La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

Resumen

La actina filamentosa (F-actina) juega un papel importante en la espinogénesis, la plasticidad sináptica y la estabilidad sináptica. Por lo tanto, la cuantificación de los puntos de F-actina es una herramienta útil para estudiar la integridad de las estructuras sinápticas. Este protocolo describe los procedimientos de cuantificación de los puntos de F-actina marcados con faloidina en cultivos de neuronas corticales primarias de baja densidad.

Resumen

proteína actina filamentosa (F-actina) juega un papel importante en espinogénesis, la plasticidad sináptica, y la estabilidad sináptica. Los cambios en las estructuras dendríticas ricas F-actina sugieren alteraciones en la integridad y la conectividad sináptica. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el cultivo de neuronas corticales de rata primaria, tinción faloidina para puntos lagrimales F-actina, y técnicas de cuantificación posteriores. En primer lugar, la corteza frontal de embriones de rata E18 se disocia en cultivo de células de baja densidad, a continuación, las neuronas cultivadas in vitro durante al menos 12-14 días. Después del tratamiento experimental, las neuronas corticales se tiñeron con faloidina AlexaFluor 488 (para etiquetar los puntos lagrimales F-actina dendríticas) y la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2, para validar las células neuronales y la integridad dendríticas). Finalmente, el software especializado se utiliza para analizar y cuantificar las dendritas neuronales seleccionados al azar. F-actina estructuras ricas están identificados en las ramas dendríticas de segundo orden (rango de longitud y 25-75# 181; m) con inmunofluorescencia MAP2 continua. El protocolo presentado aquí será un método útil para la investigación de cambios en las estructuras de la sinapsis dendríticas posteriores a los tratamientos experimentales.

Introducción

El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método fiable de medida (estimación) de la integridad sináptica de la red dendrítica neuronal. A continuación se describe la cuantificación de los puntos lagrimales F-actina en la rata primaria neuronas cultivadas utilizando una combinación de tinción faloidina y detección inmunocitoquímica (CPI) de las dendritas con posterior análisis utilizando software especializado (NIS-Elements).

Falotoxinas etiquetados tienen afinidad similar para los filamentos tanto grandes como pequeñas (F-actina), pero no se unen a la actina monomérica globular (G-actina), a diferencia de algunos anticuerpos de actina ^1. La unión no específica de faloidina es despreciable, lo que proporciona el fondo de imagen mínima durante celular. Faloidina es mucho más pequeño que los anticuerpos que normalmente se utilizan para etiquetar proteínas celulares por microscopía de fluorescencia, que permite mucho más intensa etiquetado de F-actina por faloidina. Por lo tanto, a los detalles de la localización de F-actina en neuronas pueden serobtenido mediante el uso de faloidina marcada.

Faloidina (F-actina) tinción de dendritas neuronales discretas genera "puntos calientes" o "puntos lagrimales" brillante, que representan una variedad de estructuras dendríticas maduras, incluyendo las espinas, las sinapsis no espinosas ^{2 y} espinas inmaduras. Espinas inmaduras incluyen filopodios delgadas y algunas formas de la morfología de parches, y pueden representar el inicio de espinogénesis ^3. Espinas inmaduras y parches no espinosas carecen PSD95 ^4. Los cambios en la producción de plomo F-actina a los cambios posteriores en no sólo las espinas dendríticas, sino también estructuras adicionales, con lo que faloidina una herramienta importante para la investigación de la integridad synaptodendritic ^5-7. En general, el número de puntos lagrimales faloidina-positivo (F-actina) reflejan un equilibrio entre las sinapsis activas (excitatorias e inhibitorias), la dinámica de actina y la estabilidad sinapsis ^8.

Aunque es importante para estudiar t específicaipos de sinapsis (es decir, espinas dorsales excitatorios), cuando se desconoce el objetivo de un tratamiento, es necesario estimar primero la integridad general de una variedad de estructuras dendríticas. Desde F-actina es un componente principal de las espinas dendríticas y otras estructuras, incluyendo las sinapsis inhibidoras, un número alterado de puntos lagrimales F-actina puede indicar un synaptopathy. Este synaptopathy puede entonces investigarse más a fondo de las alteraciones más específicas. Nuestro método de cuantificación para la detección de múltiples tipos / estructuras sinápticas se obtiene una estimación global de las alteraciones sinápticas dendríticas (aumentos y disminuciones) después de varios tratamientos experimentales.

Protocolo

Todos los animales protocolos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de aseguramiento: A3049-01).

1. baja densidad cultivos neuronales embrionarias

1. Preparación para el cultivo de neuronas corticales primaria
   1. soluciones:
      1. Preparar poli-L-lisina solución madre disolviendo 5 mg de poli-L-lisina en 10 ml de tampón de borato.
      2. Preparar la solución de trabajo diluyendo 1 ml de poli-L-lisina en 49 ml de tampón borato.
      3. Preparar tampón borato, pH 8,4, comenzando con 395 ml de _H2O destilada y luego añadir todos los ingredientes (1,24 g de ácido bórico + 1,9 g de bórax). Ajustar el pH a 8,4 con NaOH 1 M. Ajuste a 400 ml y filtrar con un filtro de membrana de nylon de 0,2 micras bajo el capó.
      4. Preparar la solución de HBSS, pH 7,2, comenzando con 445 ml de _H2O destilada y añadir todos los demás ingredientes (50 ml 10X HBSS archivo + 1,2 g de HEPES). Ajustar el pH a 7,2 por N HCl 1, bring a 500 ml y filtrar con 0,2 micras filtro de membrana de nylon bajo el capó.
      5. Preparar medio en placa: DMEM / F12 con suero bovino fetal 10%. Filtro con 0,2 micras filtro de membrana de nylon bajo el capó.
      6. Preparar medio de crecimiento completo: Para 50 ml de medio Neurobasal, añadir los suplementos (500 l glutamax (100X) + 500 l Glucosa + 1 ml de B-27 (50X) + 500 l de solución de antibiótico-antimicótico (100X) + 100 l 7,5% El bicarbonato de sodio. filtro con 0,2 micras filtro de membrana de nylon bajo el capó.
   2. Dos días antes del cultivo:
      1. Escudo vidrio platos de fondo doce de 35 mm con 2 ml de solución de trabajo de poli-L-lisina, y mantener bajo el capó O / N.
   3. Un día antes de la cultura:
      1. Agente de recubrimiento de vacío de los platos y enjuagar con _ddH2O Permitir que los platos se sequen durante una hora bajo el capó.
      2. Preparar medio en placa (DMEM / F12 con suero bovino fetal al 10% (10% de la solución total). Pipeta 2 ml de medio encada plato, y se incuba O / N ^a 37 ° C, 5% de CO _2.
         Nota: Es importante evitar placas de cultivo de plástico cuando se cultiva. El uso de vidrio platos de fondo (para microscopios invertidos) o cubreobjetos de vidrio (para microscopios verticales) produce imágenes nítidas y claras. En comparación con un plato de plástico de fondo, el plato de fondo de vidrio evita reflejos no deseados o el deslumbramiento durante la microscopía fluorescente.
2. Protocolo de cultivo celular:
   1. Pon refrigerada HBSS Buffer (100-150 ml), platos de Petri de 100 mm, pinzas, tijeras, tubos de 50 ml, 15 ml y tubos bajo la luz UV en la campana.
   2. La eutanasia a ratas preñadas con la inhalación letal de 5% de sevoflurano bajo el capó fuera de la habitación de cultivo.
   3. Esterilizar con un 70% de EtOH, tienda de la piel del abdomen inferior utilizando fórceps durante el corte de la cola hacia arriba en el medio de cavity.Open abdominal del útero con unas tijeras para exponer la placenta.
   4. Retire 8-10 fetos E18. Place 8-10 fetos en placas de Petri que contienen solución de HBSS.
   5. Mantenga la parte posterior de la cabeza del feto con una pinza, a continuación, utilizar tijeras para cortar la cabeza del cuerpo. Colocarlo en otra placa de Petri llena con 5-7 ml de HBSS. Llevar la cápsula a la campana.
   6. Llenar dos placa de Petri de 100 mm adicional con HBSS frío.
   7. Pelar un lado del cráneo y cerebro en primicia una nueva placa de Petri llena de HBSS.
   8. El uso de fórceps curvos afilados, cerebelo y tronco cerebral separada del cerebro, a continuación, transferir cerebro a una nueva placa de Petri con HBSS fría en ella.
   9. Use pinzas para sujetar, separar los hemisferios con pinzas curvas. Retire las meninges; aislar la corteza frontal y piezas de transferencia en tubos de centrífuga de 15 ml marcados.
   10. Llenar el tubo 15 ml con 2 ml de HBSS fresco y añadir 20 l de tripsina EDTA (10x mezcla concentrada con 0,5% de tripsina y EDTA 5,3 mM.) A cada tubo de 15 ml.
   11. Incubar 10-15 min a TA. homogeneizar suavemente el tubo cada pocos minutos, no permitirá cancelar.
   12. after 10-15 minutos, el uso de pipetas de vidrio para eliminar edad HBSS y se enjuaga dos veces con HBSS nueva.
   13. Sumergir en inhibidor de tripsina (1 mg / ml, 2 mg de inhibidor de tripsina en 2 ml de HBSS), mezclar bien y dejar reposar 5 minutos. Lavar dos veces con HBSS fresco.
   14. Usando pipeta de vidrio con el bulbo de caucho, piezas cerebrales triturado en 10-15 veces muy lentamente a fin de evitar bubbles.Triturate de nuevo usando una pipeta calibrada y una punta estéril con un diámetro de la punta reduce muy lentamente hasta homogeneidad.
   15. Transferencia disoció las células a una densidad deseada para pre-preparadas placas de cultivo recubiertas (50 células / mm2). Incubar O / N ^a 37 ° C, 5% de CO2.
   16. Después de 24 horas, sustituya medio DMEM / F12 con medio libre de suero Neurobasal crecimiento completo recién hecho.
   17. Mantener las células en todo momento en un _CO2 / 95% incubador humidificado aire de la habitación 5% durante al menos 12-14 días antes de la experimentación. Suplemento las células cada 5-6 días con medio Neurobasal fresco sustitución de aproximadamente 50% de la edad media.

2. Marcaje fluorescente y inmunocitoquímica

Nota: El etiquetado de inmunofluorescencia de cultivos de células primarias corticales se llevó a cabo en placas de cultivo de vidrio de células de fondo 35 mm con un volumen de trabajo de 1 ml.

1. Lavar el plato con fondo de vidrio dos veces con solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4 (PBS).
2. Fijar las células con 4% de paraformaldehído durante 15 min a RT.
3. Lavar las células dos veces con PBS y se permeabilizan con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 5 min.
4. Tratar las células durante 20 min a RT con una tinción específica de F-actina, AlexaFluor 488 faloidina (1:40, 25 l de faloidina en 1 ml de PBS).
5. Enjuagar las células dos veces con PBS y bloquear con suero de cabra normal al 10% a temperatura ambiente durante 1-2 horas.
6. Diluir el anticuerpo policlonal de pollo anti-MAP2 (1: 2.500) en PBS con suero normal de cabra al 2% y se incuba O / N ^a 4 ° C.
7. Después de la incubación, enjuague en PBS dos veces.
8. Diluir el anticuerpo secundario (Alexa Red cabra 594 conjugado con IgG anti-pollo (1: 500) con suero de cabra normal al 2% y se incuba durante 2 horas a RT.
9. Enjuague con PBS y añadir 10 l / placa de tinte Hoescht.
10. Incubar 3 min a TA y se lava con PBS dos veces.
    Nota: Las células marcadas ya está listo para el paso 3 (F-actina conteo de puntos lagrimales).
11. Preservar muestra de células con 100 l de reactivo antifade como agente de cubreobjetos y mantenerse ^a 4 ° C en la oscuridad durante el almacenamiento a largo plazo.
    Nota: faloidina es relativamente estable en PBS a 4 ° C en la oscuridad durante hasta 1 semana y la fluorescencia puede ser conservado con Antifade reactivos cubrición. Sin embargo, las imágenes óptimas se obtienen a partir de 1-3 días después de la tinción desde faloidina puede empezar a difundirse fuera con un almacenamiento prolongado.

3. F-actina Conteo puntos lagrimales

1. Encienda el microscopio de fluorescencia y cambiar a 20 × objetivo. software de microscopio abierta, y estableció el programa de 1280 × 960 píxeles de tamaño de la imagen, y 0,1resolución de imagen / píxeles de 7 micras, con 1 × zoom.
2. Adquirir imágenes de co-etiquetado de actina F / neuronas MAP2 con bandera verde (495 nm) / rojo (613 nm) canales fluorescentes.
3. Elija 5 Green (F-actina) / rojo (MAP2) immunolabeled / azul (Hoescht) imágenes fluorescentes de neurona individual con árboles dendríticos claramente definidos.
4. Identificar las estructuras ricas F-actina en segundo orden segmento dendrítico (intervalo de longitudes de 25-75 micras) con inmunofluorescencia MAP2 continua.
5. Rotar la región seleccionada de imágenes a un nivel horizontal. Copiar y pegar como una nueva imagen.
6. Restar el fondo de imágenes, utilizando una serie de ajustes constantes para cada plato.
7. Contar el brillante F-actina puntos lagrimales verde y rastrear la longitud del segmento dendrítico seleccionada manualmente por observadores independientes entrenados. Exportar los datos a un archivo de hoja de cálculo.
8. Calcular la densidad dividiendo F-actina total de puntos lagrimales marcado (N) por la longitud (L) de la etiqueta MAP2 dendritas. expresas de datos como el número de F-acpuncta estaño por 10 m de dendrita
   Nota: puntos lagrimales (tamaño ≤1.5 m) de la fluorescencia F-actina con una intensidad máxima de al menos 50% por encima de la intensidad media de la tinción en el eje dendríticas fueron incluidos en cada segmento dendríticas seleccionado.

Resultados

En los presentes procedimientos, en primer lugar la cultura de rata neuronas corticales a baja densidad en placas con fondo de vidrio de 35 mm, la cual nos permite identificar las dendritas de las neuronas individuales. En la Figura 1, el contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes muestran los cambios morfológicos en el desarrollo de rata fetal neuronas corticales en los días 4, 6, 10, 14, 21 y 27 in vitro. Tenga en cuenta que la long...

Discusión

En este protocolo, se describe el cultivo de neuronas corticales de rata a baja densidad en placas con fondo de vidrio de 35 mm, que nos permite identificar las dendritas de las neuronas individuales. A continuación, utilizamos faloidina y tinción MAP2 para detectar cambios dendríticas. A continuación, se utilizó un software especializado para cuantificar los cambios en puntos lagrimales F-actina.

Para determinar los cambios en puntos lagrimales F-actina toda la red neuronal de una neurona i...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
35 mm Fondo de vidrio Platos Nº 1.5 cubreobjetos	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medio	Life Technologies	10565-018
Tripsina-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lisina	Sigma	P9155
Ácido bórico	Sigma	B0252
Bórax	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
Glucosa	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Medio Neurobasal	Life Technologies	21103-049
B-27 suplemento	Life Technologies	17504-044	50X
Antibiótico-Antimicótico solución	Cellgro	30004CI	100X
Bicarbonato de sodio	Life Technologies	25080
Tijeras Vannas	World Precision Instruments	500086
Mundo de Tijeras de Iris	Instrumentos de precisión	500216
Pinzas de iris	World Instrumentos de precisión	15914
Dumont #7 Pinzas	del mundo Instrumentos de precisión	14097
Dumont #5 Pinzas	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldehído	Sigma	P6148
Cubreobjetos	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Suero de caballo normal	Life Technologies	26050-070
Pollo policlonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594-conjugado cabra anti-pollo IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Tinción de células vivas ReadyProbes Reactivo Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
Paquete de software NIS-Elements	Nikon Instruments
TE2000-E microscopio fluorescente invertido controlado por ordenador	Instrumentos
0.2 μ m Nalgene filtro de membrana de nailon	Fishersci	151-4020