Un método rápido y eficiente para la purificación de células del endodermo generada a partir de células madre embrionarias humanas

Summary

A continuación, se describe un método para la purificación de células madre embrionarias humanas diferenciadas que están comprometidas hacia el endodermo definitivo para la mejora de las aplicaciones posteriores y otras diferenciaciones.

Abstract

Las capacidades de diferenciación de las células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias (CES) permiten que una aplicación terapéutica potencial para las terapias de reemplazo celular. Terminal tipos de células diferenciadas se podrían utilizar para el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas. Diferenciación in vitro de estas células hacia los tejidos del pulmón, hígado y páncreas requiere como primera etapa de la generación de células endodérmicas definitivas. Este paso es limitante de la velocidad para su posterior diferenciación hacia tipos de células maduras terminal tales como las células beta productoras de insulina, hepatocitos u otros tipos celulares derivados del endodermo. Las células que se han comprometido hacia el linaje endodermo altamente expresan una multitud de factores de transcripción como FOXA2, SOX17, HNF1B, los miembros de la familia GATA, y el receptor CXCR4 superficie. Sin embargo, rara vez son protocolos de diferenciación 100% de eficiencia. A continuación, describimos un método para la purificación de una población de células CXCR4 + después de la diferenciaciónen la DE mediante el uso de microperlas magnéticas. Esta purificación elimina, además, las células de los linajes no deseados. El método de purificación suave es rápido y fiable, y puede ser utilizado para mejorar las aplicaciones posteriores y diferenciaciones.

Introduction

Las células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias (CES) tienen la capacidad de diferenciarse en casi cualquier tipo de célula del cuerpo humano. Por lo tanto, los protocolos de diferenciación in vitro se pueden utilizar para generar numerosos tipos de células de adultos, tales como cardiomiocitos, hepatocitos ^{1 2, las} células beta ^3, epitelial de pulmón ⁴ o células neuronales ^5. Esto hace que los CES una herramienta valiosa para el tratamiento potencial de diversas enfermedades degenerativas ^3.

La diferenciación in vitro de los CES haci....

Protocol

1. La diferenciación de ESC humana hacia el endodermo definitivo

1. Cultivar células madre embrionarias humanas (CES) en una incubadora a 37 ° C y 5% de _CO2.
2. Escudo una nueva placa de cultivo celular de 6 pocillos con 1 ml de una matriz de membrana basal e incubar la cultura-ware durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Para obtener detalles específicos, por favor dirigirse a las instrucciones del fabricante respectivo.
3. Confirman que las CME humanas cultivadas han alcanzado el 80% -90% de confluencia en el microscopio utilizando una magnificación baja (por ejemplo, 4X). Aspirar el medio de las cavidades chupa....

Results

la diferenciación CES se someten a cambios drásticos en la expresión de genes y proteínas. La Figura 1 representa los genes marcadores típicos que se pueden utilizar para verificar el éxito de la diferenciación del endodermo. Los principales objetivos de un análisis de la expresión génica son GSC, FOXA2, y SOX17. En un análisis de la expresión génica relativa en especial FOXA2 y SOX17 se incrementan en> 2.......

Discussion

protocolos de diferenciación Actualmente se utilizan rara vez resultan en células diferenciadas 100%. Por razones que aún no se han abordado algunas células resisten el proceso de diferenciación. Dependiendo de la eficiencia del protocolo de diferenciación usado y de la propensión de la ESC línea A cierto número de células pluripotentes residuales se observa con frecuencia, incluso después de la diferenciación en el endodermo definitivo. Estas células residuales pueden poner en peligro diferenciaciones aguas abajo o un .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Línea de células madre embrionarias humanas Hues8	Departamento de células madre y biología regenerativa de Harvard Línea	celular adecuada para la generación de endodermos
		S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, humano	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Separador OctoMACS	Miltenyi Biotec	130-042-109	campo magnético
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	inhibidor
de rocas CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activina A	Peprotech	120-14
Reactivo de disociación celular suave	Stemcell Technologies	7174	Sin enzimas solución de paso, alternativa: Tripsina/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	matriz de membrana basal * resuelva y almacene en alícuotas a -80 ° C como se describe en el manual del proveedor. Tras su uso, descongelar en hielo, diluir en 25 ml de knockout helado DMEM/F-12. Añadir 1 ml a cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incubar durante 45 min a temperatura ambiente. Retirar la matrigel y utilizar inmediatamente.
Columnas MS	Miltenyi Biotec	30-042-201
Separador MACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Humano FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Humano FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtgtggtt	Vida Tecnologías
Humano GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan ensayo	Biosystems Aplicado	Hs00751752_s1
humano SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Humano SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgggtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R& D Sistemas	AF1924