Method Article

Flow-patrón Fabricación guiada de alta densidad de códigos de barras de anticuerpos microarrays

DOI:

10.3791/53644

⸱

January 6th, 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe la fabricación de una gran escala, multiplexado de ADN o anticuerpo matriz de dos dimensiones, con aplicaciones potenciales en los estudios de la señalización celular y la detección de biomarcadores.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El microarray de anticuerpos, como tecnología bien desarrollada, se enfrenta actualmente al desafío de algunas otras tecnologías de alto rendimiento establecidas o emergentes. En este informe, renovamos la tecnología de microarrays de anticuerpos mediante el uso de un enfoque novedoso para la fabricación y la introducción de nuevas características. La fabricación de nuestro microarray de anticuerpos de alta densidad se logra a través de un patrón de flujo orientado perpendicularmente de ADN monocatenario y la posterior conversión mediada por conjugados ADN-anticuerpo. Este protocolo describe los pasos críticos en el patrón de flujo del ADN, la producción y purificación de conjugados ADN-anticuerpo y la evaluación de la calidad del microarray fabricado. La uniformidad y la sensibilidad son comparables con los microarrays convencionales, mientras que nuestra fabricación de microarrays no requiere la ayuda de una impresora de arrays y se puede realizar en la mayoría de los laboratorios de investigación. La otra gran ventaja es que el tamaño de nuestras unidades de microarrays es 10 veces más pequeño que el de las matrices impresas, lo que ofrece la capacidad única de analizar proteínas funcionales de células individuales cuando se interactúan con diseños de microchips genéricos. Esta tecnología de código de barras se puede emplear ampliamente en la detección de biomarcadores, estudios de señalización celular, ingeniería de tejidos y una variedad de aplicaciones clínicas.

Introduction

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Microarrays de anticuerpos han sido ampliamente utilizados en estudios proteómicos durante décadas para examinar la presencia de proteínas específicas, incluyendo biomarcadores proteicos 1-3. Aunque este campo se enfrenta actualmente a grandes retos de otras tecnologías de alto rendimiento, tales como la espectrometría de masas (MS), todavía hay mucho espacio para la utilidad de los microarrays de anticuerpos, principalmente debido a que estos dispositivos ofrecen la interpretación de datos simple y fácil interfaz con otros ensayos. En los últimos años, la integración de los microarrays en andamios microchip ha proporcionado el microarray anticuerpo una nueva oportunidad para prosperar 4-7. Por ejemplo, el microarray de código de barras integrado en un microchip de una sola célula se ha utilizado en estudios de comunicación celular 8,9. Esta tecnología tiene ventajas distintivas con respecto a otras tecnologías de microarrays disponibles. Cuenta con elementos de la matriz de 10-100 micras a, mucho menor que el 150 micras tamaño típico utilizado en elemen microarrays convencionalests. La construcción de elementos de la matriz más pequeños se consigue utilizando enfoques sistemáticos de flujo de modelado, y esto da lugar a microarrays compactos que pueden detectar las proteínas de una sola célula secretadas y proteínas intracelulares. Otra ventaja es el uso de una configuración simple,-instrumento libre. Esto es particularmente importante, ya que la mayoría de los laboratorios y las pequeñas empresas pueden no ser capaces de acceder a las instalaciones centrales de microarrays. Tal código de barras microarrays de anticuerpos de funciones mejorado rendimiento del ensayo y se pueden usar para realizar ensayos altamente multiplexados en células individuales mientras que el logro de alta sensibilidad y especificidad comparable con la de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas sándwich convencional (ELISA 8). Esta tecnología ha encontrado numerosas aplicaciones en la detección de proteínas de glioblastoma 9-11, células T 12, y células tumorales circulantes 13. Alternativamente, microarrays de ADN de código de barras solo se han utilizado en el posicionamiento preciso de neuronas y astrocitos para mimicking la asamblea en vivo de tejido cerebral 14.

Este protocolo se centra sólo en las etapas experimentales y bloquea la acumulación de las dos dimensiones (2-D) de código de barras de microarrays de anticuerpos que tiene aplicaciones potenciales en la detección de biomarcadores en muestras de fluidos y en células individuales. La tecnología se basa en una direccionable de una sola hebra, unidimensional (1-D) de microarrays de ADN construidos utilizando oligonucleótidos ortogonales que se modelan espacialmente sobre sustratos de vidrio. El patrón 1-D se forma cuando se utilizan canales de flujo paralelos en el paso de flujo patrón, y tal patrón aparece como bandas discretas visualmente similares a 1-D Código Universal de Producto (UPC) los códigos de barras. La construcción de un 2-D (n x m) matriz de anticuerpos - una reminiscencia de un código de la matriz 2-D de respuesta rápida (QR) - necesita estrategias de modelado más complejas, pero permite la inmovilización de anticuerpos a una densidad mayor 8,15. La fabricaciónrequiere dos pasos de modelado de ADN, con el primer patrón perpendiculares a la segunda. Los puntos de intersección de estos dos patrones constituyen los elementos de m x n de la matriz. Al seleccionar estratégicamente las secuencias de ADN de cadena sencilla (ssDNA) utilizado en flow-patrón, cada elemento de una matriz dada es asignada una dirección específica. Es necesario Esta referencia espacial para distinguir entre las señales de fluorescencia en la diapositiva de microarrays. La matriz de ssDNA se convierte en una matriz de anticuerpos a través de la incorporación de los conjugados anticuerpo-ADN complementarios, formando una plataforma llamada ADN codificado biblioteca de anticuerpos (DEAL 16).

Este protocolo de vídeo se describen los pasos clave en la creación de matrices nxm anticuerpos que incluyen la preparación de polidimetilsiloxano (PDMS) moldes de código de barras, flujo-patrón ssDNA en dos orientaciones, la preparación de los conjugados anticuerpo-DEAL oligonucleótidos, y la conversión de la matriz de ADN 3 x 3 en un 3x 3 matriz de anticuerpos.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precaución: Varios productos químicos utilizados en este protocolo son irritantes y son peligrosos en caso de contacto con la piel. Consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) y utilizar equipo de protección personal adecuado antes de realizar este protocolo. La solución Piranha utilizado en el paso (1.1.1) es altamente corrosivo y debe ser preparado mediante la adición de peróxido lentamente con el ácido con agitación. Manejar esta solución con extrema precaución en una campana de humos. Utilice protección ocular adecuada y guantes resistentes al ácido. Trimetilclorosilano (TMCS) es un corrosivo químico inflamable utilizado en un paso opcional después de (1.1.6). Maneje este producto químico en una campana de humos.

Nota: Realizar la fabricación de diapositivas código de barras y procedimientos críticos flujo de modelado en una habitación limpia para minimizar la contaminación por partículas. Las partículas de polvo pueden bloquear los puertos y microcanales de moldes de PDMS e interferir con el flujo-patrón.

1. Construcción del Uno-dimensionl de ADN de código de barras de diapositivas

  1. Preparación del maestro SU-8 para los patrones de flujo de código de barras
    Nota: Los dibujos de los patrones de flujo perpendiculares (Figura 1A-B) se crean usando un (CAD) de software de diseño asistido por ordenador. Estos patrones son prestados en una fotomáscara cromo. Las áreas transparentes de la máscara que correspondan a las características del maestro SU-8.
    1. Limpiar una oblea de silicio (100 mm de diámetro) a fondo en una mezcla de 3 H 2 SO 4: 1 H 2 O 2 (solución Piranha) 30% se calienta a 96 ° C. Lavar la oblea con agua destilada y alcohol isopropílico, seguido de secado con una pistola de soplado de nitrógeno.
    2. Vierta aproximadamente 4 ml de SU-8 2025 fotoprotector en la oblea. Utilice un giro revestidor programable para extender uniformemente la fotoprotección en la oblea durante 10 segundos a 500 rpm, y luego 30 segundos a 3.000 rpm. Esto crea una capa de resina fotosensible con un espesor de ~ 25 m. Poco a poco permiten vueltas a frenar antes de detenerse - esta es maintain una capa uniforme sobre la superficie de la oblea.
    3. Hornear la oblea recubierta sobre una placa caliente durante 1 min a 65 ° C, a continuación durante 5 min a 95 ° C. Este paso permite que el recubrimiento se solidifique. Enfriar a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Coloque la máscara de cromo (Figura 1C) en la capa de resina fotosensible. Exponer las características de la máscara a la luz UV cercano (350-400 nm, energía exposición 150-160 mJ / cm2) durante 20 segundos.
      Nota: El diseño de la máscara de cromo contiene 20 canales, cada uno de los cuales son 20 m de ancho, con 50 micras de paso. Los canales están enrollando desde un extremo del patrón hasta el extremo opuesto. En conjunto, los 20 canales cubren un área rectangular con una longitud de ~ 40 mm y una anchura de ~ 20 mm. Cada canal está flanqueada por dos rasgos circulares que corresponden a una entrada y una salida. Las entradas y salidas son intercambiables.
    5. Hornear la oblea expuesta sobre una placa caliente durante 5 min a 95 ° C. Enfriar a ta gradualmente.
    6. Sumerja la oblea en el SU-8 desarrollador con agitacióndurante 5 min. Lavar la oblea con una pequeña porción de fresco SU-8 promotora, seguido por alcohol isopropílico. Seque la oblea con una pistola de soplado de nitrógeno. Hard-hornear la oblea en una placa de cocción de 200 ° C durante 30 minutos, y deje que la oblea se enfríe gradualmente a RT.
      Nota: Desarrollo puede llevarse a cabo durante más tiempo si se observa una película en blanco después del lavado en este paso.
      Opcional: silanizar el maestro SU-8 mediante su exposición a vapor de trimetilclorosilano en un plato de Petri cerrada durante 10 min.
  2. Preparación del molde de código de barras PDMS
    1. Combine 40,0 g de base de elastómero de silicona con 4,0 g de agente de curado. Se agita la mezcla vigorosamente durante 10 prepolímero min. Degas durante 20 min al vacío.
      Nota: Como regla general, utilice un 10: 1 (base: agente de curado) relación de masa.
    2. Vierta el prepolímero en una placa de Petri que contiene una oblea de silicio con el SU-8 maestro del patrón de código de barras. La altura de la mezcla de PDMS debe ser de aproximadamente 7,5 mm o superior. Desgasificar la mezcla en el Petri plato por segunda vez para eliminar las burbujas restantes, luego hornear la mezcla durante 1 hora a 75 ° C para permitir PDMS de curar.
      Nota: Es importante mantener suficiente espesor de la losa de PDMS en ~ 7,5 mm o superior para evitar la adición de demasiada tensión al vínculo PDMS de vidrio tras la inserción de pines / tubería a través de agujeros en el molde de PDMS en el paso (1.3.3.1)
    3. El uso de un bisturí, corte con cuidado alrededor de la zona de la losa de PDMS que contiene las características del molde de código de barras y la cáscara de la losa de la oblea.
    4. Recortar los bordes de la losa para alcanzar la forma deseada del molde de código de barras PDMS. Perforar agujeros 20 (1,0 mm de diámetro) a través del molde utilizando un punzón de biopsia con el émbolo. Asegúrese de que los agujeros estén alineados con las características circulares del patrón de código de barras. Estos agujeros sirven como las entradas y salidas.
  3. Patrón unidimensional de poli-L-lisina (PLL)
    1. Elimine el polvo en la superficie de un portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina utilizando una pistola de soplado de nitrógeno. Attach el molde de PDMS para el portaobjetos de vidrio limpio. Asegúrese de que los bordes del molde y la corredera están alineados.
    2. Hornear durante 1,5 horas a 75 ° C para fortalecer el vínculo entre el molde de PDMS y la corredera con recubrimiento de PLL. Mientras tanto, preparar 20 piezas de tubo de polietileno flexible (de 3 a 4 pulgadas piezas, con un diámetro interior de 0,5 mm y un diámetro exterior de 1,5 mm).
      Nota: El número de piezas de tubo se corresponde con el número de entradas en el molde de código de barras PDMS. El tubo sirve para acoplar los canales en el código de barras del molde de PDMS a un tanque de gas de nitrógeno equipado con un regulador de presión.
    3. Para un extremo de cada trozo de tubo, adjuntar un acero inoxidable pasador hueco (1 mm de diámetro). Aspirar esterilizada por filtración de poli-L-lisina solución a través de la clavija, hasta por lo menos 1 cm de la tubería se llena con la solución.
      1. Apriete los pernos (conectados a la tubería solución lleno) a las entradas del código de barras del molde de PDMS (Figura 1E). Conecte el otro extremo de los tubos deun tanque de nitrógeno a presión regulada set-up. Dejar que la solución fluya a través del molde usando un rango de presión de 0,5 a 1 psi durante al menos 6 h.
        Nota: Consulte el paso (1.3.3) para todos los procedimientos de flujo de modelado.
  4. Patrón unidimensional de ssDNA 14
    Nota: El tampón fosfato salino (PBS) utilizado en las etapas posteriores se prepara a partir NaCl 137 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, y 2 mM KH 2 PO 4. El pH del tampón es 7,4.
    1. Preparar mM bis suberato (BS3) Solución 2 (sulfosuccinimidil) en PBS. Preparar 300 mM de soluciones A, B, C y ssDNA (5'-amina modificado, a 80 nucleótidos) en PBS o agua ultrapura.
      Nota: Utilice la solución BS3 dentro de aproximadamente 30 minutos después de la preparación, porque el éster -hidroxisuccinimida N somete fácilmente a la hidrólisis.
    2. Combinar 2,5 l de 300 mM A, B, o C ssDNA con 2,5 l de bis 2 mm (sulfosuccinimidyl) suberato en PBS para cada canal. A, B, y C de ADN se designan a los canales 1, 2 y 3, respectivamente. Esta orden también se aplica al resto de grupos de 3 canales (Figura 2A).
    3. Realice el paso (1.3.3). Esta vez, aspirar las soluciones BS3 / ADN 5-mu l a través de pasadores de acero inoxidable y en el tubo de polietileno, a continuación, acoplar el molde de PDMS para la fuente de nitrógeno. Dejar que la solución BS3 / DNA fluya a través del molde de código de barras para aproximadamente 40 min o hasta que se llenan en los canales.
    4. Detener el flujo una vez que todos los canales están llenos, entonces se incuba la solución BS3 / ADN en el código de barras a RT durante 2 hr. No permita que la solución se seque. Hornee el molde de PDMS con tobogán de códigos de barras conectado durante 1 hora a 75 ° C.
      Nota: Para facilitar la alineación en los pasos de flujo de modelado posteriores, los bordes del patrón de canal en la diapositiva de código de barras pueden ser descritos. Esto se hace por el rascado cuidadosamente la superficie de vidrio usando un scrib diamantee para generar marcadores de alineación en la parte inferior del portaobjetos de vidrio. La alineación en las últimas etapas del protocolo se puede comprobar con un microscopio.
    5. Retire el molde de PDMS de la diapositiva de código de barras. Lavar el portaobjetos suavemente con 0,01% de SDS de una vez tres veces con agua ultrapura.
      1. Seque el portaobjetos de código de barras usando un spinner portaobjetos de microscopio. Almacenar la corredera de código de barras en un tubo de centrífuga de 50 ml limpio para su posterior uso.

2. Validación del patrón unidimensional en la diapositiva de código de barras

Nota: Este protocolo de validación también puede ser adaptado para su uso en la evaluación de la calidad de los pasos de modelado de flujo posteriores.

  1. El bloqueo de la corredera
    1. Preparar 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Filtrar esta solución a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras antes de su uso. Utilizando una punta de carga de gel, aplique 50 l de solución de BSA al 1% a un borde de la corredera de código de barras.
    2. Incubar la solut BSA 1%ion durante 1 hora a temperatura ambiente.
  2. La incubación con Cyanine 3 (Cy3) y conjugado con ADN complementario
    1. Preparar un cóctel de A ', B', y los oligonucleótidos C 'conjugado con Cy3 en un extremo. Las secuencias de A ', B' y C 'son complementarias a las de A, B, y C, respectivamente. La concentración de trabajo de la ADN-Cy3 es de 0,05 M en 0,1% de BSA.
    2. Retire la solución de BSA de la diapositiva con la pipeta, a continuación, aplicar 30 l de la solución de cóctel de ADN en el mismo borde de la diapositiva. Incubar el cóctel Cy3-DNA en el portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 hr. Realice este paso de incubación en la oscuridad para proteger el resto de Cy3 photobleaching.
  3. Análisis de la intensidad de fluorescencia
    1. Pipetear a cabo el cóctel Cy3-DNA y lavar el portaobjetos en 1% de BSA, PBS, y finalmente en PBS diluido (1 parte PBS con 50 partes de agua ultrapura). Seque el portaobjetos utilizando una ruleta.
    2. Observar la fluorescencia (Figura 2B), utilizando un microscopio de fluorescencia o un escáner de microarrays. Cuando se utiliza un escáner de microarrays, ajuste la longitud de onda de emisión láser de 532 nm, el tamaño de píxel a 5 micras, tubo fotomultiplicador (PMT) de ganancia a 450 y la potencia en un 15%.

3. Fabricación de la matriz de 2 dimensiones ADN (3x3) 14

  1. Preparación del molde de código de barras PDMS
    1. Realizar el procedimiento de (1.1) para construir otra SU-8 maestro, pero esta vez utilice una máscara de cromo con un patrón de flujo perpendicular a la de la primera diseño. Realice el procedimiento de (1.2) para la construcción de un nuevo molde de PDMS con el patrón perpendicular.
  2. Patrones de flujo bidimensional de ssDNA
    1. Para una matriz de 3 x 3, se preparan 150 M soluciones madre de A'-i, B'-ii, C'-iii, A'-iv, B'-v, C'-vi, A'-vii, B'ADN -VIII y C'-ix en el 3% de BSA / PBS. Estos oligonucleótidos sirven como "secuencias de puente" (Figura 2A). Se combinan las soluciones de oligonucleótidos (Soluciones 1 a 3) tal que la concentración de trabajo es de 50 m para cada oligonucleótido. Utilice la guía proporcionada en la Tabla 1.
    2. Flujo 3% de BSA / PBS solución de bloqueo en todos los 20 canales durante 1 hora a 0,5 a 1 psi.
    3. Soluciones de flujo 1, 2 y 3 en los canales 1, 2, y 3, respectivamente. Siga este orden para los conjuntos subsiguientes de 3 canales. Flujo lo general se realiza en torno a 40 min. Incubar las soluciones de ADN a temperatura ambiente durante 2 h para permitir que el ADN para hibridar.
    4. Flujo 3% de BSA / PBS solución de bloqueo en todos los 20 canales durante 1 hora a 0,5 a 1 psi para eliminar ADN no hibridado. Despegue la losa de PDMS, y lavar el microarray de ADN resultante de diapositivas por inmersión de la lámina de vidrio en 3% BSA / PBS una vez y PBS dos veces, seguido por PBS diluido (1 parte de PBS y 50 partes de agua ultrapura). reri o la diapositiva utilizando una ruleta portaobjetos de microscopio.
    5. Realizar una segunda etapa de validación (Figura 2C) similar a la de la sección 2. Utilice oligonucleótidos i 'a IX' que se conjugan con Cy3. Almacenar el 3 x 3 diapositiva matriz en un tubo de centrífuga de 50 ml para su uso posterior.
      Nota: El microarrays de ADN se puede almacenar a temperatura ambiente en un desecador durante meses.

4. La conversión de la matriz de ADN 3 x 3 en una matriz de anticuerpos

  1. Preparación de anticuerpos de oligonucleótidos (DEAL) conjugados
    1. Preparar soluciones de 200 mM succinimidil-4-formilbenzoato (S-4FB) y 40 mM succinimidil-6-hidrazinonicotinamida (S-HYNIC) en anhidro N, N-dimetilformamida (DMF).
    2. Preparar hasta 7 soluciones separadas de anticuerpos de captura (1 mg / ml) en PBS.
      Nota: Si las soluciones de anticuerpos de valores contienen azida de sodio bacteriostático, realizar intercambio de tampón con PBS mediante desalación giro columns con 7 kDa de peso molecular de corte (MWCO).
    3. Preparar separadas 400 M soluciones de i ', ii', iii ', iv', v ', vi', y el ADN vii. Asigne a cada anticuerpo de captura de una secuencia de oligonucleótidos. Combine 40 l de ADN M 400 con 12,25 l de DMF en tubos de microcentrífuga y girar hasta mezclar bien.
      1. Para cada solución de ADN / DMF, agregar 2.3 l de 200 mM S-4FB en DMF. Por cada 100 g de anticuerpo de captura, añadir 2,25 l de 40 mM de S-HYNIC en DMF.
    4. Incubar las soluciones / S-HYNIC y el ADN / S-4FB de anticuerpos durante 4 horas a RT.
    5. En la preparación para la reacción de acoplamiento ADN-anticuerpo, preparar nuevas columnas de desalación giro (uno para cada solución de ADN y uno para cada anticuerpo) lavándolas con tampón citrato a pH 6.
    6. Después de 4 h de incubación, realizar intercambio de tampón para cada anticuerpo / solución de ADN / S-4FB S-HYNIC y. Combine el S-4FB conjugado i ', ii', iii ', iv', v ', vi' y oligonucleótidos vii 'con los conjugados anticuerpo-S-HYNIC. Incubar las mezclas durante 2 horas a temperatura ambiente.
    7. Se incuba la reacción de O / N a 4 ° C.
  2. Purificación de anticuerpos de oligonucleótidos (DEAL) conjugados
    Nota: Para purificar los conjugados anticuerpo-oligonucleótido, lleve a cabo la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) en un sistema estándar de FPLC equipado con una columna Superose 6 10/300 GL.
    1. Ajuste la longitud de onda de detector UV del sistema FPLC a 280 nm. Utilice flujo isocrático de PBS (pH 7,4) a 0,3 ml / min para separar los conjugados anticuerpo-oligonucleótido de la 4FB-ADN-S exceso.
    2. Reunir las fracciones que contienen el conjugado y concentrar las fracciones a un volumen de 150 l utilizando filtros de espín con una kDa MWCO 10.
  3. Patrón bidimensional de anticuerpos
    1. Preparar otro molde de PDMS con microcámaras o nosotros los micro pozosing procedimientos de fabricación en el paso (1.2). El molde de PDMS puede contener microlitros a los pocillos de nanolitros para inmunoensayos.
      Nota: Para la detección de biomarcadores en general en muestras de fluidos, un molde de PDMS con múltiples pozos se acopla con la diapositiva matriz. Las características del molde de PDMS dependen del sistema en estudio. Por ejemplo, la detección de proteínas a partir de experimentos de células individuales se puede realizar con un molde de PDMS que contiene microcámaras con volúmenes de 0,15-nl.
    2. (Opcional) Se somete el molde de PDMS al plasma limpieza (18 W) durante 1,5 minutos para rendir su hidrófila superficie modelada. Antes de la limpieza de plasma, utilizar cinta adhesiva para bloquear todas las otras superficies que se unen directamente al 3 x 3 array de diapositivas.
      Nota: Paso (4.3.2) es opcional, pero se lleva a cabo por lo general cuando el molde de PDMS es para uso en experimentos de células individuales.
    3. Mate el molde de PDMS con el 3 x 3 array de diapositivas, a continuación, bloquear la corredera con 1% de BSA en PBS. Incubar durante 1 hora a RT. Meanwhile, preparar un cóctel (200 l de volumen final) de conjugados anticuerpo-oligonucleótido. La concentración de trabajo de cada conjugado es de 10 mg / ml en 1% BSA / PBS.
    4. Añadir el cóctel de anticuerpo-oligonucleótido, a continuación, se incuba durante 1 hora a 37 ° C para permitir que el resto de los conjugados de oligonucleótido para hibridarse con puntos específicos en los 3 x 3 arrays, convirtiendo de este modo la matriz de ADN a una matriz de anticuerpos.
    5. Repita el paso (3.2.4) para limpiar y secar la diapositiva. La sensibilidad más alta se puede conseguir si la matriz anticuerpo se utiliza inmediatamente. Almacenamiento prolongado puede provocar la pérdida de sensibilidad.
  4. La detección de proteínas
    1. Reconstituir proteínas recombinantes o preparar una muestra de células filtrada.
    2. Mate de la micromatriz con un chip de diseño personalizado, y bloquear la superficie con 3% de BSA en PBS durante 1 hr. A continuación, retire la solución de BSA, y aplicar las muestras y se incuba durante 2 horas.
    3. Lavar las muestras usando 3% de BSA en PBS tres veces, unad luego añadir anticuerpos de detección a una concentración proporcionada por la ficha técnica del producto. Incubar durante 2 horas.
    4. Lavar los anticuerpos de detección por 3% de BSA en PBS tres veces, y luego añadir Cyanine 5 (Cy5) -estreptavidina a 1 g / ml, seguido de incubación durante 1 hr.
    5. Repita el paso (3.2.4) para limpiar y secar la corredera para la exploración.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los diseños de los moldes de PDMS (Figura 1A-1B) se extrajeron utilizando un programa CAD (AutoCAD). Dos diseños que se muestran los canales de función para el patrón de flujo, uno horizontal y otro vertical. Las partes izquierda y derecha de cada diseño son simétricos; cualquiera de ellos podría ser entradas o salidas. Cada uno de 20 canales es sinuoso de un extremo todo el camino hasta el otro extremo. Cada diseño se imprime en una fotomáscara cromo (Figura 1C)...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diseño del patrón de flujo es el primer paso crítico en la fabricación de los microarrays 2-D. Para generar dos patrones de ADN superpuestas sobre un sustrato de vidrio, las características de canal del primer diseño deben ser perpendiculares a las de la segunda (Figura 1A-B). Los diseños también consideran que las aplicaciones posteriores de los microarrays. En el caso del análisis de una sola célula, el microarray se utiliza para detectar proteínas a partir de células individuales encerradas ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses contrapuestos que divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer el fondo inicial de SUNY Albany y el acceso a las instalaciones del Centro de Investigación del Cáncer de la Universidad de Albany.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 base de elastómero de siliconaDow Corning3097366-1004
Sylgard 184 agente de curado de elastómero de siliconaDow Corning3097358-1004
SU-8 2025 fotorresistenteMicroChemY111069
Obleas de silicona University Wafers452
Portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisinaThermo ScientificC40-5257-M20
OligonucleótidosTecnologías de ADN integradas*Pedido a medida de Integrated DNA Technologies, consulte Tabla 2.
Solución madre adhesiva de poli-L-lisinaNewcomer Supply1339
Bis (sulfosuccinimidyl) suberate  (BS3)Thermo Scientific21585
1x solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4Calidad biológica114-058-101
Ä kta Explorer 100 Sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC)GE (Amersham Pharmacia) 18-1112-41
Columna Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17-5172-01
Captura de anticuerposvarios*La selección de anticuerpos depende de la aplicación
Succinimidil-6-hidrazino-nicotinamida (S-HyNic)SolulinkS-1002
Succinimidil-4-formilbenzamida (S-4FB)SolulinkS-1004
N,N-dimetilformamidaSigma-Aldrich227056
Ácido cítrico anhidroAcros42356
Hidróxido de sodioFisher ScientificS318
Amicon Ultra filtro de centrifugación 10 kDa MWCOEMD MilliporeUFC201024
BarnizadoraLaurell TechnologiesWS-650-MZ
Punzón de biopsia con émbolo (1,0 mm de diámetro)Ted Pella, Inc.15110-10
Escriba de diamante (Estilo 60)SPI suministra6004
TrimetilclorosilanoSigma Aldrich92361

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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