El objetivo de este protocolo es para describir un deficitaria y ganancia de función que el método es aplicable para identificar neogenin como un receptor de la etapa específica que lleva a trophectoderm y diferenciación masa celular interna de embriones de preimplantación ratón.
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Artículo de método
Deficitaria y en el enfoque de ganancia de función de investigar la célula destino temprano Determinantes de preimplantación embriones de ratón
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Resumen
Resumen
Las técnicas de silenciamiento y sobreexpresión génica son fundamentales para la identificación de genes implicados en el desarrollo embrionario. La modificación génica diana directa en embriones preimplantacionales proporciona un medio para estudiar los mecanismos subyacentes de los genes implicados, por ejemplo, en la diferenciación celular en el trofoectodermo (TE) y la masa celular interna (ICM). Aquí, describimos un protocolo que examina el papel de la neogenina como un receptor auténtico para la determinación inicial del destino celular en embriones de ratón preimplantacionales. En primer lugar, discutimos las manipulaciones experimentales que se utilizaron para producir ganancia y pérdida de la función de la neogenina mediante la microinyección de ADNc y shRNA de neogenina; la eficacia de este enfoque fue confirmada por una fuerte correlación entre los niveles de expresión por pares de la proteína fluorescente roja (RFP) o la proteína fluorescente verde (GFP) y la cuantificación inmunocitoquímica de la expresión de neogenina. En segundo lugar, la sobreexpresión de neogenina en embriones de ratón preimplantacionales conduce a un desarrollo normal de ICM, mientras que la eliminación de neogenina hace que la ICM se desarrolle de manera anormal, lo que implica que neogenina podría ser un receptor que transmite señales extracelulares para conducir a los blastómeros a destinos celulares tempranos. Dado el éxito de este protocolo detallado en la investigación de la función de un nuevo receptor específico de la etapa de desarrollo embrionario, proponemos que tiene el potencial de ayudar en la exploración e identificación de otros genes específicos de la etapa durante la embriogénesis.
Introducción
Preimplantación desarrollo embrionario se puede dividir en varias etapas distintas, desde el estadio de una célula a la mórula y blastocisto. Hay mucha evidencia que sugiere que la polaridad y señales posicionales juegan un papel en la determinación precoz del destino celular en el trophectoderm (TE) y la masa celular interna (ICM). Sin embargo, la naturaleza de las señales, la forma en que se transducen en señales celulares, y los contextos fisiológicos en el que dichas señales son capaces de iniciar la diferenciación de linaje de células no son conocidos. Estas células diferenciadas a continuación, se someten a la especialización, comenzando a asumir estructuras características y funciones necesarias para la formación del embrión propiamente dicho y el crecimiento de la placenta 1-3.
embriones de preimplantación son particularmente susceptibles a la manipulación por inyección directa de materiales genéticos modificados como siRNA o ADNc diana y por lo tanto pueden ser utilizados para estudiar moléculas diana específicas. Hay una creciente comprensión de que genéticaanálisis de los embriones de vertebrados es fundamental para avanzar en nuestra comprensión del desarrollo embrionario 4. introducción precisa de un gen de tipo salvaje o una forma mutante en un embrión en un contexto oportuna para llevar a cabo GAIN- o pérdida de la función del gen ha facilitado enormemente el estudio de los genes regulados por el desarrollo. Deficitaria y ganancia de función a través de la microinyección de materiales genéticos en embriones de mamíferos y no mamíferos primeros individuales es relativamente simple debido a su gran tamaño y gran receptividad 5. La microinyección se realiza típicamente usando vectores no virales. Particular se ha hecho uso de la facilidad de uso de vectores no virales sobre vectores virales y transgenes. Una deficitaria rápida o sistema de expresión de ganancia de función en embriones de ratón se ha desarrollado que nos permite diseccionar y entender las funciones de genes en la embriología de los vertebrados 6,7.
el marcaje fluorescente de embriones facilitaría en gran medida la selección de los microinjected o genéticamente embriones manipulados y al mismo tiempo conceder un medio para cuantificar indirectamente el nivel de expresión de siRNA o ADNc microinyección basada en la intensidad fluorescente 8. Para lograr esto etiquetado, ADNc de la proteína fluorescente, GFP o RFP, son co-inyectados ya sea como construcciones de fusión o por separado. La intensidad de fluorescencia de GFP o RFP revela el grado de expresión de siRNA o ADN extraño para asegurar que deficitarias o que se ha logrado ganancia de función.
A continuación, se presenta un protocolo para la micromanipulación técnica función deficitaria y la ganancia-de- que nos permitió identificar neogenin como un receptor que transmite señales extracelulares importantes en la diferenciación celular a principios de preimplantación de embriones de ratón.
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Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos para la cría de animales y de los cuidados se llevaron a cabo de acuerdo con los reglamentos de la Universidad de Sahmyook IACUC, Seúl, Corea del Sur.
1. La superovulación, Cría y aislamiento Oviducto
- Mantener ratones C57BL / 6 endogámicos bajo las siguientes condiciones: 22 ± 3 ° C, ~ 60% de humedad, 12 horas de luz / oscuridad ciclo, y agua y alimento ad libitum.
- Inducir la superovulación de ratones hembra de 3-5 semanas de edad, mediante una inyección intraperitoneal de 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) a 0.1 ml / cabeza seguido 48 horas más tarde por una inyección intraperitoneal de 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG) en 0,1 ml /cabeza.
- Inmediatamente después de la inyección de hCG, aparearse las hembras de superovulación inducida con machos sexualmente maduros de la misma cepa, manteniéndolos en la misma jaula durante la noche.
- A la mañana siguiente, confirman el éxito de apareamiento por la presencia de un conector macho de inserción o tapón vaginal en el tracto genital femenino.
- Sacrificar los ratones hembra embarazadapor CO 2 intoxicación seguido por dislocación cervical 18 a 20 horas después de la inyección de hCG.
- Abra la cavidad abdominal por el corte de la piel y luego la capa peritoneal con tijeras finas.
- Recoge los cuernos uterinos con unas pinzas finas y alejarse del útero, oviducto, ovario, y la almohadilla de grasa suavemente de la cavidad del cuerpo.
- Cortar el área entre el oviducto y el ovario con tijeras finas. Volver a colocar las pinzas y cortar el útero cerca del oviducto, dejando al menos 1 cm de la parte superior del útero adjunto.
- La transferencia de la ampolla del oviducto a una placa de Petri de 35 mm que contiene medio M16 a temperatura ambiente. Agrupar los oviductos de varios ratones en el mismo plato.
- Colocar las cápsulas en un estereomicroscopio para la recuperación de embriones.
2. Recuperación y Cultura de 2-pronuclear (2-PN) Los embriones
- Cortar el extremo de una aguja hipodérmica G 30 o 32, se muele en una punta roma, y utilizarlo como una aguja de lavado.
- Utilizarunas pinzas finas para deslizar el extremo del oviducto en la aguja de descarga. Presione suavemente la punta de la aguja de lavado contra el fondo del plato para mantenerlo en su lugar. Enjuague el oviducto con ~ 0,1 ml de medio M16 para liberar los embriones 2-PN en una placa de Petri.
- Recuperar los embriones 2-PN a lo largo de la zona de cúmulo masas del medio M16 enrojecida bajo el microscopio estereoscópico usando una pipeta de vidrio estéril y transferirlos a una nueva placa de Petri.
- Disociar las células del cumulus de los embriones de 2 PN por digestión enzimática con 1,0 ml de 0,1 hasta 0,5% de hialuronidasa en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) a 37 ° C durante 5 a 10 min.
- Despojar a los embriones con la pipeta suavemente con una pipeta de vidrio y la eliminación física de las células del cúmulo.
- Lavar embriones denudadas tres veces con 30-50 ml de solución salina fresca tamponada con fosfato (PBS) por embrión.
- Incubar los embriones en una placa de Petri de plástico de 35 mm en los medios de comunicación M16 suplementado con 10 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA, Fraction V) a 37 ° C en 5% de CO 2 en una incubadora humidificada hasta que se realiza la microinyección, que es por lo general menos de 4 horas más tarde.
3. Embriones de transcripción reversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
- Recoge al menos 10 embriones de cada etapa hasta la etapa de blastocisto y agruparlas en 4,0 l de 5x revertir disolución de la premezcla de la transcriptasa que contiene la transcriptasa inversa, inhibidor de RNasa, cebador oligo dT, 6mers azar, mezcla de dNTP, y el tampón de reacción en una tubo de PCR.
- Añadir agua destilada libre de RNasa 2 O hasta un volumen total de 20 l y sonicar los embriones agrupados durante 30 segundos a 200 W. iniciar la reacción de RT inmediatamente a 42 ° C durante 1 hora, seguido de 5 min de incubación a 95 ° C.
- Por cada 5,0 l de solución de ADNc generada, llevar a cabo la amplificación normal de PCR con cebadores para neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, secuencias de cebadores Oct3 / 4, o β-actina (dado en la tabla 1. PCR se compone de 40 ciclos de incubación de 15 segundos a 95 ° C, 30 segundos a temperatura de hibridación (se muestra en la Tabla 1), y 30 segundos a 72 ° C.
- Separar los productos de PCR por electroforesis en un gel de agarosa al 2% y visualizar el gel bajo luz UV después de la tinción con bromuro de etidio.
- Normalizar la expresión del gen diana contra los niveles de beta-actina.
4. La inmunocitoquímica de embriones
- Fijar embriones de cada etapa con 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 min a temperatura ambiente seguido de un breve lavado 3 veces con PBS que contenía 0,01% de BSA.
- membranas permeabilizar celular por incubación de 10 embriones en 1,0 ml de PBS que contenía 0,1% de Tween 20 y 0,1% Triton X-100 a temperatura ambiente durante 10 min.
- Para bloquear la unión no específica incubar los embriones permeabilizadas en 1.0 ml de PBS suplementado con suero de cabra normal al 10% durante 30 min a temperatura ambiente.
- Incubar el ingenio embriones bloqueadoh anticuerpos de conejo anti-neogenin en 1: 100 dilución en PBS que contenía 0,1% de BSA durante una noche a 4 ° C.
- Después de tres lavados de 30 segundos cada uno en gotas de PBS, se incuban los embriones ya sea con Alexa IgG de cabra anti-conejo 488-conjugado o Alexa 568 conjugada con IgG de cabra anti-conejo en una dilución 1: 500 en solución de PBS / BSA durante la noche a 4 ° C .
- Para visualizar los filamentos de actina, se incuban los embriones en 1 mg / ml faloidina en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Tinción de los núcleos mediante la adición de 5 ml de PBS que contenían 1 mg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro) por 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar los embriones tres veces brevemente con PBS.
- Transferir los embriones a un portaobjetos de vidrio y cubrirlas con una gota de aceite mineral.
- Tomar imágenes con un aumento de 1.000X con un microscopio confocal con una excitación de la longitud de onda apropiada.
5. Preparación de Neogenin-RFP y Neogenin-siRNA GFP plásmidos
- Subclon de ADNc que codifica neogenin ratón en una proteína roja fluorescente (RFP) que contienen vectores, lo que resulta en neogenin-bandera-RFP.
- Subclón pequeña horquilla de ARN de orientación neogenin en una proteína fluorescente verde esmeralda (EmGFP) que contienen vectores, lo que resulta en pcDNA-EmGFP-miR-neogenin (que se muestra en la Figura 1).
- Amplificar tanto neogenin-bandera-RFP y plásmidos pcDNA-EmGFP-miR-neogenin y purificar por métodos convencionales.
- Ajustar las concentraciones finales de plásmidos a ~ 1,0 g / ml en tampón estéril Tris-EDTA (TE).
6. La microinyección de plásmidos en 2-PN embriones
- Se lavan las 2-PN embriones desnudos una vez, brevemente, con los medios de comunicación M16 frescas.
- Centrifugar los embriones 2-PN para 10 min a 1.000 xg en una centrífuga de mesa para permitir la observación de los pronúcleos.
- Incubar los embriones en una gota micro de 20 a 30 l de medio M16 por embrión bajo aceite mineral a 37 ° C en 5% de CO2 durante un additional 1-2 horas.
- Fabricación pipetas de inyección y pipetas que llevan a cabo tirando tubos capilares de borosilicato de vidrio (OD = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) con un extractor mecánico.
- Fabricar pipetas de inyección de tener puntas romas y aberturas pulidas de <500 micras de longitud y el diámetro interior de punta punta micras 1-2 utilizando un microgrinder y un microforger.
- Fabrique la celebración de pipetas tal que tienen puntas romas y aberturas pulido con un diámetro interno de 20 micras y un diámetro exterior de 100 micras.
- pipetas de inyección de carga con una cantidad suficiente (> 200 nl) de solución de plásmido a 1,0 mg / l.
- Microinyectar ~ 10 pl de solución de plásmido para cada embrión 2-PN en uno de los pronúcleos utilizando un microinyector unido a un micromanipulador motorizado; durante este proceso, mantener los embriones en posición mediante la aplicación de presión negativa con una pipeta de sujeción.
- Después de la microinyección, lavar los embriones de 2 PN 3 veces con medio fresco para l M16ess de 1 minuto cada vez.
- La cultura de los embriones de 2 PN en una gota de medio M16 frescas en una placa de cultivo de plástico recubierto de una gota de aceite mineral para evitar la evaporación de los medios de comunicación.
- Observar los embriones a las 24 h en intervalos de un contraste de interferencia diferencial (DIC) microscopio invertido con un aumento de 200X.
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Resultados
Descubrimos que neogenin se expresa transitoriamente durante las etapas tempranas del desarrollo de embriones de preimplantación de ratón, que aparece tan pronto como en la etapa de 2 células y duradera hasta la mórula temprano, pero convertirse en deficiente en la tarde de mórula y blastocisto etapas (Figura 2A). Además, la distribución espacial de neogenin estaba restringida principalmente a células fuera. Los resultados del análisis RT-PCR fueron consistentes con la n...
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Discusión
En el presente protocolo, demostramos nuevos métodos de microinyección de materiales genéticos, ADNc o shRNA, en los embriones de 2 PN ratón para explorar el papel de neogenin en la diferenciación celular durante la embriogénesis temprana del ratón. La modificación genética de preimplantación de embriones es una técnica de gran alcance en el descubrimiento de información clave sobre los mecanismos subyacentes moleculares para, por ejemplo, la primera determinación del linaje celular. La modificación genética es uno de l...
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses en competencia de interés económico alguno.
Agradecimientos
Los autores también desean reconocer el grupo del Dr. Xiong en el Georgia Health Sciences University para la fabricación y distribución de los constructos de vectores de ADNc y neogenin shRNA. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Programa Básico de Investigación Científica (2013R1A1A4A01012572), financiado por la Fundación de Investigación de Corea y por una beca de investigación de la Universidad de Sahmyook.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| M16 | mediano,Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Suero de cabra, | Dako (Glostrup, Dinamarca) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holanda | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Aceite mineral | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| gonadotropina coriónica humana y gonadotropina sérica de yegua preñada | (Intervet, Holanda) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Transcriptasa inversa | lifetechnologies | 18080-044 | |
| Pre mezcla de PCR | ( Bioneer, Daejon, Corea del Sur) | GenDEPOT, A0224-050 | |
| Agarosa (grado molecular) | BioRad | 161-3101 | |
| Solución de paraformaldehído, 4% en PBS | Affymetrix EE. UU | 19943 | |
| anticuerpo policlonal anti-neogenina de conejo | Santa Cruz Biotechnology, EE. UU. | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 marcado anticuerpo anti-conejo | Sondas moleculares (Invitrogen, EE. UU.) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 marcado con anticuerpo anti-conejo | Sondas moleculares (Invitrogen, EE. UU.) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Sondas moleculares de faloidina | (Invitrogen, EE. UU.) | A34055 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato) | Invitrogen, EE. UU. | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&;D sistemas | 3720-RG | |
| todas las construcciones de plásmidos | Prof. Wen Cheng Xiong en la Universidad de Ciencias de la Salud de Georgia (Agusta, GA). | Por el momento, los estudios fueron amablemente proporcionados por | |
| Neón® Sistema de transfección | lifetech | MPK10096 | |
| Microscrope estéreo | Nikon | SMZ1000 | |
| Sistema de micromantenimiento con Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Inyector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Soporte | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Molino Narishige MF-900 | |
| Extractor Narishige | EG400 | ||
| Sutter | Instrumnet empresa | P-97 | |
| Incubadora >< CO2 | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® Termociclador de 384 pocillos | 4388444 | LifeTechnologies |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
