Proporcionamos un protocolo detallado para estudiar la dinámica de los ácidos biliares en células vivas utilizando un sensor BAS FRET codificado genéticamente. Este sensor de ácidos biliares representa una herramienta única para estudiar (regular el) transporte de ácidos biliares y la activación de FXR en una amplia gama de tipos de células.
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Artículo de método
Monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar Dinámica El uso de un sensor de ácido biliar basada FRET-codificados genéticamente
En este artículo
Resumen
Resumen
La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) se ha convertido en una poderosa herramienta para monitorear el plegamiento, la interacción y la localización de proteínas en células individuales. Los biosensores basados en el principio de FRET han permitido la visualización en tiempo real de eventos de señalización subcelular en células vivas con alta resolución temporal y espacial. Aquí, describimos la aplicación de un sensor de ácidos biliares (BAS) codificado genéticamente que consta de dos fluoróforos fusionados con el dominio de unión del ligando del receptor X FARNESOIDE (FFR-LBD), formando así un sensor de ácidos biliares que puede ser activado por un gran número de especies de ácidos biliares y otros ligandos FXR (sintéticos). Este sensor se puede dirigir a diferentes compartimentos celulares, incluido el núcleo (NucleoBAS) y el citosol (CytoBAS) para medir las concentraciones de ácidos biliares localmente. Permite cuantificar de forma rápida y sencilla la entrada de ácidos biliares celulares, el flujo y la distribución subcelular de ácidos biliares endógenos sin necesidad de marcaje con marcadores fluorescentes o radionúcleos. Además, los sensores BAS FRET pueden ser útiles para monitorizar la unión de ligandos FXR. Finalmente, demostramos que este biosensor FRET se puede combinar con imágenes de otros fluoróforos espectralmente distintos. Esto permite el análisis combinado de la dinámica de los ácidos biliares intracelulares y i) la localización y/o abundancia de proteínas de interés, o ii) la señalización intracelular en una sola célula.
Introducción
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) es ampliamente utilizado para obtener una mejor comprensión de las funciones celulares en las células vivas con una alta resolución temporal y espacial 1. En FRET, la energía de un fluoróforo donante excitado se transfiere a un fluoróforo aceptor. Eficiencia de FRET es fuertemente dependiente de la distancia entre el donante y el fluoróforo aceptor y su orientación y por lo tanto es una lectura sensible de los cambios conformacionales que afectan a los dos fluoróforos. Este fenómeno se explota para generar biosensores basados en FRET para la obtención de imágenes de moléculas pequeñas. Los cambios en su concentrac....
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Protocolo
1. Transfección transitoria
Nota: CytoBAS y NucleoBAS (Por favor, consulte la Tabla de Materiales) se utilizan con éxito en varios tipos de células, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK y células HEK293T). El requisito principal para usar el sensor es que necesita ser expresada, lo que requiere el ADN que codifica para entrar en la célula.
- Las células de la cosecha de un 80% de confluencia 25 cm 2 frasco. Diluir las células en medio de cultivo completo adecuados para la línea específica de células (10% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% pen / strep para las células U2OS y Huh7).
- Células de placas a la densidad deseada ....
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Resultados
El sensor FRET-BAS presentado se basa en el dominio de FXR (LBD-FXR) de unión al ligando unido a dos fluoróforos citrino y cerúleo) y un motivo LXXLL. Este sensor permite investigaciones de transporte de ácidos biliares en las células con alta resolución espacial y temporal (Figura 1 A) viviente. Las mutaciones en cerúleo y citrino se aplicaron a promover la formación del complejo intramolecular (Figura 1
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Discusión
Aquí se presenta un protocolo detallado para el uso de un nuevo codificado genéticamente sensor de ácido biliar capaz de monitorizar la dinámica espacio-temporales de transporte de ácidos biliares en las células vivas. Este biosensor consta de proteínas fluorescentes azul cerúleo y citrino que se fusionan a FXR LBD-, formando de este modo un sensor de ácido biliar basado en FRET (BAS).
El sensor de Bile Acid es relativamente simple y conveniente en uso al tener experiencia básica con cultivo.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por las subvenciones iniciales del ERC (ERC-2011-StG 280255 y ERC-2013-StG 337479) y por la Organización Holandesa para la Investigación y el Desarrollo en Salud (Vidi 91713319).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | Glucosa alta sin L-glutamina |
| Penicilina-Estreptomicina (pluma/estreptococo) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamina (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Tripsina-EDTA (10x) | Matraz | CC-5012 | |
| T-25 | VWR international | 392-0253 | Matraz |
| cultivo celular T-175 | VWR international | 392-0238 | |
| Placa de 6 pocillos | VWR international | 734-0229 | recubierto de poli-L-lisina y laminina |
| VWR international | 392-0243 | Recubierto de laminina | |
| Dietilaminoetilo (DEAE) - Dextrano | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polietilenimina (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (genética) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Higromicina B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cilindro de clonación (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz medio de cultivo | Invitrogen | 21083-027 | Rojo sin fenol |
| Tubo de poliestireno de fondo redondo (5 ml) Tubo Facs | Falcon BD | 352008 | Sin tapón, no estéril |
| Falcon 2.063 tubos (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Tapón a presión, estéril |
| Nunc Lab-Tek Cubreobjetos de 8 pocillos Thermo | scientific | 155409 | Estéril |
| Filtrado con carbón vegetal FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Otros productos químicos | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
Referencias
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
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Reimpresiones y permisos
