Modelado Quimioterapia Leucemia resistente In Vitro

Resumen

El presente informe resume un protocolo que se puede utilizar para modelar la influencia del nicho del microambiente de la médula ósea en las células leucémicas, con énfasis en el enriquecimiento de la subpoblación más quimiorresistente.

Resumen

Está bien establecido que el microambiente de la médula ósea proporciona un sitio único de santuario para las enfermedades hematopoyéticas que inician y progresan en este sitio. El modelo presentado en el presente informe utiliza células estromales primarias de médula ósea humana y osteoblastos como dos tipos de células representativas del nicho de la médula ósea que influyen en el fenotipo de las células tumorales. Las condiciones de cocultivo in vitro descritas para células leucémicas humanas con estos componentes de nicho primario apoyan la generación de una subpoblación de células tumorales quimiorresistentes que pueden recuperarse eficientemente del cultivo para su análisis mediante diversas técnicas. Un programa de alimentación estricto para evitar los flujos de nutrientes seguidos de la recuperación de partículas de dextrano reticulado (G10) en gel tipo 10 de la población de células tumorales que han migrado por debajo de las células estromales de la médula ósea adherentes (BMSC) u osteoblastos (OB), generando una población de células tumorales de "fase dim" (PD), proporciona una fuente constante de células leucémicas purificadas y resistentes a la terapia. Esta población clínicamente relevante de células tumorales puede evaluarse mediante métodos estándar para investigar las vías apoptóticas, metabólicas y reguladoras del ciclo celular, así como para proporcionar un objetivo más riguroso en el que probar nuevas estrategias terapéuticas antes de las investigaciones preclínicas dirigidas a la enfermedad residual mínima.

Introducción

El objetivo general del método descrito es proporcionar un enfoque in vitro eficiente y rentable que apoye la investigación de los mecanismos que subyacen a la supervivencia de las células leucémicas apoyadas en la médula ósea durante la exposición a la quimioterapia. Está bien documentado que las células tumorales residuales que sobreviven después del tratamiento contribuyen a la recaída de la enfermedad que a menudo es más agresiva que la del diagnóstico y que a menudo se trata de manera menos efectiva^1-8. Los modelos que incluyen células leucémicas aisladas, como los limitados al cultivo de células en medios solos, para probar enfoques terapéuticos no tienen en cuenta estas señales críticas, ni la heterogeneidad de la enfermedad que se produce en respuesta a la disponibilidad de señales derivadas de nicho en las que las subpoblaciones de células tumorales con interacciones muy específicas con células de nicho obtienen una protección mejorada. Los modelos estándar de cocultivo 2D que cocultivan células estromales derivadas de la médula ósea y células leucémicas han abordado de alguna manera la contribución del nicho de la médula ósea y han demostrado que la interacción con las células del microambiente de la médula ósea aumenta su resistencia a la quimioterapia y altera sus características^{de crecimiento 9-14}. Sin embargo, estos modelos a menudo no logran recapitular la supervivencia a largo plazo de las células tumorales y no informan con precisión los resultados asociados con las poblaciones de células leucémicas más resistentes que contribuyen a la ERM. Los modelos in vivo siguen siendo críticos y definen el "estándar de oro" para la investigación de terapias innovadoras antes de los ensayos clínicos, pero a menudo se enfrentan al desafío del tiempo y el costo necesarios para probar hipótesis relacionadas con tumores resistentes y la recaída de la enfermedad. Como tal, el desarrollo de modelos 2D más informativos sería beneficioso para las investigaciones piloto para informar mejor el diseño preclínico posterior basado en murinos.

El modelo in vitro 2D presentado en este informe carece de la complejidad del verdadero microambiente in vivo, pero proporciona un medio rentable y reproducible para interrogar las interacciones tumorales con el microambiente que se presta específicamente para el enriquecimiento de la subpoblación quimiorresistente de células tumorales. Esta distinción es valiosa, ya que la evaluación de toda la población de células tumorales puede enmascarar el fenotipo de un grupo menor de células tumorales resistentes a la terapia que constituyen el objetivo más importante. Una ventaja adicional es la escalabilidad del modelo para adaptarse al análisis de interés. Se pueden establecer cultivos a granel para aquellos análisis que requieren una recuperación significativa de las células tumorales, mientras que los cocultivos a pequeña escala en placas de pocillos múltiples se pueden utilizar para análisis basados en PCR o evaluaciones basadas en microscopía.

Basándonos en esta necesidad, desarrollamos un modelo in vitro para abordar la heterogeneidad de la enfermedad que es característica de la leucemia linfoblástica aguda (LLA) de linaje B. Demostramos que TODAS las células, que comparten muchas características en común con sus contrapartes sanas, se localizan en distintos compartimentos de cocultivo de BMSC u OB. Se generan tres poblaciones de células tumorales que tienen fenotipos distintos que son valiosos para la investigación de la respuesta terapéutica. Específicamente, demostramos que las células (ALL) recuperadas de la población de "fase dim" (PD) del cocultivo son consistentemente refractarias a la terapia con una supervivencia que se aproxima a las células tumorales que no han sido expuestas a agentes citotóxicos. Estas células ALL, ya sea de líneas celulares establecidas o de muestras de pacientes primarios, migran por debajo de las células estromales adherentes o las capas de osteoblastos, pero pueden capturarse después de la tripsinización de los cultivos y la separación de los tipos de células mediante la utilización de columnas de partículas de dextrano reticulado (G10) tipo 10 en gel¹⁵.

Aquí presentamos una configuración de un cocultivo 2D que se puede emplear para modelar las interacciones entre las células estromales del microambiente de la médula ósea (BMSC/OB) y las células leucémicas. De particular importancia es la observación de que las células leucémicas forman tres subpoblaciones espaciales en relación con la monocapa de células estromales y que la población de EP representa una población tumoral resistente a la quimioterapia debido a su interacción con el BMSC o el OB. Además, demostramos cómo aislar eficazmente las poblaciones de células leucémicas mediante columnas G10. Cabe destacar que hemos encontrado que el aislamiento de estas subpoblaciones permite el análisis posterior de la población de EP más resistente para determinar los posibles modos de resistencia que se confieren a estas células debido a su interacción con las células estromales del microambiente de la médula ósea o los osteoblastos. Las técnicas que hemos utilizado aguas abajo de este modelo de cocultivo y aislamiento incluyen la evaluación de citometría de flujo, el análisis proteómico y la evaluación de la expresión de proteínas dirigidas, así como la ionización por electrospray por ablación láser (LAESI) desarrollada más recientemente y el análisis de caballitos de mar para evaluar los perfiles metabólicos. Mediante el uso de este modelo en combinación con las técnicas anteriores, hemos encontrado que la población de células leucémicas con EP tiene un fenotipo resistente a la quimioterapia que es único en comparación con las células leucémicas cultivadas en medios solos o las recuperadas de las otras subpoblaciones en el mismo cocultivo. Como tal, este modelo se presta a una evaluación más rigurosa para probar estrategias dirigidas a las células leucémicas más resistentes a la quimioterapia que derivan su fenotipo resistente a través de la interacción con el microambiente de la médula ósea.

Protocolo

1. Preparación Avanzada

1. Preparación de partículas de dextrano del G-10.
   1. Preparar suspensión del G-10 mediante la adición de 50 ml de PBS 1x a 10 g de partículas del G-10. Mezclar por inversión y permitir que se asiente G10 de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
   2. El día del G10 separación en columna, aspirado de PBS a partir de partículas del G-10 se establecieron y añadir 50 ml de PBS. Mezclar por inversión. Repetir dos veces, añadiendo 50 ml de PBS a las partículas del G-10 se establecieron y se almacena a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
2. El cultivo de BMSC y OB.
   1. Mantener tanto BMSC o OB a 37 ° C en 6% de CO ₂ y cultivadas en placas de cultivo de tejido de 10 cm hasta que se alcanza 90% de confluencia.
   2. Trypsinize BMSC o células OB y ​​dividieron 1: 2 a nuevas placas de 10 cm. Las células se cultivan a estos estándares hasta que se necesite para leucémica co-cultivo.

2. Establecimiento y mantenimiento de co-cultura

1. Añadir 5-20 x 10 ⁶ células leucémicas in 10 ml de medio de cultivo específico de tumor sobre un 80% -90% de confluencia BMSC o placa OB.
   NOTA: Nuestro laboratorio mantiene co-cultivos a 37 ° C en 5% de O ₂ recapitular mejor el microambiente de la médula ósea que se ha demostrado en un rango de 1% a 7% ^16-18. Sin embargo, el mantenimiento de co-cultivos en esta tensión de oxígeno no es crítica para el establecimiento de las tres subpoblaciones leucémicas y es a discreción del laboratorio.
2. Cada ^4º día eliminar todos menos 1 ml de medios de comunicación (incluyendo las células leucémicas en suspensión) y reemplazar con 9 ml de medio de cultivo fresco leucémica. Al retirar 9 ml de medio de la placa, tenga cuidado de no perturbar la capa adherente BMSC u OB.
   1. Retire los medios de comunicación por la inclinación de la placa de los medios de comunicación lateral y aspirado en la esquina de la placa. Además, cuando la adición de medio fresco, asegúrese de añadir gota a gota en la esquina de la placa contra la pared lateral para asegurar la mínima interrupción de la capa adherente BMSC u OB.
3. Después de ^los 12 días de co-cultivo, enjuagar las células leucémicas de BMSC o capa OB pipeteando medios de cultivo de plato hacia arriba y abajo suavemente sobre el plato de aproximadamente 5 a 10 veces y luego recoger en 15 ml de tubo cónico. Sembrar de nuevo en la nueva -90% confluentes BMSC 80% o placa OB tal como se describe en el paso 2.1.
   NOTA: El suave aclarado de la co-cultivo como se describe en el paso 2.3 se eliminarán las células leucémicas S y PB sin perturbar la monocapa BMSC o OB. Esto permite que las células tumorales sólo para ser transferidos a la siguiente placa de co-cultivo. Este ciclo de 12 días se puede repetir tantas veces como sea necesario en base a las necesidades del usuario.

3. Preparación de las columnas G-10 del grano

NOTA: Si se requiere el análisis de aguas abajo estéril o cultivo después de la separación la columna G-10 los siguientes pasos deben llevarse a cabo utilizando una técnica estéril y columnas del G-10 deben ser configurados en una campana biológica estéril.

1. Pre-warm medios de cultivo celular a 37 ° C en baño de agua (~ 30 ml por columna). Usando una jeringa desechable de 10 ml, retirar y desechar émbolo. Añadir lana de vidrio para jeringa.
2. Con unas pinzas, separar la lana de vidrio en hebras sueltas delgadas. Añadir múltiples capas de lana de vidrio ligeramente lleno a la jeringa hasta 2/3 de la jeringa se llena con lana de vidrio.
   NOTA: La lana de vidrio es crucial para evitar que las partículas sueltas del G-10 se contamine la colección de células leucémicas. Asegúrese de que la lana de vidrio está llena lo suficiente para mantener las partículas del G-10, pero no demasiado densamente poblada por los medios de comunicación para bloquear el flujo a través de la columna.
3. Adjuntar 1-way llave de paso para la punta de la jeringa en la posición cerrada.
4. columna jeringa pinza de anillo de pie alto lo suficiente para un tubo cónico de 50 ml (tubo de recogida) se puede colocar debajo de la llave de paso. Colocar el tubo de recogida en la columna de la jeringa.
5. Usando una pipeta de 10 ml, añadiendo, gota a gota, partículas del G-10 se volvieron a suspender en PBS a la columna en la parte superior dela lana de vidrio. Continuar añadiendo partículas del G-10 hasta que un ml de pellets ~ 2 (medido por las graduaciones de la jeringa) de partículas del G-10 formas en la parte superior de la lana de vidrio.
6. Equilibrar la columna G-10 con los medios de pre-calentado.
   1. Añadir 2 ml de medio precalentado a la columna. Abrir la llave de paso de la válvula lentamente para que los medios de comunicación fluye de la columna gota a gota.
   2. Repita el paso 3.6.1, hasta un total de 10 ml de medio precalentado han sido corrió a través de la columna.
      NOTA: Si las partículas del G-10 se ven en el flujo a través en el tubo de recogida, ya sea 1) añadir más partículas del G-10 para mantener ~ 2 ml pellet asegurándose no hay partículas adicionales G10 escapar de la columna o 2) Sustituir la columna con un uno sin usar y de repetición 3.4-3.6.1 pasos.
   3. Después de que los desagües de los medios precalentado a partir de la columna, cerrar la llave de paso y desechar el tubo de recogida a través del flujo. Añadir un nuevo tubo de recogida en la columna. Columna está listo para ser cargado con los medios de mezcla de células +.
      Nota: Las columnasdebe utilizarse inmediatamente y no se deja secar.

4. La separación de 3 subpoblaciones dentro de Co-cultura

1. Colección de subpoblación de suspensión (S) tumor.
   1. Aspirar los medios de placa de co-cultivo con una pipeta y suavemente volver a aplicar los mismos medios para enjuagar la placa y recoger un medio que contiene células leucémicas en un tubo cónico de 15 ml. Las células leucémicas recogidos son la subpoblación S.
2. Colección de la Fase brillante (PB) subpoblación de tumores.
   1. Añadir 10 ml de medio fresco de nuevo en la placa de co-cultivo. Enjuague vigorosamente con la pipeta medios añadidos arriba y hacia abajo aproximadamente 5 veces para eliminar las células leucémicas adherentes, pero no lo suficiente para desalojar adherente BMSC / OB componente.
   2. Aspirar con la pipeta y recoger los medios de comunicación en un tubo cónico de 15 ml. Las células recogidas son la subpoblación PB.
3. Colección de la Fase Dim (PD) subpoblación de tumores.
   1. placa de enjuague con 1 ml de PBS a REMresiduos de medios de ove. Trypsinize placa de co-cultivo con 3 ml de tripsina y el lugar en incubadora a 37ºC durante 5 min.
   2. Retire la placa de la incubadora y golpear suavemente lados de la placa para desalojar adherente BMSC / OB.
   3. Añadir 1 ml de suero bovino fetal (FBS) y la pipeta arriba y abajo 3-5 veces para romper los grandes agregados celulares.
   4. Recoger los medios de comunicación con las células en un tubo cónico de 15 ml. Estas células son la subpoblación PD no purificada con BMSC / OB también.
4. Centrífuga 3 subpoblaciones aisladas a 400 xg durante 7 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante luego volver a suspender de forma individual gránulos en 1 ml de medio precalentado. Las células están listas para ser cargado en una columna de G10.

5. Carga de co-cultivo de células en la columna G-10

NOTA: Asegúrese de que la llave de paso está completamente cerrado antes de añadir las células que contienen los medios de comunicación a la columna G-10. Además, cada subpoblación debe ser corrió por una columna G10 separada a fin de no introe cualquier sesgo entre las poblaciones en el análisis de aguas abajo.

1. Con una pipeta de 1.000 l, añadir 1 ml de cada una subpoblación de células en medios pre-calentado a una columna G-10 por separado, gota a gota. Asegúrese de que los medios de comunicación que contiene las células se mantiene en la parte superior o dentro de pellets G10. Permitir que las células se incuban en pellet G10 durante 20 min a RT.
   NOTA: Llave de paso se mantiene cerrado por la duración de la incubación.

6. Recogida de las células leucémicas del G-10 Columna

1. Añadir 1-3 ml de medio precalentado a cada columna G-10. Abrir la llave de paso de la válvula y permitir que los medios para salir lentamente gota a gota la columna.
   NOTA: Es fundamental mantener una tasa de flujo lento de la columna o el sedimento que contiene G10 BMSC / OB puede lavar fuera de la columna y contaminar las células leucémicas aisladas.
2. Continuar añadiendo medios de pre-calentado en incrementos pequeños (1-2 ml) a la columna G-10, hasta un total de 15 a 20 ml se ha ejecutado a través de la columna y se ha recogido. Cerrar la llave de paso VAlve tubo de recogida y la tapa.
   NOTA: Si un pellet de partículas G10 se ve en la parte inferior del tubo de recogida, los medios de comunicación eliminar suavemente del tubo dejando pellet de partículas G10 no perturbado y la transferencia a un nuevo tubo.
3. Centrifugar recogió el medio a 400 xg durante 7 min a TA. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en tampón apropiado para la aplicación de aguas abajo.
4. Las células son ahora una población pura de células leucémicas libres de BMSC o contaminación OB y ​​están listos para ser aplicados a las aplicaciones posteriores a discreción del usuario.
   NOTA: la viabilidad celular leucémica debe permanecer sin cambios cuando pasa a las células a través de columnas del G-10.

Resultados

La configuración correcta y la cultura de este modelo de co-cultivo se traducirá en el establecimiento de 3 subpoblaciones de células leucémicas en relación con el adherente BMSC o OB monocapa. La Figura 1 muestra cómo todas las células sembradas en una monocapa BMSC aparecen inicialmente como una única población de suspendido células leucémicas. En el transcurso de 4 días las células leucémicas interactúan con el BMSC para formar 3 subpoblaciones espacial de las células...

Discusión

enfermedad mínima residual (MRD) que contribuye a la recaída de la enfermedad sigue siendo un importante reto clínico en el tratamiento de refractario agresivo ALL, así como, una serie de otras enfermedades malignas hematológicas. El microambiente de la médula ósea es el sitio más común de recidiva en TODA ^3,8. Como tal, los modelos que modelan el microambiente de la médula ósea son herramientas vitales para poner a prueba hipótesis relacionadas con la supervivencia de las células tumorales de leucemia y mant...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
G10 cuentas de sephadex	Sigma	G10120	Referido en el manuscrito como tipo de gel 10 partículas de dextrano reticulado
10 ml jeringa estéril	BD	309604
Lana de vidrio	Pyrex	3950
llaves de paso de 1 vía	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml Productos	médicos mundiales	41021039	Utilizados como tubos de
recolección Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml	médicos mundiales	41021037	Utilizado para la recolección de células
Suero fetal bovino	Sigma	F6178
0.05% Tripsina	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Placas de cultivo celular	Greiner Bio-One	664160
Medios de cultivoMedios de
cultivo de osteoblastos	PromoCell	C-27001	Para medios de osteoblastos humanos
RPMI 1640 medios	Mediatech, Inc.	15-040	Para la preparación de medios tumorales
adherentes <
fuertes>:
PromoCell	C-12720	osteoblastos	humanos se cultivaron según el proveedor. s recomendaciones.
		estromales	de leucemia humana y médula ósea (BMSC) fueron proporcionadas por el Centro de Procesamiento de Biomuestras del Centro Oncológico Mary Babb Randolph (MBRCC) y el Banco de Tejidos del Departamento de Patología de la Universidad de Virginia Occidental. Los cultivos de BMSC se establecieron como se describió anteriormente (*)
:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	Las células REH se cultivaron según el proveedor. recomendaciones y medios recomendados.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 se cultivaron de acuerdo con el proveedor' recomendaciones y medios recomendados.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Alteración de la función de las células estromales de la médula ósea por etopósido. Trasplante de médula sanguínea Biol J Am Soc Trasplante de médula sanguínea. Agosto de 1997; 3(3):122–32.