Artículo de método

Diferencias de sexo en el ratón del hipocampo después de astrocitos

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DOI:

10.3791/53695

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25 de octubre de 2016

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1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

En este artículo

Resumen

Los astrocitos son uno de los jugadores clave más importantes en el sistema nervioso central (SNC). Aquí, estamos reportando un método práctico de protocolo de cultivo de astrocitos del hipocampo sexado con el fin de estudiar los mecanismos que subyacen a la función de los astrocitos en cachorros recién nacidos masculinos y femeninos después de la isquemia in vitro.

Resumen

Astrogliosis siguiente / isquemia (HI) -relacionado lesión cerebral por hipoxia juega un papel en el aumento de la morbilidad y la mortalidad en los recién nacidos. Los estudios clínicos recientes indican que la gravedad de la lesión cerebral parece ser dependiente del sexo, y que los recién nacidos varones son más susceptibles a los efectos de la lesión cerebral relacionada con HI, dando lugar a resultados neurológicos más graves en comparación con las mujeres con lesiones cerebrales comparables. El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones altamente enriquecidas de los astrocitos del hipocampo sexuado es esencial para entender las bases celulares de las diferencias sexuales en las consecuencias patológicas de HI neonatal. En este estudio, se describe un método para crear cultivos de astrocitos de hipocampo específicos del sexo que están sometidos a un modelo de isquemia in vitro, la privación de glucosa en oxígeno, seguido por la reoxigenación. astrogliosis reactiva subsiguiente fue examinado por immunostaiNing para la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y S100B. Este método proporciona una herramienta útil para estudiar el papel de los astrocitos del hipocampo masculinos y femeninos siguiente neonatal HI, por separado.

Introducción

Los astrocitos son uno de los jugadores clave más importantes en el sistema nervioso central (SNC). La creciente cuerpo de evidencia indica que las funciones de los astrocitos son más que proporcionar apoyo neuronal. De hecho, las funciones de los astrocitos en condiciones fisiológicas pueden ser muy complejos, como guía la migración de los axones en desarrollo 1, la regulación de CNS flujo de sangre 2, el mantenimiento de la homeostasis del pH del fluido intersticial sináptica 3, y participar en la barrera hematoencefálica 4 y 5 la transmisión sináptica. En condiciones patológicas, los astrocitos responden a la lesión con un proceso llamado astrogliosis reactiva en la que la morfología, el número, la ubicación, la topografía (con respecto a la distancia de insulto) y la función de los astrocitos pueden cambiar de una manera heterogénea 6,7. Astrogliosis visto después de la encefalopatía hipóxico-isquémica neonatal puede que contribuye a la morbilidad y la mortalidad de los recién nacidos 8.

estudios clínicos y experimentales recientes indican que la gravedad de la lesión cerebral parece ser dependiente del sexo y que los recién nacidos masculinos son más susceptibles a los efectos de la hipoxia / isquemia (HI) lesión cerebral -related, resultando en resultados neurológicos más graves en comparación con las mujeres con lesiones cerebrales comparables 9-11. Aunque la localización de la lesión depende de la edad gestacional y la duración y la gravedad de la lesión, el hipocampo es una de las regiones más comúnmente realizada en el SNC después neonatal HI plazo, y astrogliosis hipocampo ha sido confirmado por la sobre regulación de aumento la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) 3 d después de la HI neonatal 7,10,12,13. Las diferencias de sexo en función de los astrocitos se muestran en ambos neonatos y roedores adultos después de la isquemia cerebral 14,15. Además, la susceptibilidad astrocytic macho a la isquemia in vitro se demostró por el aumento de cell muerte en comparación con los astrocitos corticales femeninas en la cultura 16.

Las diferencias de sexo comienzan en el útero y continúan hasta la muerte 17. Durante la última década, la importancia de incluir los sexos en condiciones experimentales en cultivo celular y estudios in vivo han sido el énfasis del Instituto de Medicina y los NIH para buscar el conocimiento fundamental de las diferencias sexuales observadas en condiciones fisiológicas y patológicas 17,18 . El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones de astrocitos del hipocampo sexuado es esencial para entender las bases celulares de las diferencias sexuales en las consecuencias patológicas de HI neonatal. El presente estudio fue diseñado para proporcionar las técnicas para preparar cultivos de astrocitos del hipocampo sexo-específicas enriquecidas a partir de ratones recién nacidos con el fin de evaluar el papel de los astrocitos GFAP-inmunorreactivas siguientes oxígeno / glucosa Privación (OGD) y reoxigenación (Reox), induciendoHI en el ambiente de cultivo celular. Esta técnica se puede utilizar para probar cualquier hipótesis relativa a los astrocitos del hipocampo en los machos y hembras neonatales en condiciones de normoxia e isquémicos.

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Protocolo

NOTA: Este estudio se realizó de conformidad con la recomendación de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud. El animal protocolo fue aprobado por la Universidad de Wisconsin-Madison, Institucional Cuidado de Animales y el empleo. Protocolo de cultivo de astrocitos primarios que se presenta aquí se adopta a partir de los protocolos presentados por Zhang Y 19 et al., Y Cengiz P 20 et al., Con algunas modificaciones.

1. La disección y del hipocampo Astrocyte Cultura

  1. Preparar todos los reactivos y materiales necesarios, incluyendo tijeras quirúrgicas, pinzas finas lisas, pinzas de punta plana, toallas de papel, bolsas de basura, 70% de etanol y 2 platos de disección (3,5 cm de diámetro) en el hielo llenos de 2 Solución de ml salina equilibrada de Hank (HBSS) cada . Asegúrese de que el equipo quirúrgico son estériles (autoclave) antes del procedimiento y el uso de todos los demás materiales (Astrocyte medio de baño: suero de DMEM + 5% + caballo1% de penicilina-estreptomicina, suero de caballo, HBSS, 0,25% de tripsina, cubreobjetos de vidrio, placas de Petri, 15/50 ml tubos, matraces T25, etc.) como pre-estéril.
  2. Coloque un lado y rociar la cabeza y el cuello de la cría de ratón con un 70% de etanol y decapitar con unas tijeras estériles afiladas [Figura 1 (1)].
  3. Realizar una incisión en la línea media de posterior a anterior cráneo con unas tijeras pequeñas a lo largo del cuero cabelludo para exponer el cerebro [Figura 1 (2-3)].
  4. Cortar el cráneo con cuidado desde el cuello hasta la nariz con pequeñas tijeras. A continuación, corte anterior cráneo hasta los bulbos olfativos e inferior al cerebelo para desconectar el cráneo desde la base del cráneo.
  5. Hacer una pequeña incisión en la base del cráneo y cortar a lo largo de la línea media. El uso de fórceps de punta plana estériles para despegar el cráneo. Quitar el tallo cerebral con la ayuda de unas pinzas curvas. Retire el cerebro del cráneo y el lugar en el primer plato de disección [Figura 1 (4-9)] 21.
  6. Usando unas pinzas curvas, darle la vuelta al cerebro de manera que la superficie ventral del cerebro esté orientada hacia arriba y luego separar los dos hemisferios con una cuchilla quirúrgica estéril aguda [Figura 1 (10,11)]
  7. Despegue los hemisferios cerebrales y cuidadosamente retire el tejido del cerebro medio y el tálamo abultada con unas pinzas curvas planas estériles para revelar el hipocampo, una estructura pequeña, con forma de caballito de mar en el lóbulo temporal medial [Figura 1 (12-14)].
  8. Eliminar tanto los lóbulos del hipocampo [Figura 1 (15,16)] y diseccionar cuidadosamente las meninges de los lóbulos tirando con las pinzas finas. Este paso evita contaminación del cultivo de astrocitos definitiva por células de las meninges y los fibroblastos.
  9. La transferencia de los lóbulos del hipocampo preparados en el segundo plato lleno de HBSS y devolverlo en hielo [Figura 1 (17,18)]. Piscina, tanto del hipocampo lóbulos de un solo ratón (P0 - P2) para la preparación de hipopótamocultivos de astrocitos campal. Esto le da a la densidad apropiada de astrocitos. Picar lóbulos del hipocampo utilizando una cuchilla afilada quirúrgico estéril (aproximadamente 4 veces).
  10. Aspirar HBSS del plato utilizando una punta estéril conectada a una pipeta de 1 ml y añadir 3 ml de tripsina al 0,25%, mezcla, transferir a un tubo cónico estéril de 15 ml e incubar el tejido a 37 ° C durante 20 minutos con agitación suave.
  11. Tubo de centrífuga a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con cuidado usando una pipeta de vidrio estéril conectada a una línea de vacío. Añadir 10 ml de astrocitos medio y se tritura chapado (20 - 30 veces) usando una pipeta de vidrio pulida al fuego hasta que las piezas de tejido homogeneizar.
  12. Tubo de centrífuga a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 2 ml de medio de astrocitos chapado fresca precalentada. Pase células a través de un filtro de malla 70 micras (filtro de células) en un nuevo tubo cónico de 50 mL.
  13. toda la placa de suspensión de células en un matraz de cultivo T25 estéril poli-D-lisina / laminina recubierta que contiene 3 ml demedios de astrocitos chapado, a continuación, se incuba el matraz a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
  14. Toda Aspirar los medios de comunicación en día- i n-vitro (DIV) 1, 3 y DIV DIV 7, y reemplazar con 2 ml de medio fresco de astrocitos en placas. Observar la progresión y la confluencia de los astrocitos bajo microscopio de luz cada vez, mientras que la sustitución de los medios de comunicación astrocito chapado.
    NOTA: En DIV 1, todos los astrocitos viables están unidas a la superficie del matraz de cultivo y las células muertas o moribundas que incluyen neuronas están flotando en el sobrenadante. En DIV 3, las células unidas comienzan a dividirse para formar la capa de células de los astrocitos. En ausencia de las condiciones de apoyo, la cultura es casi desprovisto de cualquier crecimiento neuronal. En DIV 7, la capa de astrocitos es de aproximadamente 80 - 90% confluentes y unos pocos microglia, así como precursores de oligodendrocitos están presentes en la parte superior de la capa de astrocitos.
  15. Aspirar el medio en placa del matraz, añadir 2 ml de medio precalentado astrocito chapado fresca, enjuague unand remover de nuevo en DIV 11, cuando los astrocitos son confluentes y listo para sub cultivo.
  16. Añadir 2 ml de tripsina al 0,25%, gire suavemente el frasco unas cuantas veces y tripsina aspirado utilizando una pipeta de vidrio estéril.
  17. Añadir 2 ml de tripsina al 0,25% y dejó que el matraz se sienta en la campana de cultivo de tejidos durante 4 - 5 min a temperatura ambiente.
  18. Retire la tripsina y mantener el matraz a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 10 min. Añadir 5 ml precalentado astrocito medio en placa y separar la capa de astrocito tocando el frasco contra la palma de la mano (3 - 4 veces) seguido por trituración suave para lograr la separación completa y recoger los astrocitos en un tubo cónico de 15 ml.
  19. tubo de centrifugación a 300 xg durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante, y se añade 1 ml de medio fresco astrocito chapado.
  20. Añadir 10 l de la suspensión celular a un hemocitómetro y contar las células en la gran zona cuadriculada central (1 mm 2) usando un microscopio de contraste de fases invertido (objetivo 10X). multiply por 10 4 para estimar el número de células por ml. Un matraz T25 rendirá ~ 1 x 10 6 células totales disociado. Seed ~ 1 x 10 5 células en 2 ml de astrocitos medio en placa en un 12 mm de diámetro de poli-D-lisina cubreobjetos de vidrio con capa preliminar en el pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos.
  21. Se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Realizar OGD / Reox en DIV 12 - 14 (apartado 2).
  22. El tratamiento de los cultivos de astrocitos en DIV 3 con clorhidrato de 5 mM de L-leucina metil éster (LME) hasta DIV 11 si se desean cultivos de hipocampo carentes de la microglia. Después de la incubación de la LME, los cultivos sometidos a agitación (300 rpm durante 1 h) para eliminar la contaminación de la microglía.
    NOTA: LME es un agente citotóxico microglial que se ha utilizado ampliamente como un método para eliminar la proliferación de microglia 22.

2. OGD / Tratamiento Reox

  1. Aspirar los medios de cultivo que contienen cubreobjetos astrocito adherente (DIV 12 - 14) y enjuagar 3 veceshaciendo girar suavemente la placa de cultivo de 24 pocillos que sostiene el cubreobjetos un par de veces con 1 ml de solución isotónica de OGD (pH 7,4) que contiene (en mM): 0 glucosa, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, CaCl2 1,27 y 0,81 MgSO4.
  2. Añadir 0,2 ml de solución OGD para así cubrir el cubreobjetos y se incuba durante 2 h en un incubador hipóxico que contiene 94% N 2, 1% O 2, y 5% de CO 2. Mezclar suavemente con un agitador orbital (50 rpm) para la primera 30 min de hipoxia para facilitar el intercambio de gases.
  3. Se incuban las células de control de normoxia durante 2 h en 5% de CO2 y aire atmosférico en un tampón idéntico a la solución OGD a excepción de la adición de glucosa 5,5 mM.
  4. Para Reox, solución OGD aspirado y añadir 2 ml de medio de baño de astrocitos. Incubar en 5% de CO2 y aire atmosférico a 37 ° C durante 5 h.

3. La tinción inmunocitoquímica

  1. Aspirar los medios de cultivo usando una pipeta de vidrio estéril unida a una línea de vacío y enjuague rápidamente cubreobjetos una vez mediante la adición de 1 ml de 0,1 M Tris Buffered Saline (TBS) (NaCl 154 mM, 16 mM Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) al pozo. Aspirar y añadir 2 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x Tampón fosfato salino (PBS). Incubar durante 15 min a TA.
  2. Aspirar y agregar 1 ml de TBS 0,1 M, a continuación, colocar en un agitador oscilante durante 2 min. Repetir 3 veces. Añadir 1 ml de solución (10% de suero de cabra, 10 mg / ml de BSA, 0,025% de Triton X-100 en 0,1 M TBS) de bloqueo y se incuba durante 30 min a 37 ° C en un agitador de balanceo.
  3. Aspirar solución de bloqueo y añadir anticuerpo-GFAP contra monoclonal primario de ratón (0,2 ml de una dilución 1: 500 en solución de bloqueo) y policlonal de conejo anti-S100B (1: 500) o policlonal de conejo anti-HIF1α (1: 200) durante 60 min a 37 ° C en un agitador de balanceo.
  4. Alternativamente, algunos astrocitos se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-Iba1 (1: 200) y ratón lunoclonal anti-MAP2 para acceder a la pureza del cultivo.
  5. Aspirar anticuerpo primario y enjuague cubreobjetos mediante la adición de 1 ml de 0,1 M TBS y colocar en un agitador de balanceo durante 2 min y luego aspirar. Repetir dos veces.
  6. Añadir 0,2 ml de una dilución 1: 200 de los anticuerpos anti-conejo conjugados 568 488-conjugados y anti-ratón de cabra secundario en solución de bloqueo durante 60 min a 37 ° C en un agitador de balanceo.
  7. Aspirar el anticuerpo secundario y enjuague cubreobjetos mediante la adición de 1 ml de 0,1 M TBS y se deposita en un agitador oscilante durante 2 min y luego aspirado. Repetir dos veces.
  8. Retire el cubreobjetos de bien y seca mediante la colocación en un portaobjetos situado sobre un portaobjetos de pelo. CUBREOBJETOS en una nueva diapositiva mediante la inversión en una sola gota de medio de montaje Vectashield Hardset con DAPI (1,5 ng / l).
  9. cubreobjetos de imagen en un microscopio confocal utilizando 20X petróleo objetivo seco o 60X. Adquirir imágenes (512 x 512) para DAPI (405 nm ex / em 450 nm) y 488 fluorocromo etiquetados anticuerpo GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Mantener constantes los parámetros de adquisición dentro de la 20X y 60X grupos.

4. Determinación del Sexo El uso de PCR

  1. dedo del pie perrito calor o recortes de los dedos a 95 ° C durante 45 minutos en NaOH 50 mM y se neutralizan con un volumen igual de Tris 1 M, pH 6,8.
  2. Añadir 1 l de la solución de ADN se extrajo a 19 l de la siguiente mezcla: 5 pmoles de cebadores para los genes MYOG y SRY, tampón de reacción 1x, 0,2 mM de cada uno de desoxinucleótido y 8 U Taq polimerasa.
  3. Utilizar secuencias de cebadores; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' y MYOG 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Realizar el siguiente protocolo de PCR: 95 ° C durante 3 min, a continuación 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, hibridación a 58 ° C durante 15 s, y elongación a 72 ° C durante 1 min. Después de estos 30 ciclos, la reacción concluye con una final de elongación a 72ºC durante 1 min.
  5. PC separadaProductos R electroforéticamente en un gel de agarosa con bromuro de etidio que contiene 2% y visualizar bajo iluminación UV. PRECAUCIÓN (Figura 2A.)! El bromuro de etidio es un carcinógeno potencial y debe ser manejado con cuidado y eliminarse adecuadamente según las regulaciones de la institución.

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Resultados

La comprensión de las funciones de las funciones de astrocitos sexado bajo condiciones fisiológicas o fisiopatológicas se han dilucidado inmensamente mediante el cultivo de estas células en condiciones in vitro. El aspecto importante de la realización de cultivo sexuado es determinar el sexo de la cría de ratón antes de su uso. Se determinó el sexo del ratón genéticamente por PCR y por la evaluación visual (Figura 2) 16. La metodología de determinació...

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Discusión

Con el fin de estudiar las diferencias de sexo en las propiedades y funciones de los astrocitos en condiciones fisiológicas y patológicas, la preparación de los astrocitos primarios sexado en cultivo celular es una herramienta importante que se utilice. En el presente estudio se presenta un altamente eficiente y un método reproducible a la cultura de una población homogénea altamente enriquecido de los astrocitos del hipocampo sexado de recién nacido (P0-P2) C57Bl / 6 (de tipo salvaje) o K19F (GFAP nulo) crías de ratón ...

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Divulgaciones

Ninguno de los autores han intereses en competencia o en conflicto.

Agradecimientos

Programa de Premios de Ciencias Clínicas y Traslacionales de NCATS UL1 TR0000427 y KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 al UW ICTR de NIH/NCATS y fondos del Centro Waisman (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 del NINDS (Cengiz P) y NIH P30 HD03352 (Centro Waisman), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Nos gustaría agradecer a Albee Messing, PhD, por proporcionarnos los ratones knockout GFAP.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medios de cultivo de astrocitos
DMEM, alto contenido de glucosaCellgro10-013-CV
Suero de caballoGibco26050-070Concentración final: 10%
Penicilina-estreptomicinacellgro 30-002-CIConcentración final: 1%
Clorhidrato de éster metílico de L-leucinaAldrichL1002-25GConcentración final: 5 mM
Solution para la digestión de tejidos cerebrales
HBSSLife Technologies14170-088
Tripsinacellgro25-050-CIConcentración final: 0.25%
Otros
70% (vol/vol) etanolRoth9065.2
Poly-D-Lisine (PDL) 12 mm cubreobjetos redondos Corning354087
Water SigmaW3500Grado de cultivo celular
PBScellgro21-040-CVGrado de cultivo celular
0.05% Tripsina-EDTA Tecnologías de la Vida25300-062
70 μ m Filtro de células estériles Fisher scientific22363548
3,5 cm Placa de PetriBD Falcon353001
15 mL Tubo FalconBD Falcon352096
50 mL Tubo FalconBD Falcon352070
Pinzas, finas Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
Pinzas, punta planaKLS Martin12-120-11
Tijeras quirúrgicas de 13 cmAesculapBC-140-R
Microscopio ConfocalNikonA1RSi 
CentrífugaEppendorf5805000.0175804R
Agitador orbitalThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
Anti-IBA1Wako019-19741Conejo monoclonal
Anti-MAP2SigmaM2320Ratón monoclonal
Anti-HIF1alphaabcamab179483Conejo monoclonal
Anti-S100BSigmaHPA015768Conejo policlonal
Anti-GFAP (cóctel)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Conejo IgG)Vector LabsPK-6101contiene 4 reactivos 
Cabra Anti Conejo Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
Cabra Anti Ratón Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004

Referencias

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