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Artículo de método

Ensayo muy sensible para la medición del Adjunto de células arenavirus

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DOI:

10.3791/53682

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2 de marzo de 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

En este artículo

Resumen

El primer paso en el ciclo de vida del arenavirus es la unión de las partículas virales a las células huésped. Presentamos un ensayo cuantitativo basado en (q)RT-PCR para la detección y cuantificación ultrasensibles de eventos de adhesión de arenavirus.

Resumen

Los arenavirus son una familia de virus de ARN con envoltura que causan enfermedades humanas graves. El primer paso en el ciclo de vida del arenavirus es la unión de las partículas virales a las células huésped. Si bien la adhesión entre el virus y las células se puede medir mediante el uso de viriones marcados con biotina, isótopos radiactivos o tintes fluorescentes, estos enfoques generalmente requieren altas multiplicidades de infección (MOI) para permitir la detección del virus unido. Describimos un ensayo cuantitativo basado en (q)RT-PCR que mide la adhesión de la cepa Candid 1 del virus Junín a través de la cuantificación del ARN genómico viral empaquetado en viriones. Este ensayo tiene varias ventajas, incluida su extrema sensibilidad y capacidad para medir la unión en un amplio rango dinámico de MOI sin la necesidad de purificar o etiquetar el virus de entrada. Es importante destacar que este enfoque se puede adaptar fácilmente para su uso con otros virus mediante el uso de reactivos qRT-PCR específicos del virus. Además, este ensayo puede modificarse para permitir la medición de la endocitosis de partículas y el desenmascaramiento del genoma. En conclusión, describimos un ensayo simple pero robusto para la medición altamente sensible de la unión arenavirus-célula.

Introducción

Arenavirus son una familia de virus de ARN con envoltura de cadena simple, que se mantienen principalmente en los roedores en la naturaleza 1-3. Mientras que estos virus establecen típicamente una infección asintomática, persistente en los reservorios de roedores 1,2, que pueden causar una enfermedad grave en seres humanos 3. Especies patógenas importantes incluyen el virus Junín Nuevo Mundo (JUNV) 4 y el virus de Lassa 5 Viejo Mundo, que son los agentes etiológicos de la fiebre hemorrágica argentina en América del Sur y la fiebre de Lassa en África, respectivamente. Virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus prototípico de la familia de 6, tiene una distribución mundial y es responsable de una variedad de estados de enfermedad que incluyen meningitis aséptica en individuos inmunocompetentes 6, graves defectos congénitos en el feto en desarrollo 7, o de alta letalidad en inmunodeprimidos las personas siguientes de órganos sólidos 8,9 trasplante. La falta de Estados UnidosAdministración de Alimentos y Medicamentos (FDA): aprobado vacunas o antivirales eficaces para combatir estos virus pone de relieve la necesidad crítica de desarrollar nuevas estrategias para orientar terapéuticamente estos patógenos emergentes / reemergentes.

El genoma arenavirus se compone de dos segmentos de ARN de una sola hebra, el grande (L) (~ 7,2 kb) y pequeña (S) (~ 3,6 kb) 10 segmentos. El segmento S codifica la nucleoproteína viral (NP) y glicoproteína de la envuelta (GP) mientras que el segmento L codifica la polimerasa viral (L) y la proteína de matriz (Z). La L y S segmentos de ARN genómicos (ARNv) se empaquetan en viriones 10-12. El paso inicial de la infección por arenavirus es la unión de partículas virales a las células huésped a través de una interacción entre el GP viral y sus correspondientes receptores de células huésped que, por JUNV, incluye el receptor humano de la transferrina 1 (hTfR1) 13,14. Después de la unión, las partículas JUNV se toman en la célula a través de endocitosis mediada por clatrina 15.A continuación, las partículas de tráfico para el endosoma tardío en el que el bajo pH de este compartimiento desencadena la activación de GP 16,17. Una vez activado, los insertos de péptido de fusión GP-codificado en la membrana endosomal, iniciando la fusión entre las membranas virales y endosomales. resultados de fusión de éxito en la liberación de los viriones ARNv-envasados ​​en el citoplasma, donde sirven como plantillas para la replicación del genoma y la transcripción. Cuando se generan cantidades suficientes de proteínas estructurales virales y ARNv, nuevas partículas se reúnen y brote de la célula infectada para completar el ciclo de vida 18.

Para facilitar el descubrimiento de nuevas estrategias para apuntar terapéuticamente los arenavirus patógenos, nuestro grupo ha centrado en la identificación de factores del huésped que son críticos para la propagación de virus, pero prescindible para el huésped. En este contexto, la definición de la etapa precisa (s) del ciclo de vida viral controlada por tales factores del huésped es necesario para guiar eldesarrollo de estrategias antivirales. En este documento, se describe un ensayo cuantitativo (q) basado en RT-PCR que se puede utilizar para medir la fijación de células arenavirus con el fin de identificar si las proteínas huésped seleccionadas y / o moléculas antivirales influyen en esta etapa inicial de la entrada viral 19. Los enfoques alternativos para medir la unión de células arenavirus han ofrecido viriones marcados con biotina 20, 21 tintes fluorescentes o isótopos radiactivos 22. Los inconvenientes de estos métodos pueden incluir el requisito de grandes cantidades de virus de entrada (por ejemplo, altas multiplicidades de infección (MOI)), el uso de la radiactividad, y / o etapas de manipulación adicionales para preparar virus de entrada (por ejemplo, concentración y / o el etiquetado de virus) . En particular, el uso de alta MOI hace que sea difícil distinguir productiva frente a eventos de unión no productivas 15,23. El ensayo basado en qRT-PCR descrito aquí puede detectar eventos de unión usando tan pocos como 20 para la placaunidades Ming (UFP) del virus, lo que se traduce en una MOI de 0,0004 para una placa de 48 pocillos. Por lo tanto, la fuerte sensibilidad del ensayo supera el requisito de alta MOI, así como las medidas de etiquetado virus o de concentración. Además, el ensayo puede ser i) adaptado para medir la endocitosis del virión, así como la liberación del genoma del virus en el citoplasma después de la fusión y ii) diseñados para usar con otros virus a través del desarrollo de reactivos QRT-PCR específica para el virus (por ejemplo, véase 24-27).

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Protocolo

Nota: Es muy importante que el protocolo descrito llevarse a cabo utilizando una estricta técnica de pre-PCR (ver 28 para una excelente visión general sobre cómo montar un laboratorio de pre-PCR y cómo llevar a cabo experimentos utilizando una buena técnica de pre-PCR). Es imperativo que todos los reactivos y equipos están libres de ADN amplificado que contiene la secuencia diana qPCR y que los controles adecuados para detectar este tipo de contaminación. Una visión general del protocolo se muestra en la Figura 1.

1. Preparar los medios de comunicación y las células de semillas en placas de 48 pocillos

  1. Preparar 500 ml de completa de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10%, 1% de penicilina-estreptomicina y 1% de HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico) solución tampón mediante la adición de 50 ml de suero fetal bovino inactivado por calor y 5 ml cada una de una solución tampón de 100x penicilina-estreptomicina y HEPES 100x a una botella de 500 ml de DMEM. Este reactivo puede almacenarse a 476; C durante meses.
  2. De semillas de 2,5 x 10 4 células Vero E6 por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos en un volumen final de 500 l de DMEM completo. Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO2 durante 10 a 18 horas.
    1. Sembrar la placa al final de la jornada laboral. Pruebe cada muestra de virus, ya sea en pozos por duplicado o triplicado.
      Nota: Si bien se describe una plataforma de bien a base de 48 para este ensayo, debería ser posible escalar el ensayo abajo para su uso en 96- o placas de 384 pocillos.

2. Llevar a cabo el Adjunto virus-célula

Nota: El virus utilizado en este protocolo, la cepa JUNV Candid # 1 (C # 1), se ha utilizado con éxito como una vacuna viva atenuada para la prevención de la enfermedad JUNV 29. JUNV C # 1 se deriva de la cepa XJ JUNV virulento a través de pases en serie tanto in vivo como in vitro y se diferencia de la cepa parental XJ por 12 aminoácidos 30. because JUNV C # 1 es un nivel de bioseguridad (BSL) -2-patógeno clasificado, el trabajo descrito para esta sección debe llevarse a cabo utilizando apropiadas BSL-2 31 prácticas. Esto incluye el uso de equipo de protección personal (por ejemplo, protección ocular, bata de laboratorio, guantes dobles), un gabinete de bioseguridad clase II, y asegurar que todo el personal haya recibido la formación institucional y autorizaciones necesarias para manejar con seguridad este organismo.

  1. Diluir la JUNV C # 1 muestra (s) a ensayar a la PFUs deseado o centrarse unidades formadoras en helado de DMEM completo y almacenar en hielo hasta el momento de añadir a cada pocillo.
    Nota: Como alternativa a la realización de los estudios de unión con el virus diluido en DMEM completo, utilice un medio mínimo que contenía PBS con una concentración reducida de suero (2%) y un tampón apropiado para establecer si el suero puede causar interferencia con la unión del virus. protocolos de fijación similares para los virus alternativos han reportado el uso de RPMI 1640 sin bicarbonate que contiene 0,2% de albúmina de suero bovino, 10 mM (2- (morfolino) etanosulfónico), y 10 mM HEPES, pH 6,8 32. Este medio de unión pueden ser superiores para evitar cambios de pH que podrían ocurrir cuando los medios se elimina de la CO 2 -Medioambiente de la incubadora.
    1. Inocular pozos con PFUs que van desde 200 a 2000 para limitar los eventos de unión no productivas. Como se muestra en la Figura 2, este ensayo es capaz de detectar de fijación usando tan pocos como 20 PFU (o tanto como 2 x 10 6 PFU).
    2. Crear una mezcla maestra del virus a las células para la inoculación. Cada muestra de virus se inoculó en pocillos por duplicado en un volumen de 50 l por pocillo. Por lo tanto, si se desea la adición de 2.000 UFP de virus por pocillo, diluir 4.800 PFU en un volumen total de 120 l de hielo frío completar DMEM.
      1. Para el control de la especificidad del ensayo, utilizar un par emparejado de líneas de células de ovario de hámster chino que, o bien no expresan TfR1 (TRVB) o expO prima hTfR1 (TRVB-1) como JUNV apego a estas células debe ser reducida o no, respectivamente 13,33. Como alternativa, el tratamiento de las células con una proteasa tal como proteinasa K para impedir la adhesión de arenavirus 34 o 35 de entrada. Soluble hTfR1 o el anticuerpo monocolonal ch128.1, que es específico para hTfR1, también podrían considerarse como son conocidos para bloquear la entrada de JUNV en células 13,36. Además, el tratamiento previo de las células con manosa libre de 14 o incubación de partículas con anticuerpos neutralizantes específicos JUNV-37 puede inhibir la entrada del virus.
      2. Tenga en cuenta, sin embargo, que estos últimos reactivos y enfoques, a pesar de bloquear la entrada JUNV, no han sido confirmados a bloquear la unión, aunque esta es una explicación probable. El protocolo descrito aquí podría ser utilizado para determinar formalmente si estos diversos enfoques de fijación virión impacto.
  2. Eliminar las placas de la incubadora a 37 ° ycolocar ya sea en un refrigerador 4 ° C o en hielo durante 15 min para inhibir la capacidad de las células cultivadas en placas para llevar a cabo la endocitosis.
  3. A continuación, aspirar el DMEM completo de cada pocillo y lavarse rápidamente cada pocillo dos veces con 100 l de PBS enfriado con hielo (salina tamponada con fosfato), pH 7,4. A continuación, añadir 50 l de las muestras de virus pre-diluido (preparado en el paso 2.1) a los pocillos apropiados.
  4. Envolver la placa en papel plástico y coloque de inmediato ya sea de nuevo en hielo o en un refrigerador de 4 ° C durante 1 a 1,5 horas para permitir la fijación del virus que se produzca. Mantener la reacción, el tampón de lavado, y las muestras de virus frío a 4 ° C durante todo este paso.
  5. Después de la finalización de la incubación C 4 °, aspirar el inóculo de virus y lavar cada pocillo 3 veces con 200 l de PBS enfriado en hielo.

3. Viral RNA Extracción

  1. Se purifica el ARN viral de JUNV C # 1 partículas unidas a las monocapas utilizando el kit comercial (por ejemplo, RNeasy Mini kit) according con el protocolo del fabricante. En concreto, siga la "purificación de ARN total a partir de células animales utilizando la tecnología de protocolo de giro" en las páginas 23-28 en el Mini Manual RNeasy (4ª edición, abril de 2006) con las modificaciones que figuran a continuación.
    1. Lisar las células como se indica en el paso 1b mediante la adición de 350 l de tampón de lisis RLT directamente a cada pocillo. Mezclar el tampón varias veces para asegurar la lisis celular. Tenga en cuenta que las células lisan fácilmente en este tampón y la lisis completa se pueden verificar mediante la visualización de pozos bajo un microscopio invertido.
    2. Transferir el lisado celular resultante a la columna de kit (etapa 3a) y seguir el resto del protocolo como se describe. En este punto, el virus ha sido neutralizado por el tampón de lisis por lo que los pasos restantes del protocolo se puede hacer fuera de la cabina de bioseguridad de clase II, siempre los tubos del kit no estaban contaminados con virus infeccioso.
    3. Incluir el paso opcional 9 desde el protocolo del fabricante, que es un Additional de la centrifugación de la columna de centrifugación para eliminar cualquier posible prórroga de tampón RPE.
    4. En el paso final el protocolo del fabricante (etapa 10), eluir el ARN purificado a partir de la columna de centrifugación con 30 l de ddH libre de nucleasa 2 O. ARN almacenar a -80 ° C en este punto o utilizar directamente en el ensayo QRT-PCR. Para evitar la degradación de las muestras de ARN virales purificados por nucleasas, utilizar reactivos y equipo libre de nucleasa y mantener las muestras de ARN descongeladas en hielo.
      Nota: Los tampones RLT y RW1 contienen sal de guanidina y no se deben mezclar con lejía. Buffer RW1 contiene etanol.

4. QRT-PCR Medición del genoma viral

  1. Para convertir JUNV C # 1 RNA segmento S en ADNc para su posterior qPCR, someter el RNA viral (generada en la etapa 3.1.4) para RT en un volumen total de 50 l.
    1. Para configurar la reacción RT, crear primero una mezcla maestra que contiene cada uno de los siguientes reactivos por reacción: 6,75 l de nucleasaexento de ddH 2 O, 5 l de un stock de la RT del cebador S 2 M 2098- a 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), que es complementaria a la región NP del segmento S RNA genómico, 5 l de tampón 10X PCR II, 11 l de una solución de MgCl 25 mM 2, 1,25 l (62,5 unidades) de la enzima RT, 1 l (0,4 unidades) de inhibidor de RNasa, y 10 l de un stock de dNTPs 500 mM.
      Nota: Durante el curso de la replicación arenavirus, se generan 4 especies de ARN segmento S virales: a ARN de longitud completa genómico (vRNA), una longitud completa de ARN antigenómico (vcRNA) (que es el complemento inverso de la vRNA), y dos mRNAs subgenómicos que codifica los genes NP y GP, respectivamente. El cebador de RT que aparece aquí es específica sólo para el segmento S vRNA, pero no el vcRNA, mRNA NP, o ARNm GP.
    2. Mezclar suavemente la mezcla maestra RT y luego alícuota de 40 l en tubos de 0,2 ml PCR individuales. Añadir 10 l de RNA viral a cada tubo. Incluir i) un tubo de control sin molde (por ejemplo,. Añadir 10 l de H2O a 40 l-nucleasa libre de ddH de la mezcla maestra) y ii) un control de la enzima no RT (por ejemplo, añadir 10 l de una muestra de ARN viral conocida positiva a 40 l de mezcla maestra que no recibieron cualquier enzima RT) a la pantalla de la contaminación de los reactivos RT con ADN amplificado que contiene la secuencia diana viral. Incluir ARN extraído de las células no infectadas con la mezcla completa maestro RT para el control de la especificidad del ensayo en presencia de ARN celular.
    3. Además, incluir una muestra de ARN viral conocida positiva a la mezcla principal completo para verificar la calidad de los reactivos de RT. Tenga en cuenta que el volumen de la reacción de RT se puede reducir a 25 l si es necesario.
  2. Someter los tubos de RT a las siguientes condiciones de ciclo: 25 ° C durante 10 min, 48 ° C durante 30 min, y 95 ° C durante 5 min. Tenga en cuenta que las muestras se pueden almacenar a -20 ° C en este punto o se dejan durante la noche en el termociclador mediante la adición de un paso 4 ° C.
  3. Pealice qPCR en un volumen total de 25 l.
    1. Hacer una mezcla maestra qPCR mediante la combinación de lo siguiente: 2,5 l (de un depósito 9 M) de cada cebador de PCR hacia adelante S1937 + a 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') e inverso PCR Primer S 2001- a 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 l (de un depósito de 2 M) de la sonda qPCR S 1960+ a 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), y 12,5 l de la maestra universal de 2X qPCR mezcla. Tenga en cuenta que el cebador directo se informó aquí, que es específico para JUNV C # 1, difiere en 1 nt de la secuencia del cebador informado originalmente 38, que se dirige a la cepa virulenta JUNV Romero.
    2. Mezclar suavemente la solución y luego añadir 20 l a cada qPCR también. Añadir 5 l de cada reacción de RT a los pocillos apropiados de qPCR. Llevar a cabo qPCR por triplicado para cada muestra ensayada. Tenga en cuenta que el volumen de reacción PCR puede reducirse a tan poco como 12,5 l si es necesario.
      Nota: El software asociado conla máquina qPCR generará números de copias absolutos de JUNV C # 1 segmento S ARN genómico mediante la comparación del valor de cada muestra desconocida a una serie de diluciones estándar de plásmido que codifica el JUNV C # 1 gen NP, que es la diana del cebador de qPCR y sonda. El ensayo qPCR sólo puede proporcionar la cuantificación de los valores que caen dentro del rango de la curva estándar. Por esta razón, incluir las siguientes cantidades de plásmido (en pocillos por triplicado): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5, y 5 x 10 7 copias por pocillo.
  4. Cargar la placa de qPCR en el termociclador y ejecute las siguientes condiciones de reacción: 95 ° C durante 10 min y 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min.
    1. Recopilar y analizar los datos para determinar la cantidad de ARN viral presente en cada muestra de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  5. Para establecer una curva estándar utilizando una muestra recién purificada de plásmido que contiene el alquitrán qPCRobtener la secuencia, determinar primero el número de copias del plásmido en esta solución.
    1. Calcular el peso molecular del plásmido. Si se conoce la secuencia de todo el plásmido, el cálculo de este utilizando la siguiente fórmula: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Recuerde incluir el número total de nucleótidos particular se encuentra en cada hebra del plásmido de doble cadena.
    2. Si el tamaño del plásmido se conoce, pero su secuencia exacta no es, calcular el MW bajo el supuesto de que cada par de bases dsDNA tiene un PM de 600.
      Nota: El pCAGGS-JUNV C # 1 NP plásmido usado aquí tiene un peso molecular de 4,2 x 10 6.
    3. Una vez se ha determinado el MW del plásmido, calcular cómo están presentes en la solución madre de plásmido muchas copias por l.
    4. En primer lugar el cálculo de la g total de plásmido en la solución, a continuación, convertir esta a moles de plásmido (por ejemplo, si 69 g de plásmido están contenidos en 300 l de agua, a continuación, 6,9 x 10 -5 g de plásmido * 1 mol / 4,2 x 10 6 g de plásmido = 1,6 x 10 -11 moles de plásmido), que se puede convertir en número de copias (por ejemplo, 1,6 x 10 -11 moles de plásmido * 6,022 x 10 23 moléculas / mol = 9,8 x 10 12 moléculas (o copias)).
    5. Divida las copias totales de plásmido en la solución de plásmido por el volumen de esta solución para obtener copias por l (por ejemplo, 9.8 x 10 12 300 copias / l = 3,28 x 10 10 copias).
    6. Diluir esta solución adecuadamente de modo que 5 volúmenes mu l pueden ser cargados en la placa de PCR para entregar el rango de número de copias necesarias para establecer la curva estándar.

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Resultados

Para demostrar la sensibilidad y el rango dinámico del ensayo qPCR, cantidades conocidas de un plásmido que codifica el gen NP del JUNV C # 1 (rango de 5-5 x 10 7 copias) fueron sometidos a qPCR como se describe en la Sección 4 del protocolo. El ensayo es sensible y puede detectar de manera fiable tan pocos como 5 copias del ácido nucleico diana (Figura 2). Además, el rango dinámico del ensayo es grande y, como se muestra en la Figura 2, puede...

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Discusión

El protocolo se describe es sencillo y robusto siempre que se respeten las siguientes consideraciones críticas. En primer lugar, se debe emplear una estricta técnica de pre-PCR (ver 28 para una excelente revisión). Es imperativo que todos los reactivos y equipos están libres de ADN amplificado que contiene la secuencia diana qPCR y que los controles adecuados para detectar este tipo de contaminación. En segundo lugar, por la parte de unión virus-célula del protocolo, el virus, las células y los medios de comu...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, y Benjamín Rey útil para los debates y los Institutos Nacionales de la Salud para el apoyo de estos estudios a través de subvenciones T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), y P20RR021905 (JB) .

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMLife Technologies11965-118
Penicilina-estreptomicinaLife Technologies15140-163100x
HEPES Solución tampónLife Technologies15630-130100x
PBS pH 7.4Life Technologies10010-0231x
células Vero E6Colección de cultivo tipo americanoCRL-1586
Placa Costar de 48 pocillosCorning3548
RNeasy mini kitQiagen74106no mezclar tampones RLT o  RW1 con lejía
QIAtriturador homogeneizadorQiagen79654
Taqman Universal PCR Master MixLife Technologies4326614
Transcriptasa inversa multiscribe (50U/µ l)4311235Life Technologies
(10 mM; 2,5 mM cada dNTP)Life TechnologiesN808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II y solución de 25 mM de MgCl2Life TechnologiesN808-0010
Inhibidor de ARNasa (5000U/100 y micro; l)Life TechnologiesN808-0119
RT primer 5'-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3'		Tecnologías de ADN integradas250 nmol ADN oligoestándar desalinización
Avance qPCR cebador  5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'Life Technologies4304971desalación estándar Imprimación
qPCR inversa 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'Life Technologies4304971 sondadesalinización estándar
TaqMan 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'Placa
de reacción de 96 pocillos Micro4316033Amp Fast Optical purificada por HPLC (0,1 ml)Life Technologies4346906
sistema de PCR en tiempo real StepOnePlusLife Technologies 4376598 uotro instrumento de qPCR
Mezcla de dNTP de

Referencias

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