El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Resumen

Se presenta aquí un método sencillo para el aislamiento y análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes que produce datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de las células inmunes que entran en el microambiente tumoral temprano del cerebro.

Resumen

Nuestro laboratorio ha demostrado recientemente que las células asesinas naturales (NK) son capaces de erradicar ortotópicamente implantado GL26 de ratón y de rata CNS-1 gliomas malignos pronto después del injerto intracraneal si las células cancerosas se vuelven deficientes en su expresión de la galectina lectina β-galactósido vinculante -1 (gal-1). Un trabajo más reciente ahora demuestra que una población de células mieloides Gr-1 ⁺ / CD11b ⁺ es fundamental en este sentido. Para comprender mejor los mecanismos por los cuales NK y células mieloides cooperan para conferir el rechazo del tumor gal-1-deficiente hemos desarrollado un protocolo completo para el aislamiento y análisis de las células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes (PBMC). El método se demuestra aquí comparando PBMC infiltración en el microambiente tumoral de gal-1 que expresan GL26 gliomas con los prestados gal-1-deficientes través shRNA desmontables. El protocolo comienza con una descripción de cómo la cultura y preparar GL26 ceLLS para la inoculación en el singénico C57BL / 6J cerebro de ratón. A continuación, se explican los pasos que intervienen en el aislamiento y el flujo de análisis de citometría de glioma de PBMCs infiltrarse desde el microambiente tumoral temprano del cerebro. El método es adaptable a una serie de diseños experimentales in vivo en el que se requieren los datos temporales sobre la infiltración inmune en el cerebro. El método es sensible y altamente reproducible, como PBMCs de glioma infiltrantes pueden ser aislados de tumores intracraneales tan pronto como 24 hr injerto post-tumor con recuentos de células similares observados desde el punto emparejado tumores tiempo a lo largo experimentos independientes. Un único experimentador puede realizar el método de la cosecha cerebro para análisis citométrico de flujo de PBMCs de glioma infiltrantes en aproximadamente 4-6 horas, dependiendo del número de muestras a analizar. Modelos alternativos de glioma y / o anticuerpos de detección de células específicas también pueden utilizarse a discreción de los experimentadores 'para evaluar la infiltración de varios otros immuntipos e celulares de interés sin la necesidad de modificaciones en el procedimiento general.

Introducción

Los gliomas son una clase de cánceres de cerebro neuroepiteliales derivadas de la glía transformado dentro del sistema nervioso central (SNC). De todos los gliomas, Organización Mundial de la Salud (OMS) glioma de grado IV, o glioblastoma (GBM), es el más común y letal ^1. GBM es altamente refractaria a la atención estándar de corriente que consta de la resección del tumor a la medida de lo posible seguida de radiación y quimioterapia concomitante y adyuvante con temozolomida ^2. Estos cánceres mortales tienen un pronóstico sombrío de sólo 15 a 18 meses de supervivencia desde el momento del diagnóstico inicial con sólo el 5% de los pacientes que s....

Protocolo

Nota: Por favor, revise todo el protocolo antes de realizar experimentos. La aprobación para el uso de los animales vertebrados del comité institucional adecuado en el uso y el bienestar de los animales debe ser obtenido antes de continuar.

1. Preparación de las células tumorales para intracraneal injerto

1. Trabajando en una cabina de seguridad biológica clase II, empezar por la preparación GL26-Cit-NT / gal1i medios de cultivo celular, completándolo una botella de 500 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal inactivado por calor filtrada de forma estéril 10% (FBS ), 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de p....

Resultados

La estrategia gating siguiente se utiliza para un experimento típico: FSC-A vs SSC-A → SSC-H vs SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. recuento → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. recuento. Puertas coloca en Gr-1 células mieloides ⁺ / CD11b ⁺ y las células NK1.1 ⁺ NK son estratificados basados ​​en la expresión GzmB (Figura 5A). Backgating las células identificadas como células NK1.1 ⁺ NK y Gr-1 ⁺ / CD11b ^{+ células} mieloides en nuestros experimentos .......

Discusión

Este protocolo describe un método robusto y reproducible para el análisis de citometría de flujo y el aislamiento de PBMCs que se han infiltrado en el microambiente tumoral temprano del ratón cerebro. Suspensiones celulares de glioma se generan a una concentración especificada por el experimentador que se estereotácticamente injertado en el cuerpo estriado del cerebro de ratón. Los ratones son entonces sacrificados en puntos de tiempo predeterminados especificados por el diseño experimental y sus cerebros se cosechan y .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco' s Modificación de Eagles Medium	Gibco	12430-054	con 4,5 g/L de D-glucosa, L-glutamina, 25 mM de HEPES y rojo de fenol;
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato	Gibco	14190-144	sin cloruro de calcio ni cloruro de magnesio
Suero fetal bovino	Omega Scientific Inc.	FB-11
Penicilina Estreptomicina	Gibco	15140-122	10.000 U/ml Penicilina; 10.000 μ g/ml de estreptomicina
L-glutamina	Gibco	25030-081	200 mM
G418 sulfato	Omega Científico Inc.	GN-04
Dihidrocloruro de puromicina	Sigma-Aldrich	P8833	de Streptomyces alboniger
HyClone HyQTasa alternativa a la tripsina no mamífera	Thermo Scientific	SV30030.01	en DPBS con EDTA
Hemocitómetro de contraste	de fase Sigma-Aldrich	Z359629	0,1 mm de profundidad
Tinción azul de tripán	Gibco	15250-061
Inyección estéril de NaCl al 0,9%, USP	Hospira	NDC: 0409-4888	viales de 10 ml
Microtubos cónicos de polipropileno de 0,6 ml	Genesee Scientific	22-272
Inyección de clorhidrato de atipamezol	Orion Pharma	NDC: 52483-6298	Solución de 5 mg/ml
Inyección de clorhidrato de ketamina	Fort Dodge	NDC: 0409-2051 Solución de	100 mg/ml
Inyección de clorhidrato de dexmedetomidina	Zoetis	NDC: 54771-2805	Solución de 0,5 mg/ml
Inyección de clorhidrato de xilacina	Lloyd	NDC: 61311-481	Solución de 100 mg/ml Inyección
carprofeno	Pfizer	NDC: 61106-8501	50 mg/ml solución
Clorhidrato de buprenorfina inyectable	Reckitt Benckiser	NDC: 12496-0757	ampollas de 0,3 mg/ml
jeringas de tuberculina de 1 ml	Covidien	8881501400
26G x ½ (0,45 mm x 13 mm) agujas de jeringa	BD	305111
Cortaúñas quirúrgicas	3M	9661
Providona solución de yodo	Aplicare	82-217	NDC: 52380-1905
Pomada oftálmica estéril de vaselina	Dechra	NDC: 17033-211
Almohadillas de preparación con alcohol isopropílico al 70%	Kendall	6818
Gasa estéril	Covidien	8044	no tejida, 4" x 4", 4 capas
Microtubos cónicos de polipropileno de 1,7 ml	Genesee Scientific	22-281
Marco estereotáctico de ratón	Stoelting	51730
Lámpara quirúrgica	Philips Burton	CS316W	Coolspot II Foco variable
Pinza de disección curva	Ted Pella Inc.	5431
Retractores Colibrí	FST	17000-03
Taladro eléctrico de precisión inalámbrico	Dremel	1100-01	Modelo de palpador; Iones de litio de 7,2 voltios con estación de acoplamiento
Cortador de grabado	Dremel	Jeringa de microlitros de 105	1/32" o 0,8 mm de diámetro de broca
	Hamilton	75	Jeringas de microlitros Hamilton serie 700; 5 μ l volumen
Agujas de jeringa de microlitro	Hamilton	7762-06	33 G, cubo pequeño RN NDL, 1,5 pulgadas, estilo de punta 3, 6/PK
Ethilon 3-0 suturas de nailon monofilamento negro	Ethicon	1663
Barra agitadora magnética	VWR	74950-296	7,9 mm de diámetro x 50 mm de largo (5/16" de diámetro x 2" de longitud)
1 L de vidrio con tapón de rosca	Corning	1395	Tipo 1, Clase A vidrio de borosilicato
Heparina sódica	Sagent	NDC: 25021-400	Solución de 1.000 U/ml
Bomba peristáltica	Cole Parmer Instruments Group	77200-60	Master Flex Easy Load II con mando de consola
Carbogen comprimido (95% O2 / 5% CO2)	disponible en el proveedor local	N/A	Tipo A, cilindro grande
20 G x 1 y frac12; " cubo de aluminio agujas romas	Kendall 8881202363		0.9 mm x 38.1 mm
Cubo de hielo de poliuretano	Fisherbrand	02-591-45	Capacidad: 0.152 oz. (4.5L)
Colagenasa (Tipo I-S)	Sigma Aldrich	C1639	de Clostridium histolyticum
Desoxirribonucleasa I	Worthington Biochemical Corp.		LS002007>2.000 unidades Kunitz por mg de peso seco
Platos de pesaje hexagonales de poliestireno antiestático	Ted Pella Inc.	20157-3	diámetro interno superior 115 mm, diámetro interno base 85 mm, volumen de 203 ml;
Hojas de afeitar de acero inoxidable de un solo filo	Garvey	40475
Rongeurs de hueso	FST	16001-15
Hemostático	FST	13014-14
Tijeras de disección grandes	Ted Pella Inc.	1316
Tijeras de disección pequeñas	FST	14094-11
Pinzas de punta roma	Ted Pella Inc.	13250
Molinillo de tisú Dounce de vidrio de 7 ml	Kontes	KT885300-0007
Percoll Medios de centrifugación de densidad	GE Healthcare	GE17-0891-01
pipetas serológicas de 10 ml	Genesee Scientific	12-104	de un solo uso; estériles
70 μ m coladores de celdas de malla de nailon estériles	Fisherbrand	22363548
Alexa Fluor 700-conjugado rat anti-ratón CD45 (clon: 30-F11)	Biolegend	103128
ratón conjugado APC anti-ratón NK1.1 (clon: PK136)	eBiosciences	17-5941-82
Rata anti-ratón conjugada con PE Gr-1 (clon: RB6-8C5)	BD Pharmigen	553128
PerCP/Cy5.5-conjugada rata anti-ratón CD11b (clon: M1/70)	Biolegend	101228
Alexa Fluor 700 rata conjugada IgG2b, κ (clon: RTK4530) control de isotipos	Biolegend	400628
ratón conjugado con APC IgG2a, κ (clon: eBM2a) control de isotipos	eBioscience	17-4724
IgG2b de rata conjugada con PE, κ (clon: eB149/10H5) control de isotipos	eBioscience	12-4031-82
IgG2b de rata conjugada con PerCP/Cy5.5, κ (clon: RTK4530) control de isotipo	Biolegend	400632
granzima B anti-ratón conjugado con azul del Pacífico (clon: GB11)	Biolegend	515403
Ratón conjugado azul del Pacífico IgG1, κ (Clon: MOPC-21) control de isotipos	Biolegend	400151
Cytofix/Cytoperm	BD 554714
tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml	Genesee Scientific	21-103	fondo cónico
Tubos centrífugos de polipropileno de 50 ml	Genesee Scientific	21-108	fondo cónico
12 mm x 75 mm tubos FACS de polipropileno de fondo redondo	Fisherbrand	14-956-1B
FACSAria Pedido especial Investigación Citómetro de flujo/clasificador de celdas	BD
Cabina de seguridad biológica de clase II Modelo	SG603	The Baker Company	: SterilGARD III Advance

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