Aquí hay un protocolo para cultivar células madre pluripotentes (PSC) y células madre neurales (NSC) en un sistema de cultivo celular cerrado que permite la máxima esterilidad y reproducibilidad, reemplazando el gabinete de bioseguridad y la incubadora tradicionales. Este equipo cumple con las pautas de buenas prácticas clínicas de fabricación (cGMP) y buenas prácticas de laboratorio clínico (cGLP).
Artículo de método
El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica
En este artículo
Resumen
Resumen
Este artículo describe cómo utilizar un sistema de cultivo celular cerrado fabricado a medida y disponible comercialmente para la investigación básica y preclínica. Las cabinas de bioseguridad (BSC) y las incubadoras han sido durante mucho tiempo el estándar para el cultivo y la expansión de líneas celulares para la investigación básica y preclínica. Sin embargo, a medida que el enfoque de muchos laboratorios de células madre cambia de la investigación básica a la traducción clínica, se necesitan requisitos adicionales del sistema de cultivo de células. Todos los procesos deben estar bien documentados y tener requisitos excepcionales de esterilidad y reproducibilidad. En las incubadoras tradicionales, las concentraciones de gas y las temperaturas fluctúan ampliamente cada vez que las celdas se retiran para alimentarlas, pasarlas u otras manipulaciones. Tales interrupciones contribuyen a un entorno que no es el estándar para las directrices cGMP y GLP. Estas interrupciones deben minimizarse, especialmente cuando las células se utilizan con fines terapéuticos. La motivación para pasar del sistema estándar de BSC e incubadora a un sistema cerrado es que tales interrupciones pueden ser insignificantes. Los sistemas cerrados proporcionan un espacio de trabajo para alimentar y manipular cultivos celulares y mantenerlos en un entorno controlado donde la temperatura y las concentraciones de gas son constantes. De esta manera, las células madre pluripotentes y multipotentes pueden mantenerse en un estado de salud óptimo desde el momento de su derivación hasta su uso final en la terapia.
Introducción
Las técnicas estándar de cultivo de células madre sufren de varias limitaciones ambientales que ejercen presiones indebidas sobre las células y las exponen a riesgos inaceptables de contaminación. Entre las tensiones que las células pueden soportar en condiciones estándar de cultivo celular se encuentran cambios precipitados en los niveles de dióxido de carbono y concentraciones de oxígeno3,4. Esto ocurre cuando las células se trasladan de la incubadora a la cabina de bioseguridad y/o al microscopio, lo que puede no ser óptimo para las células. Estudios previos han confirmado las ventajas del cultivo de células madre pluripotentes y neurales en condiciones hipóxicas4,11 y, para obtener los mejores resultados, estas condiciones deben ser continuas. Además, los riesgos de contaminación celular son mayores, ya que el entorno y el personal del laboratorio inciden sobre las células en casi todas las etapas de su cultivo y manipulación. Las salas limpias tradicionales constituyen un método eficaz para disminuir en gran medida los riesgos de contaminación, pero son caras, ocupan un gran espacio y no abordan los factores estresantes relacionados con las concentraciones de dióxido de carbono y oxígeno.
Una instalación de producción de células que puede abordar tanto los riesgos de contaminación como las concentraciones de gas y que puede calificarse para cumplir con los criterios cGMP9 proporciona células de alta calidad para la investigación en ciencias básicas, así como para aplicaciones clínicas1,6,7. Una instalación de producción de células de este tipo consta, como mínimo, de los siguientes componentes: una cámara de proceso, que actúa como espacio de trabajo calefactado para la alimentación y manipulación de cultivos celulares; una campana de flujo laminar, para la esterilización inicial de reactivos, tubos y herramientas; dos cámaras de amortiguación de esclusas entre la campana y la cámara de proceso; dos incubadoras de cultivos celulares accesibles desde la cámara de proceso; una cámara de microscopio adyacente a la cámara de proceso; y, por último, software informático para establecer y supervisar las condiciones dentro de estos módulos. Con esta infraestructura básica, se pueden realizar una amplia variedad de tareas, como la alimentación estándar y el paso de células madre pluripotentes y células madre neurales multipotentes, así como métodos más especializados como la reprogramación basada en el virus Sendai, los estudios de migración in vitro y la diferenciación de células madre neurales para la caracterización electrofisiológica.
Protocolo
1. Configuración inicial
- Ajuste de gas y la temperatura Concentraciones
- Usando el software, haga clic en la pestaña "huésped" ubicado en la esquina superior izquierda de la interfaz gráfica. Entrar al sistema con un nombre de usuario y la contraseña designada. Asegúrese de que cada usuario tiene su propio nombre de usuario y contraseña.
- Haga clic en un módulo para ajustar (Figura 1). Dentro de la nueva ventana que muestra la configuración actual, haga clic en el valor del punto de O2 existente abajo "Punto de referencia" y entrar en el nivel de concentración de O2 requerido para este módulo. Introduzca 5% de O2 si las células madre pluripotentes se cultivan o manipulados en este módulo, y el 9% de O2 si las células madre neurales serán cultivadas o manipuladas. Haga clic en la marca verde para confirmar el punto de ajuste.
Nota: Dos módulos no son de gas ajustable: la campana laminar, y la cámara de microscopio. Las concentraciones de gas en la campana de flujo laminar son whil atmosféricae los de la cámara del microscopio se pasivamente mantenido por las concentraciones de gas en la cámara de proceso. - Repita este paso para CO 2. Introduzca un punto de CO2 al 5% fijo para todos los módulos excepto para las cámaras de amortiguamiento, que sólo son ajustables para O2.
- Monitorear las concentraciones de gas actuales, que están etiquetados como "valores de proceso", para asegurarse de que lleguen a los nuevos puntos de ajuste.
- Ajuste los puntos de ajuste de gas de todos los módulos a los valores apropiados. Coincidir con las de CO 2 y O 2 niveles de cámaras que serán expuestos el uno al otro. Por ejemplo, ajustar la cámara de proceso al 5% de O2 antes de abrir una incubadora de células que crece en un 5% de O 2. También ajuste al 5% de O2 cualquier cámara tampón que se utiliza para añadir elementos a la cámara de proceso durante este tiempo.
- Ajuste la temperatura de la cámara de proceso a 37 ° C utilizando la misma pantalla de ajustes de gas. Además, ajuste la cámara de proceso fLoor a la temperatura de 37 ° C.
- Haga clic en los bancos de módulos de incubación debajo de cada incubadora. Ajuste la temperatura de los bancos a 37 ° C.
- El funcionamiento de las Cámaras de búfer
- Reunir todos los suministros necesarios para la tarea dada (la alimentación, la división, la coloración, etc.) en el comienzo para evitar un retraso en el flujo de trabajo. Liberalmente pulverizar todos los materiales con un 70% de etanol y dejar que se sequen en la campana laminar. No rocíe frascos o placas de células - limpie suavemente con una esponja de gasa estéril saturada con un 70% de etanol.
- Asegúrese de que tanto las puertas exterior e interior de la cámara intermedia estén bien cerradas. A continuación, abra la puerta exterior, y colocar los elementos en el interior.
- Cierre la puerta exterior. Dentro del software, seleccione el módulo de respaldo y haga clic en la pestaña factor de dilución. Introduzca 1 en el cuadro de factor de registro. Haga clic en Inicio.
Nota: Un "factor de dilución" se define en el sentido de que la atmósfera del módulo de respaldo seser evacuado y sustituido 1 vez con gas limpio, con filtro HEPA. - Una vez que la interfaz gráfica ha dejado de parpadear "factor de dilución", abrir la puerta interior de la cámara intermedia y traer los materiales dentro de la cámara de proceso.
Precaución: No permita que las puertas interiores y exteriores como para que sea abierto al mismo tiempo y no abra la puerta interior si la cámara intermedia no ha sido objeto de un factor de dilución. - Con el fin de eliminar elementos de la cámara de proceso, primero asegúrese de que la cámara intermedia se ha sometido a un factor de dilución. A continuación, abra la puerta interior, colocar los elementos para ser retirados en el interior, y cerrar la puerta interior. A continuación, abra la puerta exterior y eliminar los elementos.
Nota: Un factor de dilución no tiene que ser ejecutado antes de abrir la puerta exterior.
2. La introducción y la alimentación de las células
- Configuración de la incubadora
- Coloque 3 placas de Petri en la bandeja de agua en la base de cada incubadora. Llenar estos platos con sterile agua. No llene directamente la bandeja de agua. Mantener el nivel de agua en estos platos, ya que son fundamentales para mantener el punto de referencia de humedad relativa (HR) en las incubadoras.
- Dentro de la interfaz gráfica, haga clic en la incubadora. Haga clic en el valor existente para la humedad relativa (HR) bajo punto de ajuste y entrar en el 85%. Haga clic en la marca de verificación verde para aceptar este valor.
- Preparación de la Unidad de producción celular para células
- Si no lo ha hecho, ajustar las cámaras de amortiguamiento, la cámara de proceso, y una incubadora para los puntos de ajuste de gas necesarios para el tipo de célula que se está introducido.
- Limpiar la superficie de la cámara de proceso con una gasa estéril y un desinfectante no inflamable. No usar cualquier desinfectante a base de ácido peracético, como en un sistema cerrado a los fuertes, vapores persistentes son tóxicos para células de mamífero. En su lugar, utilice productos a base de cloruro de benzalconio.
- Continuar la desinfección. Limpiar los guantes y las superficies que son commoólo tocó, tales como tiradores de las puertas. Utilizar el desinfectante bien pero con moderación, ya que el exceso de líquido en la cámara de proceso contribuirá a la humedad, la condensación y el posible desarrollo de microbios.
- Limpiar la superficie de la campana de flujo laminar y zona intermedia de la cámara con un 70% de etanol, y deje que se seque. Colocar el matraz o placa de células (en nuestro caso, PSC o NSC) en el capó, y brevemente limpie la superficie exterior con una esponja de gasa estéril saturada con etanol.
- Ponga el frasco o placa en la cámara de amortiguación, y ejecutar un factor de dilución (paso 1.2.3).
- Al finalizar el factor de dilución, mover inmediatamente el matraz o placa de la incubadora apropiado. Como las incubadoras están en la parte posterior de la cámara de proceso, tire de un estante a cabo en la cámara de proceso para la colocación de la célula. Evitar la apertura de las puertas de la incubadora innecesariamente o durante largos períodos de tiempo, como el aire de la cámara de proceso es muy seco en comparación con la de las incubadoras, y dará lugar a una significativala pérdida de humedad en la incubadora.
- La alimentación de Cultivos Celulares
- Reunir los componentes del medio, pipetas serológicas, una pipeta electrónica, gasas y desinfectante. También recoger un contenedor de residuos para el medio de cultivo celular gastado, pero no lo llene con lejía. Trae los materiales en la cámara de proceso a través de una cámara de amortiguación como se describe en la Sección 1.2. Preparar medio de cultivo celular en la cámara de proceso, como se describe previamente 9,10 (véase también la Tabla de Materiales)
- Organizar materiales de una manera tal que permita un espacio de trabajo óptima. Evite colocar objetos que no se utilizan en el centro de la cámara de proceso.
- Permitir que el medio se equilibre con las de CO 2 y O 2 niveles presentes en el sistema, dejando el recipiente destapado medios ligeramente. Algunos fabricantes indican medianas PSC no calentar el medio a 37 ° C; si este es el caso, utilizar una cámara tampón para equilibrar el medio. Permitir el míDium se equilibre durante 20 min.
- Retire el medio de edad de los pozos utilizando una pipeta estereologico adecuado y una pipeta electrónica. Para PSC, quite todos menos una pequeña cantidad restante de la edad media, suficiente para evitar la desecación durante el proceso de alimentación. Para NSC, quite la mitad de la edad media. Pipeta de los residuos en el contenedor de residuos.
- Coloque la pipeta utilizada de nuevo en su empaque original y moverlo a un lado de la cámara de proceso, o en una cámara intermedia designada para la eliminación de residuos. Con una pipeta serológica estéril fresco, añadir medio fresco a la celda placas de cultivo y colocar las placas de nuevo en su incubadora designada.
- Al final de la alimentación, rocíe una gasa con desinfectante y limpiar las manijas de las puertas de piso y de la cámara de proceso a fondo. Si hay varias líneas de células que se cultivan en el sistema, esterilizar en medio de la alimentación de cada línea celular. Esto ayuda a minimizar el riesgo de contaminación cruzada.
- Al finalizar, eliminar los residuosu otros elementos que no sean necesarios a través de una de las cámaras de amortiguamiento.
3. Los cultivos división de celdas
- Enzimática pases del PSC o NSC
- Reunir todos los elementos necesarios para los pases. Esto incluye medios de comunicación, enzima o tampón de disociación celular no enzimática (este último es para NSCs solamente), DPBS, placas o frascos, de la matriz extracelular (ECM), tubos cónicos, y pipetas serológicas. Introducirlos en el sistema utilizando una cámara intermedia.
- Escudo placas nuevas o frascos con ECM, como se describió previamente 9,10. Algunos ECMs -tales como las derivadas de líneas celulares de sarcoma de ratón - sólo están líquido entre 4 y 15 ° C, a fin de utilizar un bloque de hielo o gel de compresa fría esterilizada para mantener el frío ECM mientras se trabaja en la cámara de proceso calentada.
- Pipetear fuera el medio gastado de la cultura y disponer de ella en el contenedor de residuos.
- Enjuague bien la superficie o frasco usando 1 ml de DPBS / pocillo y disponer de los DPBS.
- Añadir 1 - 2ml de enzima caliente a cada pocillo. Sólo culturas muy densas requieren 2 ml.
- Inmediatamente mover la placa de cultivo o frasco a la cámara del microscopio, y observar cuidadosamente la cultura. Observe si hay señales de las células individuales comienzan a aflojar fuera del plato. No espere hasta que las células flotan en suspensión antes de proceder al siguiente paso.
- Volver a las células a la cámara de proceso principal. El uso de un 5 ml pipeta serológica, añadir 4 ml de DPBS para cada 1 ml de la enzima y, a continuación pipetear con fuerza arriba y abajo para desalojar las células de la superficie también. Si pases múltiples pozos dentro de una placa de paredes múltiples, añadir los DPBS a cada pocillo antes de desalojar las células de los pocillos individuales.
- La transferencia de la enzima y la suspensión de células PBS a un tubo cónico de tamaño adecuado.
- Si una centrífuga no está disponible en las instalaciones de producción de células, fuertemente sellar el tubo cónico, colocarlo en una cámara intermedia y selle la puerta cerrada.
- Retire el tubo cónico de la bufcámara de fer desde el lado de flujo laminar y girar las células a 100 xg durante 5 min a TA.
- Pulverizar el tubo cónico con 70% de etanol, y ponerla en la cámara de proceso usando una cámara de amortiguación y el factor de dilución.
- Pipetear el sobrenadante, y resuspender las células en 2 ml de PSC o medio NSC. Si pases PSC, asegúrese de incluir inhibidor de ROCK en el medio a una concentración de 10 mM, como se describió previamente 9,10.
- Contar las células usando un hemocitómetro, y determinar el número de pocillos o placas requeridas. PSC placa a 5 × 10 4 - 1 x 10 5 células / cm2. Dividir las células madre neurales en una proporción de 1: 2.
Nota: NSC menudo se aglutinan y se resisten recuento preciso en un hemocitómetro. - Si se requiere la criopreservación de las células, seguir el protocolo adecuado 9,10, pero hay que asegurarse de que todos los suministros y los medios de congelación se preparan con antelación y se colocan en el interior de la cámara de proceso. DMSO es muy tóxico para las células en 376; C, por lo que trabajar muy rápidamente. Mantener el contenedor de congelación-isopropanol con camisa a temperatura ambiente en la campana de flujo laminar. Una vez que los viales de crioconservación se llenan y se sellan, retire inmediatamente los viales de la cámara de proceso mediante el paso a través de una cámara intermedia.
- Manual de pases del PSC
- Confirmar que la cultura necesita ser pases, como se ha descrito previamente 8. Si es así, preparar nuevas placas o matraces recubiertos con una matriz extracelular. A continuación, cambiar el medio en su totalidad.
- Limpiar la cámara del microscopio con una gasa estéril humedecido con una cantidad moderada desinfectante no inflamable - demasiado dará lugar a un exceso en la cámara de nebulización. Sólo limpiar los guantes, Superficie, y el escenario. Trae varias puntas de pipeta 200 l envueltos individualmente o 1.000 l en la cámara.
- Llevar la placa del PSC en la cámara de microscopio, retire la tapa y coloque boca abajo sobre el piso recién limpiada. Al salir de la tapa hacia arriba expone la parte inferior dirrectamente a las corrientes de aire, y la posible contaminación.
- Desenvolver una punta de pipeta, y utilizando el microscopio para visualizar la cultura, desmenuzar las colonias que tienen buena morfología utilizando la punta de la pipeta.
Nota: La punta de la pipeta puede estar unido a una pipeta si el usuario individual encuentra este más cómodo. - Vuelva a colocar la tapa en la placa, y mover la placa de nuevo a la cámara de proceso.
- Pipetear el exceso de ECM de la nueva placa, y la transferencia de los medios de comunicación de la placa de edad (que contiene las piezas de colonias en suspensión) a la nueva placa. Si la plancha antigua todavía contiene colonias que no están listos para ser recogidos, alimentar a él también.
4. Técnicas de Cultivo especializado
- Sendai Transducción de fibroblastos en PSCs
- Dentro de la instalación de producción de células, expandir fibroblastos de piel humana 1 en los medios de fibroblastos que contienen DMEM / F12, 10% de FBS, y 20 ng / ml FGF2, al 5% O 2. Use 6 pocillos dishe culturas revestido con 0,1% de gelatina.
- Preparar las células a ser transducidas disociando con 1 ml de tripsina al 0,25% por pocillo. Inactivar la tripsina con medio de 1 ml de fibroblastos. Giran a 200 xg, resuspender las células en 1 ml de medio de fibroblastos, y el recuento utilizando un hemocitómetro.
- Volver a suspender 2,0 x 10 5 células en medio de fibroblastos 2 ml, y añadir la suspensión celular a 1 pocillo de una placa de 6 así recubierta con gelatina (2,1 x 10 4 células / cm 2). Poner las células de nuevo en la incubadora.
- Permitir 24 horas para que las células se adhieren a la parte inferior de la placa.
- Coloque medio de fibroblastos fresco dentro de la cámara de proceso (1 ml de medio por pocillo de células para ser transducidas), y deje que se equilibre a los gases.
- Esterilizar un bloque frío enfriado previamente con etanol al 70% y lo coloca en una cámara de amortiguación. Use una bolsa de hielo en gel con agujeros en ella, si un bloque frío comercial no está disponible.
Nota: Existen 3 - 4 separada Sendaivirus (dependiendo de la versión del kit de transducción), que debe ser descongelado rápidamente, pero se mantuvo en el bloque frío, una vez descongelado. - Sumergir la mitad inferior de los tubos en un baño de agua a 37 ° durante 15 segundos (no sumerja los tubos), a continuación, limpie inmediatamente los exteriores de tubo con un 70% de etanol. Colocar los tubos en el bloque frío estéril en la cámara intermedia y ejecutar un factor de dilución.
- Trabajando rápidamente, añadir el volumen necesario de cada virus Sendai reprogramación al medio de equilibrado 2. Este volumen está determinado por tres variables - el número de células, el título de cada virus, y la multiplicidad de infección deseada para cada virus. Consultar el manual del kit de MOI recomendado. La fórmula es:
[(Número de células que se transfecta) (multiplicidad de infección) (1,000)] / (título viral) = requerida l de virus - Eliminar el sobrenadante desde el pozo (s) de las células para ser reprogramado. Para cada pocillo, añadir 1 ml de la medium contiene los virus. Agite suavemente la placa, teniendo cuidado de no derramar medios de comunicación, y colocar la placa posterior en el 5% de O2 incubadora.
- Después de 2 horas mueva suavemente la placa de nuevo y repetir de nuevo después de otras 2 horas.
- Después de 24 horas (día 1 después de la transducción), alimentar el bien con 1 ml de medio de células madre pluripotentes. Repetir en el día 2, pero no retire medio del pozo.
- En los días 3 y 4, cambiar la mitad del medio.
- En el día 5 y más allá, cambiar todo el medio.
- Cuando aparecen colonias, manchar el cultivo utilizando anticuerpos estériles para confirmar que las colonias son de hecho pluripotentes, como se ha descrito anteriormente 2. Al igual que con las células de alimentación, aseguran que los medios de comunicación del PSC que contienen los anticuerpos se ha equilibrado a los gases en la planta de producción de células.
Nota: En una reprogramación éxito, colonias IPSC deben estar presentes aproximadamente dos semanas después de la transducción 1. - Cuando las colonias han crecido muchosuficiente, utilizar el microscopio para marcar el paso y les mecánicamente sobre una placa revestida de ECM, como se describe en la sección 3.2.
- Expandir las colonias ya sea manualmente o enzimáticamente, como se describe previamente 9,10.
5. La limpieza después de uso diario
- Coloque todos los materiales de desecho, incluyendo el frasco de residuos líquidos, en una cámara tampón estéril. Limpie la superficie de la cámara de procesamiento y todas las áreas que hayan estado en contacto por suministros con una gasa estéril y desinfectante no inflamable.
- Retire todos los materiales de desecho sólidos de la cámara intermedia y desechar en el contenedor de residuos apropiado.
- Desechar los residuos líquidos en un recipiente apropiado para desechos, o simplemente mezclar con lejía y se vierte por el desagüe. Limpiar el contenedor de residuos de jabón y un cepillo. Esterilizar el recipiente con 70% de etanol y moverse de nuevo a la cámara de proceso a través de una cámara intermedia.
Nota: No se recomienda el uso de cloro enel contenedor de residuos mientras se encuentre dentro del sistema, en forma de humos de blanqueo pueden recircular y dañar los cultivos de células. - Por razones de higiene, limpie la superficie de plástico delante de la cámara de procesamiento del sistema con 70% de etanol. Esto ayuda a limpiar aceites de sudor y de la piel de la frente del usuario.
- Si se produce condensación acumulado en el interior de la cámara de proceso, ejecute un factor de dilución para eliminar la condensación. Deje por lo menos 1 hora para que esto se complete.
6. Las tareas de rutina no cotidianas
- Reponer los platos de agua en las incubadoras de cultivo de células con agua destilada estéril, según sea necesario. Parte superior de los platos al menos una vez a la semana. Sin embargo, la tasa de evaporación fluctuará según la frecuencia con que se abran las puertas de la incubadora, el volumen de líquido en los cultivos, y la configuración de la incubadora.
- Una vez al mes, recalibrar los O 2 y CO 2 en la configuración de todas las cámaras. Esto requiere el uso de los gases de ajuste (calibración), que contains conocen los niveles de concentración de O2 y CO2 como un estándar de referencia. Asegúrese de que no hay suministro de gas SPAN adecuado antes de comenzar la calibración. El sistema utiliza sensores de gas específicos, situados en cada módulo, para detectar las concentraciones de gases; Por lo tanto, el uso de gases SPAN de alta calidad se asegura de que los sensores producen de forma fiable las concentraciones de gases precisos.
- Reemplazar los guantes en la cámara de proceso y la cámara de microscopio sobre una base regular. Reemplazar los guantes cada 2 meses, independientemente de con qué frecuencia se utiliza el sistema. Antes de la instalación, esterilizar los nuevos guantes con desinfectante. Ejecutar un factor de dilución en la cámara de proceso después de que los guantes han sido reemplazados.
Nota: Cuando se estira sobre los manguitos del sistema, guantes de nitrilo tienen una tendencia a desarrollar agujeros en las áreas expuestas al estrés físico y el calor. Esto es normal y el desgaste inevitable y desgarro. - Cambie los filtros de jeringa en todas las cámaras cada 6 meses.
- Reemplazar o lavar tque prefiltro en la campana de flujo laminar tan pronto como se empieza a aparecer sucia.
- Consulte la documentación del fabricante regularmente para obtener información sobre la sustitución de las piezas principales.
7. Limpieza del Sistema
- En caso de un evento importante contaminación afecta a la mayoría de los cultivos celulares, mover los cultivos de células supervivientes fuera del sistema, o (si es posible) en una incubadora no afectado.
- Desactivar el control de gas para todas las cámaras, excepto la de incubadoras no afectados.
- Retire el panel frontal flexible del aparato, y retirar los estantes de acero inoxidable de la incubadora de cultivo celular afectada. También quite la bandeja de agua.
- Autoclave los estantes de la incubadora y la bandeja de agua, y ponerlos de nuevo en la incubadora. Limpiar las superficies interiores de la incubadora con 70% de etanol. Deje que el etanol se evapore, y cerrar la puerta de la incubadora.
- Limpiar las superficies de la cámara de proceso y el microscopio con 70% etHanol. Vuelva a colocar el panel frontal del aparato.
- Limpiar las superficies interiores del aparato, incluyendo el de la incubadora afectada, con desinfectante no inflamable. Deje la puerta abierta de la incubadora afectada, y ejecutar un factor de dilución en la cámara de proceso. Asegúrese de que las puertas de la cámara microscopio también están abiertos.
- Para la limpieza rutinaria de las incubadoras de cultivo celular, asegúrese de que la incubadora y cámara de proceso se encuentran en la misma configuración atmosféricas. Abrir la puerta de la incubadora, y colocar todas las placas de cultivo celular en la superficie de la cámara de proceso.
- Limpie los estantes de la incubadora y las superficies interiores con desinfectante no inflamable. Deje que el desinfectante se evapore, y mover los cultivos de células de nuevo a la incubadora. Trabajar lo más rápidamente posible para evitar la desecación de los cultivos celulares.
Resultados
Este manuscrito describe con cierto detalle una instalación de producción de células, y los aspectos únicos de cultivo de células dentro de un sistema cerrado. La mayor parte de las instalaciones de producción de células comprende un aparato de medida, cerrado, cultivo celular, que tiene un tamaño reducido y puede alojarse fácilmente dentro de un 6 x 7,5 m 2 habitación (Figura 2). En ningún momento son las células dentro del aparato expuesto a personal de laboratorio o ambiente. El aparato consiste en varios módulos: una cámara de proceso, una campana de flujo laminar, 2 cámaras de esclusa de aire en el almacenamiento en búfer entre la campana y la cámara de proceso, dos incubadoras de cultivo de células, y una cámara de microscopio adyacente a la cámara de proceso (Figura 3). El sistema es controlado por un software que permite a las variables ambientales pueden controlar y monitorizar (Figura 1). El equipo que ejecuta este programa se encuentra en un sistema de alimentación ininterrumpida. Los gases se introducen en THsistema de correo por un conjunto de colectores para oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono (Figura 4). Gases para el dispositivo están alimentados por sistemas múltiples que tienen dos juegos de tanques cada uno - un conjunto activo y un conjunto de reserva. Cuando el conjunto activo se dibuja hacia abajo, el colector cambia automáticamente a los tanques de reserva de reemplazo para fijar y personal. El poder está en un sistema generador de respaldo.
Pluripotentes y células madre neurales pueden ser cultivadas en condiciones hipóxicas en esta instalación utilizando protocolos desarrollados anteriormente 9, con las complicaciones añadidas inherentes al equipo novela. Las células madre pluripotentes se pueden derivar usando virus Sendai, usando anticuerpos-pluripotencia específico para identificar colonias totalmente transfectadas, que luego se aislaron y expandieron. (Figura 5A y B), A partir de estos iPSCs, las células madre neuronales y neuronas se pueden derivar usando la inhibición dual SMAD, y su fenotipo USI verificados ng anticuerpos NSC-específicos (Figura 5C y D).
Figura 1. Interfaz gráfica para la instalación de pilas de Producción. (A) La representación gráfica de la ACB es la pantalla predeterminada y coincide con el dibujo CAD se muestra en la Figura 3. Un clic del ratón sobre el Buffer Módulo 1 (2F en la Figura 1) abre su pantalla de control (B), donde se establecen los valores de O2 para que coincida con la cámara de procesamiento (3 en la Figura 3). Del mismo modo, al hacer clic en el Proceso de Sala o Incubadora 1 trae sus respectivas pantallas de control (C y D, respectivamente), donde los valores pueden ser cambiados o monitoreados según corresponda. rget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El mecanismo de producción de células. (A) El sistema como se ve desde una vista frontal derecha. Tenga en cuenta las conexiones eléctricas y de gas en el techo y el carro con los accesorios de microscopio y el ordenador a la derecha. (B) La campana de flujo laminar con las puertas de acceso a los módulos de tampón visto a la derecha. (C) La cámara de proceso con los dos incubadoras (puertas negras) visto en la parte trasera. (D) Una vista a través del lado derecho del sistema que muestra el microscopio y monitor con las puertas de las cámaras de amortiguamiento visto en la distancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Un dibujo de CAD de la Línea de Producción de la célula. Todos los artículos que entran en el dispositivo se limpió primero con alcohol y secado al aire en la campana de flujo laminar (1). Los productos son entonces la transición a la atmósfera apropiada en el módulo de almacenamiento intermedio frontal (2F) antes de ser pasado en el módulo UCPC, o Proceso de cámara (3). Las células se cultivan en las dos incubadoras (4, 5). Tinción de células vivas, la recolección de la colonia, la evaluación de la morfología celular general y análisis de la migración se lleva a cabo en el módulo de la UPC, o cámara del microscopio (6). Por último, los residuos sale del sistema a través del módulo de amortiguación trasera (2R). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. < / P>
Figura 4. Fuentes de gases y el poder. (A) El colector de CO 2 es una configuración de 4 x 4, ya que suministra todos los incubadores de laboratorio. (B) El colector de O 2 es una configuración y materiales de construcción solamente la instalación de producción de células 2 x 2. Nitrógeno para el sistema se genera en un vaporizador (C, justo por debajo de la señal de salida) unida a un colector de nitrógeno líquido (a la derecha), que también llena automáticamente cryofreezers (parte inferior izquierda). El colector es una configuración de 2 x 2 que se suministra por dos pares de tanques de nitrógeno líquido 160 L. CO2, O2 y N2 son suministrados desde el techo a través de válvulas de cierre (D). Casa de vacío también se suministra en esta ubicación. Ve justo detrás de las válvulas de cierre de gas de alimentación son un par de cables de alimentación que suministran energía al sistema.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. pluripotentes células madre derivadas de la hipoxia con el virus Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs CMPI (nomenclatura que se encuentran en Stover et al. 9), contraste de fase 10x. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs vivo-manchada de marcado AF-594 Tra-1-60, dilución 1: 100 en los medios de comunicación. Todas las células iPS fueron transducidas en las instalaciones de producción de células en 5% de O2 con el virus Sendai. (C) El contraste de fases de NSC-UH0-2I0-SC68.1-M0S13 N2G6 derivados de IPSC-, que se cultiva en el 5% de O2 en la cámara de diapositivas. Las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con el anticuerpo primario anti-nestina humano, y el anticuerpo secundario Alex-488. Todas las barras de escala son en 1001;. M Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Las células cultivadas dentro de los CPF ver ningún cambio en las concentraciones de oxígeno o dióxido de carbono a medida que se mueven de incubadora a la cámara de procesamiento al microscopio cámara y la espalda. Es fundamental que las condiciones en cada cámara se adaptan a la incubadora particular en la que se mantienen las células antes de que las células se retiran de la incubadora. La atmósfera dentro del aparato es continuamente filtra-HEPA y es adaptable con respecto a las concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono. Las células pueden ser cultivadas en concentraciones estándar para PSCs o NSCs, 5% y 9%, respectivamente; o concentraciones alternativas pueden ser elegidos para los diferentes tipos de células o para experimentos específicos. Así, el aparato se suministra con fuentes constantes de grado médico de oxígeno, dióxido de carbono, y nitrógeno (Figura 4). Los tres de estos gases son suministrados por los sistemas colectores de gases específicos que aseguran un abastecimiento constante. El aparato también se suministra con una mezcla de gas de calibración que consiste en10% (± 0,01%) de dióxido de carbono en oxígeno. Los sistemas múltiples están alojados fuera de la planta de producción de células y los gases se canalizan en la instalación a través del techo. El gas de calibración se encuentra dentro de la instalación. El aparato se suministra adicionalmente con vacío de la casa, también a través del techo. El uso de un sistema de control electrónico e inalámbrico unidades de transmisión, las presiones de salida de los colectores son monitoreados constantemente. En el caso de que cualquier presión cae fuera del rango, los operadores de las instalaciones de producción de células se llamaron por teléfono de forma automática y notificados de tal manera que la acción apropiada puede ser tomada.
Los requisitos de alimentación del aparato se cumplen por seis dedicados 120 V circuitos que descienden desde el techo y conectados a generadores de emergencia del hospital para garantizar un suministro constante. El funcionamiento del aparato se controla mediante software en un equipo basado en PC alimentado a través de un sistema de alimentación ininterrumpida. Estos arreglos de poder y de la computadoragarantizar que el sistema funciona de forma continua, incluso en caso de un fallo del sistema de alimentación pública. El software que controla el aparato cuenta con una interfaz gráfica fácil de usar (Figura 1), que permite el control de las concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono, así como las presiones de la temperatura, la humedad, y de cámara. Los valores de todos estos parámetros se registran continuamente para proporcionar un registro actualizado de todos los parámetros del aparato. Estos datos son una copia de seguridad en un servidor remoto todas las noches para proteger su integridad. El ordenador y el software se puede acceder de forma remota por los usuarios administrativos para evaluar y / o cambiar cualquier parámetro. Además, el equipo y el software se puede acceder de forma remota, lo que permite la evaluación interactiva de parámetros del aparato y solución de problemas con los usuarios locales. Una unidad de envío adicional de alarma está conectado al aparato de tal manera que los operadores de instalaciones de producción de células son notificados de cualquier condición de fuera de alcance del aparato. El acceso remoto capabilities permiten conectarse y evaluación de las características específicas de la condición de fuera de rango.
El aparato está diseñado como un sistema modular tanto en una macro y micro un sentido. módulos de cultivo de células individuales, tales como incubadoras y cámaras de procesamiento, se pueden personalizar en cuanto a sus dimensiones y requisitos, así como en su diseño con respecto a la otra. Además, la mayoría de las funciones de control de los módulos individuales son en sí mismos modular de tal manera que los controladores individuales de gases atmosféricos, por ejemplo, puede reemplazarse fácilmente sin interrupción significativa al sistema.
cámaras de tratamiento especializados, tales como uno para visualización y manipulación de los cultivos celulares al microscopio, se adaptan fácilmente al sistema. Tanto de contraste de fase y microscopio de fluorescencia están en el interior del sistema (Figura 6), de modo que las células se pueden teñir en vivo, y las colonias pueden ser diseccionados en las mismas condiciones atmosféricas como dentro de tél incubadoras. Enrutamiento de cables a través de los ojales selladas en las paredes laterales de la cámara de procesamiento permite a equipos tales como fuentes de alimentación y equipos para mantenerse fuera del aparato, por lo general en un carro (Figura 6).
Las cámaras de tratamiento en las instalaciones de producción de células tienen un patrón de flujo de aire diferente que BSC convencionales. En BSC convencionales, el flujo de aire fluye hacia abajo desde una salida de escape central y se divide en dos corrientes separadas, que se recoge a continuación por dos entradas de aire diferentes en la parte de proa y popa del piso del gabinete. Por el contrario, la CPF tiene una sola abertura en la parte delantera del techo. El aire fluye hacia abajo y hacia la parte posterior de la cámara, donde luego se arrastra hacia arriba en una ventilación de entrada. Aunque la CPF es inherentemente muy limpio, este patrón de flujo de aire único significa que los técnicos tienen que ajustar ligeramente su técnica para reducir el riesgo de contaminación. Al igual que con un BSC convencional, un laboratorio trabajador should evitar colocar sus manos aguas arriba de las placas de cultivo de células abiertas y botellas de medios de comunicación. Sin embargo, la dirección que está aguas arriba ha sido alterado de la ACB
El laboratorio planta de producción de células en sí es bastante estándar y viene equipado con un congelador -20 °, un congelador a -80ºC, a 4 ° C refrigerador, una centrífuga y un baño de agua. El laboratorio también tiene un fregadero con pedales de control para la operación de manos libres integrada. A fin de que este laboratorio para convertirse en una planta de producción de células clínico funcional, sin embargo, deben aún ser hechas varias modificaciones adicionales. En primer lugar, el aparato en sí mismo debe ser actualizado a tener la capacidad de supervisar los compuestos orgánicos volátiles, partículas, y las concentraciones de dióxido de cloro que se utiliza para la descontaminación. En segundo lugar, una cámara de procesamiento que contiene una máquina de FACS puede estar alojado y conectado al resto del aparato a través de un módulo de memoria intermedia. Esto permitirá la clasificación de células y purificación de trpoblaciones de células ansplantable en las condiciones ambientales adecuadas. Por último, todo el aparato debe ser alojado dentro de una pared blanda de sala limpia. Esto proporciona una Organización Internacional de Normalización clase (ISO) 8 entorno de los 5 aparatos.
La alta esterilidad y la naturaleza controlada por ordenador de la ACB lo convierte en un sistema ideal para aplicaciones futuras con terapia basada en células y buenos procesos de fabricación. El riesgo de contaminación es mitigado en gran medida, pero lo más importante, las condiciones de la expansión celular se registran y archivada por el sistema de ordenador de forma automática. Las desviaciones en las concentraciones de gases, la temperatura, la humedad y todos los eventos de acceso en el sistema son rigurosamente documentados. Esto puede ser de gran ayuda en la investigación de problemas de calidad del producto. Sin embargo, todavía hay limitaciones. El uso de cualquier y todos los reactivos y materiales de construcción (por ejemplo, componentes de medios, pipetas, placas) se debe documentar por separado. Añadiritionally, hay una multitud de problemas potenciales (incluyendo muchas formas de error humano) que se vayan surgiendo y que no tienen ninguna relación con las variables documentadas por sistema de monitoreo de la ACB. Por lo tanto, la necesidad de personal altamente capacitado y documentación manual detallado de tareas permanece en su lugar.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores desean dar las gracias al personal de Biospherix por su ayuda en el aprendizaje del uso del sistema de cultivo celular XVIVO cerrado, especialmente Matt Freeman; el personal de Miles & Kelley Construction Company, Inc., por su trabajo en la creación de la infraestructura de laboratorio, especialmente Russ Hughes; el personal del Hospital de Niños del Condado de Orange departamento de instalaciones y servicios de apoyo a su trabajo en la coordinación de la remodelación de laboratorio, especialmente Adam Lukhard y Devin Hugie; el personal del Hospital de Niños del Condado de Orange departamento de Sistemas de Información por su ayuda en la creación de la infraestructura de gestión de datos y el acceso a distancia, especialmente Viet Tran; Hospital de Niños del Condado de Orange Equipo de Gestión Ejecutiva por su constante apoyo del proyecto, especialmente al Dr. Maria Miñon y Brent Dethlefs. Este trabajo fue financiado por el Hospital de Niños del Condado de Orange y el Instituto Regenerativa de California Medicine a través TR3-05476 subvención a PHS. Todos los autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | hecho a | |
| Xvivo Software | Biospherix | versión i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Colector | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Colector | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Colector | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscopio con cámara DP21 y fluorescencia | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Reactivos | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Suplemento | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Hidrolona de sodio tamponada con fosfato | 9236 | ||
| Factor de crecimiento de fibroblastos 2 | R& D Systems | AFL233 | |
| Protide de sulfóxido de dimetilo | PP1130 | ||
| Basado en Hank's Tampón de disociación celular | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoetanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Factor de crecimiento epidérmico | R& D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Anticuerpo | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Anticuerpo | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Anticuerpo | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Suero Suplemento | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Consumibles Consumibles | |||
| 2 ml pipeta serológica | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml pipeta serológica | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml pipeta serológica | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 ml Pipeta serológica | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Pipeta serológica | Olympus Plastics | 12-107 | |
| Placa de 6 pocillos | Corning | 353046 | |
| placa de 12 pocillos | Corning | 353043 | |
| Matraz T25 | TPP | 90026 | |
| Matraz T-75 | TPP | 90076 | |
| 20 µ l puntas de pipeta | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µ l puntas de pipeta | Eppendorf | 22491148 | |
| 1.000 puntas de pipeta | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% etanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach Clorox | A714239 |
Referencias
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- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
Reimpresiones y permisos
