Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

Summary

Este protocolo presenta un método para llevar a cabo cuantitativa, de una sola célula en el análisis in situ de la expresión de la proteína a estudiar especificación linaje en embriones de preimplantación ratón. Los procedimientos necesarios para la recogida de los blastocistos, todo el montaje de detección de inmunofluorescencia de las proteínas, se describen las imágenes de las muestras en un microscopio confocal, y la segmentación nuclear y análisis de imágenes.

Abstract

Este protocolo presenta un método para llevar a cabo cuantitativa, de una sola célula in situ análisis de expresión de la proteína a estudiar especificación linaje en la preimplantación de embriones de ratón. Se describen los procedimientos necesarios para la recogida de embriones, la inmunofluorescencia, la formación de imágenes en un microscopio confocal, y la segmentación de imágenes y análisis. Este método permite la cuantificación de la expresión de múltiples marcadores nucleares y el espacial (XYZ) coordina de todas las células en el embrión. Se aprovecha de minutos, una imagen herramienta de software de segmentación desarrollado específicamente para el análisis de imágenes confocal de preimplantación de embriones y las colonias de células madre embrionarias (ESC). MINUTOS lleva a cabo la segmentación nuclear sin supervisión a través de la X, Y y Z dimensiones, y produce la información sobre posición de la célula en el espacio tridimensional, así como los niveles de fluorescencia nucleares para todos los canales con la entrada del usuario mínima. Mientras que este protocolo se ha optimizado para el análisis de imágenesde preimplantación de embriones de ratón etapa, que puede ser fácilmente adaptado para el análisis de cualquier otras muestras que exhiben una buena relación señal-ruido y donde la alta densidad nuclear supone un obstáculo para la segmentación de imágenes (por ejemplo., análisis de expresión de células madre embrionarias (ESC ) colonias, células en cultivo, los embriones de otras especies o etapas, etc.) de diferenciación.

Introduction

El embrión de preimplantación ratón es un paradigma para el estudio de la aparición y el mantenimiento de la pluripotencia in vivo, así como un modelo para el estudio de la especificación del destino celular y la epitelización de novo en mamíferos. Las etapas de preimplantación de desarrollo de los mamíferos están dedicados a la creación de los tres linajes de células que componen el blastocisto, a saber, el epiblasto pluripotenciales - que da lugar a la mayoría de los tejidos somáticos y las células germinales - y dos linajes extraembryonic, la trophectoderm (TE) y la endodermo primitivo (PRE) (Figura 1A) ^1,2. Este protocolo describe los procedimientos a (1) los embriones de ratón de la cosecha y fijar fase de preimplantación, (2) realizar inmunofluorescencia para etiquetar proteínas de interés, (3) llevar a cabo todo el montaje de imágenes utilizando un microscopio confocal con capacidades y Z-seccionar (4) realizar la segmentación nuclear de imágenes confocal y análisis de imagen cuantitativo subsiguiente. Este gasoducto permite tque Unbiased medición de los niveles de proteína para la asignación de identidades de células para caracterizar subpoblaciones de células in situ. Este protocolo puede ser llevado a cabo en tan poco como 3 - 4 días para un sola camada (generalmente hasta 10 embriones de ratón), de la colección de embrión para el análisis de datos (Figura 1B). El análisis simultáneo de varias camadas aumentaría la formación de imágenes y análisis de datos carga de tiempo, extendiendo así la longitud total del protocolo.

El embrión de preimplantación etapa ratón es un sistema experimentalmente tratable que, dado su pequeño tamaño y morfología estereotipada ^3, es muy adecuado para formación de imágenes en toto de procesos celulares con resolución de una sola célula. Para llevar a cabo un análisis imparcial, a nivel de sistemas de un número estadísticamente relevante de embriones, un ducto de análisis cuantitativo automatizado es deseable. Sin embargo, debido a la alta densidad nuclear de la masa celular interna (ICM) del blastocisto ( Figura 1A, 2D), plataformas de segmentación de imágenes convencionales no proporcionan la suficiente precisión para establecer un flujo de trabajo automatizado o semi-automatizado. Por otra parte, la segmentación manual, mientras que precisa, no permite el procesamiento de grandes cohortes de células y embriones, ni es adecuado para una determinación reproducible, no sesgada de las identidades de células - que es especialmente crítico en el estudio de las etapas de desarrollo donde los patrones de marcador expresión no se han resuelto por completo (por ejemplo, no presentan una distribución binaria en una población). Recientemente hemos desarrollado y validado un método de segmentación de imágenes adaptada a embriones en fase de preimplantación ratón y de células madre embrionarias de ratón (CES) que logra una alta precisión, mientras que requiere una intervención mínima del usuario ^4-8.

El análisis de tuberías que se presenta aquí gira en torno a la herramienta de segmentación de imágenes basados ​​en MATLAB modular interactivo Nuclear Segmentación (minutos) ^4. p MINUTOSerforms Segmentación nuclear sin supervisión de grandes lotes de confocal Z-pilas después de que el usuario ha establecido un número mínimo de propiedades de imagen, usando una interfaz gráfica de usuario (GUI) (Tabla 1) ^4. Este oleoducto ha demostrado eficaz para la generación de datos de alto rendimiento en la expresión de proteínas y la localización celular en tanto de tipo salvaje, experimentalmente tratados y los embriones y los CES ^5-7 modificado genéticamente. En el presente protocolo, se describe la aplicación de minutos para la segmentación de imágenes de preimplantación de embriones de etapa. Para ver ejemplos de rendimiento MINUTOS en CES por favor refiérase a ^4,7. La etapa de segmentación nuclear automatizado reduce significativamente la carga de tiempo del proceso de identificación de células, mientras que las mediciones de la intensidad espacial y de fluorescencia permiten una determinación imparcial de las identidades de células y la generación de mapas tridimensionales de los dominios de expresión de genes y la posición de células en el embrión (figura 1C ). Además, la escalabilidad de este flujo de trabajo hace que sea aplicable al análisis de camadas individuales a través de grandes cohortes de embriones tratados experimentalmente, o embriones de diferentes orígenes genéticos ^5,6. MINUTOS está disponible gratuitamente en http://katlab-tools.org (el software requiere una licencia de MATLAB).

No se enfoque desarrollado hasta la fecha permite la generación de dichos datos en profundidad sobre la expresión de proteínas y localización celular en la preimplantación de embriones de ratón. Todos los intentos hasta ahora en la cuantificación de estos tipos de datos se han limitado a la determinación manual y la cuantificación del número de células para diferentes poblaciones en el embrión (ya sea totalmente manual o asistida por software) ^9-19. Este enfoque (que incorpora el software minutos) ha sido adaptado para y probado en la preimplantación de embriones de ratón y los CES; sin embargo su rendimiento en otros sistemas con alta densidad nuclear, aunque aún no probado, se espera que sea equivalente.

Protocol

Ética: que realmente todos los animales de trabajo, incluyendo la cría, la cría y el sacrificio fue aprobado por el Comité Memorial Sloan Kettering Cancer Center de Animales institucional Cuidado y Uso (IACUC), protocolo # 03-12-017.

1. Recolección de embriones

Nota: Todos los animales de trabajo debe haber sido aprobado por las autoridades institucionales y locales y se ajusten a las normas locales e institucionales.

1. Mate de un ratón hembra virgen con un macho fértil perno de los genotipos deseados.
   Nota: Si la configuración de la monta natural, la selección de las hembras en la fase de estro del ciclo estral aumenta las posibilidades de la cópula en la fecha deseada. Si inducir la superovulación, por favor refiérase a los protocolos descritos en ^{el 20.}
2. Verificar la presencia de un tapón vaginal la mañana usando una sonda roma. Lo ideal es hacerlo antes del mediodía (12:00 horas), como los tapones de copulación se pierden durante todo el día. Considere noon de detección del día embrionario tapón vaginal (E) 0.5.
3. En el día y hora de desarrollo embrionario deseado, calentar M2 o enrojecimiento de soporte del medio (FHM) a RT o, preferentemente, 37 ºC. Nota: Cualquiera de M2 ​​o FHM se pueden utilizar para el lavado y embriones de manipulación. Cuando no está en uso, almacene estos medios a 4 ºC. Estimar el uso de ~ 2 ml de medio para cada útero.
4. Descongelar los productos 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o preparar un poco de solución fresca. Estimar 500 l de solución de PFA 4% por pocillo de una placa de 4 pocillos. Fijar una camada en cada pocillo de una placa de 4 pocillos. Nota: Como alternativa, una placa de 96 pocillos se puede utilizar para fijar y conservación de los embriones. Si se utiliza una placa de 96 pocillos, utilizar 100 l de solución de PFA por pocillo.
5. Tire de una pipeta Pasteur de vidrio utilizando una llama abierta para dibujar un extremo capilar en la punta.
6. Sacrificar femenina por dislocación cervical o _inhalación de CO2, o de lo requerido por las regulaciones locales e institucionales. A menudo es desirable para confirmar la eutanasia del animal por dislocación cervical.
7. Pulverizar vientre del animal con 70% de etanol para reducir al mínimo la caída del cabello y realizar una incisión abdominal, primero a través de la piel y, posteriormente, a través de la pared del cuerpo (peritoneo) para exponer las vísceras.
   Nota: Los siguientes pasos describen el procedimiento para recoger blastocistos de útero de un ratón hembra embarazada en cualquier etapa entre E3.25 y E4.5 (Figura 1A). Para los protocolos de recogida de embriones de preimplantación anteriores a E3.25, consulte ^20.
8. Busque el útero y extraer del animal. Sostiene el extremo cervical del útero con un par de pinzas, corte a través del cuello uterino y tire hacia arriba suavemente para estirar las dos cuernos uterinos.
9. Retire la grasa del útero, teniendo cuidado de no perforar la pared uterina. Esto se puede hacer fácilmente en el momento de la eliminación, mientras que todavía unido al cuerpo del animal, como el útero se puede estirar hacia fuera. Alternativamente,se puede hacer más tarde, bajo un microscopio de disección, en RT PBS. Para un protocolo más detallado en la disección del útero, consulte Protocolos 5 y 8 ²⁰
10. Corte por encima de los oviductos, por debajo de los ovarios, para liberar todo el útero, el lugar en una placa de Petri y cubrir con PBS.
    Nota: Este paso también permite el lavado del exceso de sangre u otros residuos del útero, lo que facilita su posterior recolección de blastocisto.
11. cuernos uterinos separados tanto por el corte a través del extremo proximal, a ambos lados del cuello uterino y descartar el cuello uterino. Separar cada oviducto del útero cortando por debajo del istmo que ellos (Figura 1A) se conecta. Transferencia de ambos cuernos a una gota de medio de manipulación (ya sea M2 o FHM) para la recogida y manipulación de embriones.
12. Bajo un microscopio de disección, los blastocistos ras fuera del útero y en el medio forzando 0,5 - 1 ml de M2 ​​o FHM a través de cada cuerno uterino de la abertura cervical. Use un 1ml jeringa con una aguja hipodérmica. Nota: La aguja puede ser mitigado mediante una piedra de presentación para evitar que se rompa el cuello, aunque esto no es crítico. Un diagrama detallado para el lavado uterino se puede encontrar en ^21.
13. Utilizando el microscopio de disección, localizar los blastocistos, que se encuentran dispersas en la gota de medio. Tiempo máximo a 1 - 2 min para los blastocistos se hundan hasta el fondo del plato después del lavado. El uso de la boca controlado, pipeta Pasteur de vidrio con un extremo capilar, recoger todos los blastocistos y transferir a una nueva caída de los medios de comunicación.
14. Enjuague blastocistos moviéndolos a través de 2 - 3 gotas de M2 ​​fresco o FHM. Mueva embriones en grupos de 5 - 10 blastocistos a la vez.
    Nota: Al mover grupos más grandes a la vez que acelerará el proceso, sino que también aumentará las posibilidades de perder accidentalmente muchos embriones. Si no entrenados en el uso de pipetas de boca controlados, la práctica de la manipulación de embriones y la transferencia debe ser considerado antes de que Beginning el experimento.
15. Retire la zona pelúcida (ZP) de blastocistos eclosionados (generalmente
16. Tenga cuidado al manipular los blastocistos desnudas, ya que se adhieren fácilmente a las superficies de vidrio y plástico. medio de la manipulación contiene 4 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) para impedir la adhesión, pero el ácido Tyrode o PBS no lo hacen, por lo tanto, para reducir el riesgo de daño o pérdida de los embriones no recoger más de 2 - 5 blastocistos desnudas en un momento en su manipulación en BSA-libre o libre de suero PBS o ácido Tyrode.
    Nota: Como alternativa, cubra la pipeta de vidrio con 1% de BSA antes de su uso para reducir la adherencia de los embriones a la superficie del vidrio.

Cubra el fondo de cada pocillode una placa de cultivo de tejido 4 pocillos con una capa delgada de agar al 1%, 0,9% de NaCl para evitar embriones se adhiera al plástico. Alternativamente, añadir 4 mg / ml de BSA al PBS (PBS-BSA).

Llenar un pocillo de la placa de cultivo tisular 4 pocillos recubierta con 500 l de RT PBS (o PBS-BSA) y otro pozo con 500 l de 4% PFA en PBS.

Enjuague blastocistos en RT PBS y fijar en 4% PFA en PBS durante 10 min a TA. Transferencia a PBS (o PBS-BSA) después de la fijación.

Si los embriones no van a ser procesados ​​inmediatamente, cubra el PBS que contiene los embriones con una capa de aceite mineral para evitar la evaporación (que conduce a la desecación de la muestra) y almacenar la placa a 4 ºC.
Nota: Los diferentes métodos de fijación y los tiempos se pueden utilizar dependiendo del experimento, los epítopos de interés y los anticuerpos que se utilizarán. Cualquiera que sea el método de elección, sea constante a través de experimentos equivalentes para facilitar la posterior comparación de los resultados de la tinción.
Nota: Pausapunto: Los embriones se pueden almacenar a 4 ºC en PBS durante hasta varias semanas antes de proceder al siguiente paso. Asegúrese de PBS es estéril y / o añadir 100 U / ml de penicilina + 100 mg / ml de estreptomicina (Pen-Strep) para evitar la contaminación bacteriana (especialmente cuando se utiliza PBS-BSA) si se anticipa un almacenamiento prolongado.

2. La inmunofluorescencia

1. Realizar inmunofluorescencia utilizando cualquier protocolo que previamente ha sido probado y demostrado ser robusto para todo el montaje de inmunofluorescencia. Nota: Se recomienda que se describen ^en el 22 ^y el 11. En este artículo, la antigua se describirá. Cualquiera que sea el método de elección, sea constante a través de experimentos equivalentes a facilitar la comparación de los resultados de la tinción.
2. Utilice una solución flexible, de vinilo, de fondo en U placa de 96 pocillos clara para llevar a cabo los pasos secuenciales del protocolo de inmunofluorescencia. Llenar cada pocillo con 50 - 100 l de solución y mover los embriones de una solucióna otro usando una pipeta de boca en forma de L. Nota Este enfoque minimiza el uso de reactivos y facilita pasos de seguimiento, así como la tinción en paralelo de varios grupos experimentales.
   1. Opcional: cubrir el fondo de los pocillos con una capa delgada de agar al 1%, 0,9% de NaCl para evitar la adhesión de los embriones al plástico. No añadir BSA para soluciones de inmunofluorescencia.
3. Preparar PBX (0,1% Triton X-100 en PBS). Si anticipando la realización de diversos experimentos de inmunofluorescencia, preparar 50 ml de PBX y se almacena a 4 ° C entre los experimentos.
4. Preparar la solución de permeabilización (0,5% Triton X-100, 100 mM de glicina en PBS). Hacer 1 ml (o cualquier cantidad necesaria) de la solución de permeabilización fresco para cada experimento.
5. Preparar la solución de bloqueo (2% de suero de caballo (HS) o 20% de suero bovino fetal (FBS) con Pen-Strep en PBS). Preparar 10 ml y se almacena a 4 ° C entre los experimentos.
   1. No se han observado diferencias entre cualquieratipo de suero, sin embargo, sea consistente en la elección de la solución utilizada para los experimentos de equivalentes de bloqueo.
6. Enjuague los embriones fijos durante 5 min a RT en PBX (~ 100 l).
7. Permeabilizar embriones durante 5 min a RT en una solución de permeabilización (~ 100 l).
8. Enjuague embriones durante 5 min a RT en PBX (~ 100 l).
9. embriones de bloque para la 30 min a 1 h a RT en ~ 100 l de solución de bloqueo. Cubrir la solución con una capa de aceite mineral para evitar la evaporación o mantener en una cámara humidificada.
   Nota: Los embriones pueden ser bloqueados para un máximo de S / N períodos a 4 ºC y sin notable mejora o detrimento cuando se compararon con 30 min etapas de bloqueo.
10. Incubar los embriones O / N a 4 ºC en el anticuerpo primario / anticuerpos se diluyeron en solución (~ 100 l) de bloqueo. Cubrir la solución con una capa de aceite mineral para evitar la evaporación o mantener en una cámara humidificada.
    1. Determinar la dilución óptima para cada anticuerpo primario de antemano. véase D.ISCUSION y Materiales sección para diluciones ensayadas de una serie de anticuerpos.
11. Después de O / N de incubación, los embriones enjuagar 3 veces durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente en PBX (~ 100 l).
12. embriones de bloque para la 30 min a 1 h a RT en ~ 100 l de solución de bloqueo. Cubrir la solución con una capa de aceite mineral para evitar la evaporación o mantener en una cámara humidificada.
13. Incubar los embriones durante 1 a 2 horas a 4 ºC en anticuerpo secundario / anticuerpos diluido a 4 g / ml en ~ 100 l de solución de bloqueo. Cubrir la solución con una capa de aceite mineral para evitar la evaporación o mantener en una cámara humidificada.
14. Enjuague embriones 2x durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente en la PBX.
15. Mueva los embriones a la mancha de ADN preferida. Si el uso de Hoechst 33342, diluir hasta 5 g / ml en PBS. Cubrir la solución con una capa de aceite mineral para evitar la evaporación o mantener en una cámara humidificada.
    Nota: punto de pausa: Si los embriones no se que se tomará imágenes de inmediato, se pueden mantener para up a varias semanas en solución de tinción nuclear. En este caso, asegúrese de PBS es estéril y / o añadir Pen-Strep o azida de sodio para evitar el crecimiento bacteriano y la contaminación.

3. Imagen confocal

Nota: Las configuraciones de microscopio confocal individuales requerirán parámetros de adquisición específicos de ser ajustada por el sistema y el software en su lugar. Sin embargo, la siguiente sección se ofrece un conjunto de reglas generales a seguir que debe ser aplicable a cualquier instalación dada.

1. Con una pipeta de boca fina, hacer microgotas de PBS o solución de tinción nuclear en la superficie de vidrio de un plato con fondo de vidrio de 35 mm y cubrir con aceite mineral. Como alternativa, utilizar un cubreobjetos regular con separadores de silicona para evitar dañar los embriones y cubrir con un portaobjetos de vidrio. Nota: Cuando se utiliza un cubreobjetos regular, los embriones no pueden ser posteriormente re-posicionados o recuperarse para el genotipado, por lo tanto, se recomienda encarecidamente el uso de vidrio de fondoplatos.
2. Coloque los embriones en las microgotas y organizar de una manera consistente, preferiblemente con el eje ICM-cavidad paralela a la superficie de vidrio. Configurar plato en el soporte de microscopio. Nota: Las imágenes obtenidas en el microscopio confocal de barrido láser sufren de una pérdida asociada del eje Z de la intensidad de fluorescencia. Por lo tanto, la coherencia en la disposición es importante para la comparación de intensidades entre las regiones equivalentes en los diferentes embriones.
3. Configurar los parámetros de referencia utilizando embriones de tipo salvaje que no han sido objeto de ningún tipo de tratamiento que puede alterar la expresión génica.
   1. Adquirir imágenes con un objetivo de gran aumento (es decir, 40X o superior) con el fin de obtener datos que faciliten la segmentación precisa el uso de la herramienta MINUTOS ^4.
      Nota: El uso del zoom digital en un objetivo 20X no producirá imágenes de una resolución adecuada para la segmentación utilizando minutos. También hay que destacar la distancia de trabajo (DT) del objetivo, como debe sersuficiente para permitir la adquisición de una Z-pila que se extiende por un blastocisto todo, por lo tanto una larga WD (~ 130-150 micras) objetivo suele ser necesario. Las imágenes mostradas en las Figuras 2 - 4 se adquirieron usando un 1,30 aceite 40X / NA objetivo de inmersión con una distancia de trabajo de 210 micras.
   2. Utilice la salida del láser más bajo que proporciona una fuerte relación señal-ruido y sin blanquear los fluoróforos.
   3. Ajustar la ganancia y el offset para obtener el rango dinámico más amplio y sin la sobreexposición de la muestra. La exposición de las imágenes para cubrir la mayor parte de, o abarcan toda la gama, escala de grises facilitará la detección de pequeñas diferencias de intensidad entre las imágenes.
   4. Use un pequeño (1 m) de Z a paso, desde el eje Z resolución es crítica para la segmentación precisa con MINUTOS.
      Nota: Las dimensiones XY no afectan el proceso de segmentación nuclear, sólo el tamaño de archivo de imagen. En general, 512 x 512 píxeles de resolución es un XY suficiente para imágenes con calidad de publicación sin compromicantar espacio en disco duro.
   5. Paso crítico: Mantenga la formación de imágenes parámetros consistentes dentro ya través de las sesiones de formación de imágenes del mismo experimento con el fin de poder comparar las muestras.
4. Imaging lotes de embriones:
   1. grupos de imágenes coherentes (camadas, experimentos) en una sola sesión siempre que sea posible.
   2. Mantener parámetros consistentes dentro ya través de las sesiones de formación de imágenes de repeticiones del mismo experimento.
   3. embriones de imagen a lo largo (eje Z conjunto) para capturar cada célula.
      Nota: Si se desea, la genotipificación embrión se puede hacer después de formación de imágenes como se describe en ^23. La necesidad de PCR anidada tiene que ser determinada empíricamente y dependerá del locus para ser analizados y los cebadores utilizados.
5. Asegúrese de ser capaz de igualar los embriones de las imágenes de forma retrospectiva.

4. Análisis de Imágenes y Datos Pre-procesamiento

1. Descargar e instalar MINUTOS ⁴ de http: // katlab-tools.org (licencia de MATLAB requiere).
2. Realizar la segmentación de imágenes:
   1. Siga la interfaz gráfica de usuario (GUI) de minutos para cargar una imagen confocal o pila de la unidad de disco duro, detectar los núcleos y segmentar la imagen. Cargar toda la pila Z de los datos brutos generados por el microscopio (.lsm, .lif, .oif, etc.). Véase la Tabla 2 para más detalles sobre cada paso y las instrucciones que se encuentran en http://katlab-tools.org y ^4. Una vez completado, ver el resultado de cada paso haciendo clic en el botón correspondiente "Ver". Una etiqueta amarilla encima del botón indica la operación en curso, una etiqueta verde indica operación se ha completado.
      Nota: min actualmente no es compatible con archivos .czi, .tiff secuencias o archivos de varias posiciones - cada pila Z tiene que ser un archivo independiente.
   2. Después de la segmentación satisfactoria, guardar la tubería creado por lo que se puede utilizar directamente para otras embriones o camadas.
3. Batch-Modo de segmentación:
   Nota: Single archivos se pueden segmentar de forma individual. Sin embargo, dado que los embriones dentro de una camada o experimento son generalmente de la etapa comparable, MINUTOS puede aplicar la tubería segmentación creado para una sola imagen a un grupo de ellos sin supervisión.
   1. En el menú Batch-Modo de ejecución, haga clic en "Agregar archivos" y cargar todos los archivos a procesar a la vez. Nota: los archivos de diferentes fuentes se pueden añadir a la cola de la segmentación.
   2. Haga clic en "Start Batch-Modo Run 'y dar tiempo a que el software para procesar los archivos. Nota: La salida de segmentación se guardará en el mismo directorio en el que se localizan los archivos originales.
4. evaluación de la segmentación y la corrección manual
   Nota: min segmentos de imágenes con una precisión muy alta (> 85%), sin embargo, la calidad de la tinción y formación de imágenes, así como la etapa del embrión, pueden afectar al rendimiento minutos. En general, cuanto mayor sea la densidad nuclear dentro del embrión, los errores de segmentación más probable que tome place (Figuras 2D, 3). Por lo tanto, la precisión de la segmentación debe ser evaluado para cada muestra y se corrige manualmente si es necesario. Dos tipos de errores ocurren típicamente: el exceso de segmentación y bajo-segmentación.
   1. Resolver sobre-segmentación:
      1. Identificar a los falsos positivos - vesículas apoptóticas (Figura 3A a, b, d, asteriscos) u otros elementos que no son núcleos intactos, pero que pueden haber sido identificado como tal por minutos.
         Nota: Por lo general este tipo de falsos positivos tienen un tamaño menor que los núcleos reales y pueden, en la mayoría de los casos, ser identificados y ordenados en la hoja de cálculo con facilidad. Sin embargo, es muy recomendable un examen visual, como muchas veces los núcleos pueden ser segmentados sólo parcialmente, resultando en una, pero el volumen segmentado válido más pequeño (Figura 3A b, punta de flecha).
      2. Eliminar los registros correspondientes de falsos positivos desde el archivo * statistics.csv. Preservar las estadísticas originales *.csv para futura referencia y editar sólo una copia del mismo.
      3. Si un núcleo ha sido sobre-segmentado y presentado como 2 o más núcleos (Figura 3A c, flecha y puntas de flecha), o bien combinar los registros promediando su nivel de intensidad o, en caso semejante, tenga uno de los registros de esa célula y desechar el descanso.
   2. La resolución de sub-segmentación:
      1. Identificar eventos donde MINUTOS ha fallado en detectar la frontera entre dos o más núcleos y por lo tanto ellos segmentados como un único núcleo (Figura 3A d, flecha y 3B). Nota: Esto plantea un problema para un recuento de células exacta, pero lo más importante, para la cuantificación de los niveles de proteína, ya que los niveles medidos será el promedio de las células que han sido erróneamente fusionado, y que pueden pertenecer a diferentes linajes.
      2. Identificar eventos en los que ha fracasado MINUTOS para detectar un núcleo completo.
      3. En estos casos (4.4.2.1 y 4.4.2.2), medir los niveles de gris promedio fo cada canal en la célula (s) sub o no-segmentado utilizando una herramienta alternativa, como ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), y reemplazar el registro erróneo con los niveles correctos. Conservar el archivo statistics.csv * original para futuras consultas y editar sólo una copia del mismo. Para hacer esto usando ImageJ, siga estos pasos:
         1. Abra la pila de múltiples canales relevante en ImageJ e importar el archivo overlaid.tiff * correspondiente generada por minutos ya una pila virtual ( "Archivo"> ​​"Importar"> "TIFF pila virtual ... ').
         2. Encuentra una sección media del núcleo sub o un-segmentado.
         3. Con la herramienta Selección a mano alzada delinear el perímetro del núcleo sub o un-segmentado en el canal de la mancha de ADN.
         4. Presione Crl + M (Cmd + M en un Macintosh) o ir al menú Analizar y seleccionar "Medir". Esta acción se registrará el valor de gris medio para el área delimitada y la mostrará en una nueva ventana. Ir a "Analizar">9; mediciones Set ... 'y asegúrese' Valor medio del gris 'se selecciona. Seleccione cualquier otro parámetro que se desea medir.
         5. El uso de la misma área indica en el paso 4.4.2.3.3, repetir la medición para cada uno de los canales de fluorescencia de interés. Los resultados se anexarán a la anterior en la ventana de las mediciones "Resultados".
         6. Utilizar las mediciones obtenidas para reemplazar los registros erróneos en el archivo * statistics.csv. Si el núcleo no había sido segmentada, insertar una nueva fila, asignarle un nuevo identificador de celda e introducir los valores obtenidos en ImageJ en la columna correspondiente para cada canal. Esta célula no tendrá coordenadas espaciales (x, y y z valores). Si el núcleo había sido undersegmented, duplicar su fila, asignar diferentes identificadores de celda a cada nueva célula e introducir los valores obtenidos en ImageJ en la columna correspondiente. En este caso, tanto las células compartirán coordenadas espaciales.
            Nota: Si la distribución espacial se va a analizar, nos recommend excluyendo las coordenadas XYZ de estas células, ya que se superponen. Con este fin, cuando se crean nuevos registros, asignar identificadores de celda a los que se distinguen fácilmente de los originales (por ejemplo los números, no entero).
   3. Puntuación células que se dividen. Nota: min detecta mitótico, así como núcleos en interfase, pero no puede distinguir entre ellos.
      1. Si núcleos mitótico han de considerarse por separado en el análisis, anotar manualmente estos y añadir esta información al archivo de datos. Para grabar las células mitóticas, añadir una nueva variable (columna) para el archivo de datos statistics.csv * y asignar diferentes valores a mitótico y los núcleos en interfase.
5. Preprocesamiento de datos.
   Nota: Una vez que las hojas de cálculo han sido corregidas por exceso o en defecto de segmentación que están listos para ser analizados. El proceso de análisis y presentación de datos dependerán del experimento específico. Sin embargo, a continuación son algunas transformaciones de datos generalesse recomienda llevar a cabo antes del análisis:
   1. Transformar los valores de intensidad de fluorescencia en su logaritmo o raíz cuadrada para reducir la dispersión de los datos. Esto también ayuda a la visualización, como los datos en bruto tienden a concentrarse cerca de los ejes de la trama (véase la Figura 4B, C).
   2. Corregir la atenuación asociada Z-de fluorescencia:
      Nota: La intensidad de fluorescencia de barrido láser confocal de imágenes de microscopía disminuye cuanto más profundo en el eje Z se encuentra una rebanada (Figura 4E, F).
      1. Si uno de los epítopos detectado en las muestras es una limpieza marcador nuclear ubicua y expresado de forma homogénea, normalizar las intensidades de fluorescencia de los otros epítopos dividiendo sus valores en cada celda por el valor correspondiente del marcador de limpieza.
      2. En ausencia de un marcador de dicha referencia, compensar pérdida asociada Z-de la fluorescencia de la manera siguiente:
         1. Colocar los valores de cada marcador (Yeje de la gráfica) sobre la posición Z (eje x de la gráfica) para visualizar la disminución de la intensidad con el Z - parcela juntos los valores de todo el control, los embriones de tipo salvaje (Figura 4F).
         2. Ajustar un modelo lineal (curva de regresión) a la trama obtenida en el paso anterior (valores de intensidad sobre Z) para cada marcador (Figura 4F).
         3. Corregir todos los valores para cada marcador utilizando la siguiente fórmula:
            log (valor original) + Z * pendiente del modelo (Figura 4D, G).
            Nota: Los pasos específicos para llevar a cabo esta corrección dependerá del software de análisis utilizado (R, MATLAB, etc.). Si se usa R, ejecute la siguiente fórmula para ajustar un modelo lineal a los datos:
            > Lm (log (canal) ~ Z, los datos de trama de datos =)
            en donde, el canal es el canal de fluorescencia que ser corregido, Z es la coordenada Z y trama de datos es la tabla que contiene todos los valores para el embrión (s) deseada (el * statistics.csv archivo generado por minutos o una modificación de la misma).
            Nota: La salida de la fórmula anterior tendrá el siguiente formato:
            (Intercepción) Z
            4,76373 -0,01947
            donde, el valor Z es la pendiente de la línea de regresión para ese conjunto de datos, cuyo valor absoluto se debe utilizar para modificar el valor original con la fórmula dada en 4.5.2.2.3 (véase la Figura 4G para un ejemplo).

Results

Para facilitar la interpretación y presentación de datos, se debe tener cuidado de no dañar los embriones durante la recogida y manipulación, por lo que todas las células y su posición relativa se pueden analizar Figura 2A -. D muestra ejemplos de blastocistos intactas en diferentes etapas con una cavidad expandida. Si se producen daños, un cuidado especial debe ser tomado al análisis e interpretación de resultados.

Discussion

El presente protocolo describe un método para llevar a cabo un análisis cuantitativo de todo el montaje de inmunofluorescencia en la preimplantación de embriones de ratón etapa. Un protocolo de inmunofluorescencia robusta ²² va seguida de alta resolución, todo el montaje de imagen confocal y por la segmentación de imágenes utilizando una pieza de software a la medida de ^4. Aunque la elección del protocolo de inmunofluorescencia no es crítica, nos encontramos con el que se presenta aquí ²²

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colección de embriones
tapón	Pinzas Roboz	RS-9580
Tijeras de cirugía	Roboz	RS-4978
Pipetas Pasteur de vidrio	Fisher	13-678-20C
boquilla	Sigma	A5177
Tubo de goma más largo	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Solución ácida de Tyrode	Millipore	MR-004-D
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140
Albúmina sérica bovina	Sigma	A9647
Placas de 4 pocillos	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
Inmunofluorescencia
96 pocillos Placas de fondo en U	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Sigma	G7403
Suero de caballo	Sigma	H0146
Anticuerpos primarios			Concentración
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1:100, fijación 10 min
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1:100, fijación O/N
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4 Santa	Cruz	sc-5279	1:100, 10 min a la fijación O/N
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Anticuerpos secundarios	Life Technologies		Varios 1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Imaging
35 mm placas con fondo de vidrio	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
Computer running 64-bit Windows OS		n/a	Verifique los requisitos mínimos del sistema en http://katlab-tools.org y en Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (software)	Mathworks	n/a
MINS (software)	Gratis	n/a	http://katlab-tools.org