durante 2 días (Figura 1).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

No hay intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses. No obtuvimos ningún financiamiento de ninguna empresa privada.

Agradecimientos

Los fondos para el desarrollo del protocolo actual se apoya particularmente "Objetivo para el Plan Universitario Top" de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán (donación ID-104R350144), así como el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (Identificación subvención: MAS 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente el Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Taiwán para proporcionar una sala de los animales y el espacio de laboratorio para el estudio actual.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco de Life technologies12800-017 10 X 1 LPara lavar los pellets de EECs
D-MEM/F-12Gibco de Life technologies12400-024 10 X 1 LComo medio basal en el cultivo de EECs NBCS
Gibco de Life technologies16010-159Como suero de suministro en el cultivo de EECs
Pen-Strep Ampho. SoluciónBI (Industrias Biológicas)03-033-1B 100 mlPara atenuar la posible infección 
Colagenasa Tipo IVGibco de Life technologies17104-019 1 g  La colagenasa es una proteasa con especificidad para el enlace entre un aminoácido neutro (X) y la glicina en la secuencia Pro-XGly-Pro. Como proteasa para la disociación de las células del tejido primario.
placa de 24 pocillosFALCON® REF-353047Para conectar y extender
tubos de centrífuga PP de 50 ml Corning® CentriStarTM430829Para el transporte de membranas y la digestión enzimática
50 ml Tubo de fondo cónico con tapónPRO TECHCT-50-PL-TWPara el transporte de membranas y la digestión enzimática
Baño de agitación recíprocaDEAGLESB302Para una mejor digestión enzimática en membranas

Referencias

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Digesti n con colagenasaEnsayo de proliferaci n celularAn lisis de RT qPCRAcumulaci n de gotas lip dicasExpresi n de SOAT1Regulaci n de la v a del cAMPDesarrollo embrionario aviar

Artículos relacionados