Se presenta un protocolo para obtener matrices derivadas de células ricas en proteínas de la matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Además, se presenta un protocolo que incorpora MMC en 3D generación de la piel de co-cultivo organotípicos, lo que reduce el tiempo de cultivo, manteniendo la madurez del constructo.
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Artículo de método
La mejora en 2D y 3D de la piel
En este artículo
Resumen
Resumen
La familia de glicoproteínas de colágenos representa las principales proteínas estructurales en el cuerpo humano, y son componentes clave de los biomateriales utilizados en la ingeniería de tejidos moderna. Un cuello de botella técnico es la deposición de colágeno in vitro, ya que es notoriamente lentos, lo que resulta en la formación de sub-óptima de tejido conectivo y la cohesión del tejido posterior, particularmente en modelos de piel. A continuación, describimos un método que implica la adición de co-polímeros de sacarosa diferencialmente de tamaño a cultivos de piel para generar macromolecular hacinamiento (MMC), que se traduce en una mejora dramática de la deposición de colágeno. En particular, los fibroblastos dérmicos depositan una cantidad significativa de colágeno I / IV / VII y fibronectina bajo MMC en comparación con los controles.
El protocolo también describe un método para decellularize capas de células de hacinamiento, la exposición de cantidades significativas de la matriz extracelular (ECM) que se conservaron en la superficie de cultivo como se evidencia por immunocytochemistry. patrón de masa total y la distribución de la matriz se estudió mediante microscopía de interferencia de reflexión. Curiosamente matrices, fibroblastos, queratinocitos y los co-cultivos producidos derivados de células (MDL) de diferente composición y morfología. MDL podría utilizarse como "bio-andamios" para la siembra celular secundaria, donde el uso actual de los revestimientos o andamios, por lo general de fuentes animales xenogénicas, se puede evitar, trasladando así a las aplicaciones más clínicamente relevante.
Además, este protocolo describe la aplicación de MMC durante la fase sumergida de un modelo 3D-organotípicos piel de co-cultivo, que era suficiente para aumentar la deposición de ECM en la unión dermo-epidérmica (DEJ), en particular, el colágeno VII, el componente principal de fibrillas de anclaje. La microscopía electrónica confirmó la presencia de fibrillas de anclaje en cultivos desarrollados con MMC, en comparación con los controles. Esto es significativo ya que las fibrillas de anclaje atar el dermis a la epidermis, por lo tanto,que tiene un pre-formada madura DEJ puede beneficiar a los receptores de injertos de piel en cuanto a la estabilidad del injerto y la curación de heridas en general. Además, el tiempo de cultivo se condensa a partir de 5 semanas a 3 semanas para obtener una construcción madura, al utilizar MMC, reduciendo los costos.
Introducción
La piel forma una barrera protectora mediante la prevención de la pérdida de agua y la entrada de patógenos. Se compone de tres componentes principales; la dermis ricos del estroma 1, una epidermis estratificada 2,3,4 encima de ella, y de la unión dermo-epidérmica de entre 5,6. La dermis se componen en gran parte de colágeno y fibras elásticas y está escasamente poblada con fibroblastos 7. En contraste, la epidermis rica en células se compone de varias capas de queratinocitos. Los queratinocitos de la capa más interna son proliferativa y proporcionan nuevas células basales que se renuevan y sustituyen a los queratinocitos d....
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Protocolo
1. macromolecular hacinamiento en 2D Cultivos de Células de la piel
- 50.000 células de semillas (fibroblastos primarios o queratinocitos primarios o co-cultivo de fibroblastos y queratinocitos primarios) por pocillo de una placa de 24 pocillos. Sembrar las células en 1 ml de medio de crecimiento tipo de célula correspondiente.
- Permitir que las células se adhieran durante la noche, en una incubadora de 37 ° C en 5% de CO 2.
- Desechar los viejos medios y reemplazar con 1 ml de medio fresco que contiene Crowders macromoleculares y ácido ascórbico 100 mM. Utilice un cóctel Crowder que consiste en 37,5 mg / ml de Ficoll 70 y 25 mg /....
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Resultados
Aglomeración macromolecular fue capaz de mejorar la deposición de ECM, en particular, los fibroblastos depositan más colágeno I, IV y fibronectina en comparación con los cultivos control (figura 1, la capa de células; 1A, colágeno I; 1B, colágeno IV; 1C, fibronectina). Tras la descelularización, era evidente que los fibroblastos fueron los principales depositantes de colágeno I, IV y fibronectina en comparación con los q.......
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Discusión
La matriz extracelular mejorada se obtiene tras la introducción de aglomeradores macromoleculares en el cultivo celular, debido al efecto de volumen excluido que aumenta la escisión de propéptidos por proteinasas. Esto da como resultado que la matriz extracelular, en particular el colágeno, se procese más rápido y se deposite en la superficie del cultivo. Mientras que otros grupos han obtenido capas gruesas de células de fibroblastos, implicó un tiempo de cultivo de varias semanas20. Por el contrario, la MMC d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses contradictorios que divulgar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación Biomédica, Singapur a través del apoyo central al Instituto de Biología Médica y la subvención SPF2013/005. M.R. fue apoyado por una beca del Comité de Investigación de la Facultad de NUS (Ingeniería en Medicina) (M.R.) R-397-000-081-112, y el Programa de Ingeniería de Tejidos de la NUS (NUSTEP). Los autores quieren agradecer a la profesora Irene Leigh por proporcionar el anticuerpo colágeno VII. El trabajo de microscopía electrónica se llevó a cabo en la Unidad de Microscopía Electrónica de la Universidad Nacional de Singapur.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido ascórbico | Wako | 013-12061 | Aditivo para medios de cultivo celular |
| Insertos para cultivos celulares (Formato de 6 pocillos) | Greiner Bio-One | 657610 | Cultivos organotípicos |
| Solución de citrato | Dako | S2369 | DakoCytomation Solución de recuperación de dianas Citrato, pH 6 (x10) |
| Colágeno (cola de rata) | Corning | 354236 | Cultivos organotípicos |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 Medios de | cultivo celular |
| DAB Sustrato + kit de cromógeno | Dako | K3468 | Histología |
| Placa de pocillos profundos (formato de 6 pocillos) | Corning | 355467 | Cultivos organotípicos |
| Reactivo de detección ECL GE | Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Reactivo de detección de Western Blotting |
| Microscopio electrónico (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Microscopía electrónica de transmisión |
| Medios de fibroblastos (FM) | Alta glucosa-DMEM + 10% Suero fetal bovino + 1% Penicilina Estreptomicina | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Ciencias de la Vida | 17-0310-05 | Crowder macromolecular |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Crowder macromolecular |
| Medios sin suero de queratinocitos (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 Medios de | cultivo celular |
| Tampón de lisis | ThermoFisher Scientific | 89900 | Tampón de lisis para la extracción de proteínas. A este tampón de lisis se le añadió un inhibidor de la proteasa (Roche, #11836170001). |
| Microscopio | Zeiss | LSM510 | Canales rojo, verde y azul para visualizar inmunotinciones fluorescentes AF594, AF488 y DAPI (40X mag). |
| Medios de montaje (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Tinción fluorescente |
| Medios de montaje (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histología (HRP) |
| Compuesto OCT (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Inclusión para criotomía |
| Penicilina-estreptomicina antibióticos | Sigma Aldrich | A5955 | Aditivo para medios de cultivo celular |
| anticolágeno | |||
| I | fuerte Abcam | #ab6308 | |
| Anticolágeno tipo IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anticolágeno VII | LH7.2 (en casa) | ||
| Anticuerpo anti-fibronectina | Abcam | #ab2413 | |
| Agente reductor | ThermoFisher Scientific | NP0009 | blot |
| Tampón de muestra | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Anticuerpos secundarios (inmunotinción) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 cabra anti-conejo | ThermoFisher Científico | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 cabra anti-ratón | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 pollo-anti-conejo | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 cabra-anti-ratón | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Anticuerpos secundarios (HRP) | Dako | Envision + System - Polímero marcado con HRP Anti-Conejo y Anti-Ratón | |
| desoxicolato de sodio | Prodotti Chimicie Alimentari | Descelularización | |
| Medios de estratificación | |||
| Medio de águila modificado de Dulbecco | Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular. | ||
| Jamón' s F12 | Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular. | ||
| 10% suero fetal bovino | Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular. | ||
| 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina | Se utilizan durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular. | ||
| 0,4 mg/ml hidrocortisona | Se utiliza durante la interfase aire-líquido de los cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular. | ||
| 5 mg/ml de insulina | Se utiliza durante la interfase aire-líquido de los cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular. | ||
| 1.8 y punto medio; 10-4 M adenina | Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular. | ||
| 5 mg/ml de transferrina | Se utiliza durante la interfase aire-líquido de los cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular. | ||
| 2 y punto medio; 10- 11 M triyodotironina | Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular. | ||
| Tripsina | Biopolis Instalaciones Compartidas | 0.125% Tripsina/Verne pH 7.0 + 0.3 | Se utiliza para tripsinizar células |
Referencias
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in ....
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Reimpresiones y permisos
