La actina filamentosa (F-actina) juega un papel importante en la espinogénesis, la plasticidad sináptica y la estabilidad sináptica. Por lo tanto, la cuantificación de los puntos de F-actina es una herramienta útil para estudiar la integridad de las estructuras sinápticas. Este protocolo describe los procedimientos de cuantificación de los puntos de F-actina marcados con faloidina en cultivos de neuronas corticales primarias de baja densidad.
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Artículo de método
La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata
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Resumen
Resumen
proteína actina filamentosa (F-actina) juega un papel importante en espinogénesis, la plasticidad sináptica, y la estabilidad sináptica. Los cambios en las estructuras dendríticas ricas F-actina sugieren alteraciones en la integridad y la conectividad sináptica. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el cultivo de neuronas corticales de rata primaria, tinción faloidina para puntos lagrimales F-actina, y técnicas de cuantificación posteriores. En primer lugar, la corteza frontal de embriones de rata E18 se disocia en cultivo de células de baja densidad, a continuación, las neuronas cultivadas in vitro durante al menos 12-14 días. Después del tratamiento experimental, las neuronas corticales se tiñeron con faloidina AlexaFluor 488 (para etiquetar los puntos lagrimales F-actina dendríticas) y la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2, para validar las células neuronales y la integridad dendríticas). Finalmente, el software especializado se utiliza para analizar y cuantificar las dendritas neuronales seleccionados al azar. F-actina estructuras ricas están identificados en las ramas dendríticas de segundo orden (rango de longitud y 25-75# 181; m) con inmunofluorescencia MAP2 continua. El protocolo presentado aquí será un método útil para la investigación de cambios en las estructuras de la sinapsis dendríticas posteriores a los tratamientos experimentales.
Introducción
El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método fiable de medida (estimación) de la integridad sináptica de la red dendrítica neuronal. A continuación se describe la cuantificación de los puntos lagrimales F-actina en la rata primaria neuronas cultivadas utilizando una combinación de tinción faloidina y detección inmunocitoquímica (CPI) de las dendritas con posterior análisis utilizando software especializado (NIS-Elements).
Falotoxinas etiquetados tienen afinidad similar para los filamentos tanto grandes como pequeñas (F-actina), pero no se unen a la actina monomérica globular (G-actina), a diferencia de algunos anticuerpo....
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Protocolo
Todos los animales protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de aseguramiento: A3049-01).
1. baja densidad cultivos neuronales embrionarias
- Preparación para el cultivo de neuronas corticales primaria
- soluciones:
- Preparar poli-L-lisina solución madre disolviendo 5 mg de poli-L-lisina en 10 ml de tampón de borato.
- Preparar la solución de trabajo diluyendo 1 ml de poli-L-lisina en 49 ml de tampón borato.
- Preparar tampón borato, pH 8,4, comenzando con 395 ml de H2O destilada y lu....
- soluciones:
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Resultados
En los presentes procedimientos, en primer lugar la cultura de rata neuronas corticales a baja densidad en placas con fondo de vidrio de 35 mm, la cual nos permite identificar las dendritas de las neuronas individuales. En la Figura 1, el contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes muestran los cambios morfológicos en el desarrollo de rata fetal neuronas corticales en los días 4, 6, 10, 14, 21 y 27 in vitro. Tenga en cuenta que la long.......
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Discusión
En este protocolo, se describe el cultivo de neuronas corticales de rata a baja densidad en placas con fondo de vidrio de 35 mm, que nos permite identificar las dendritas de las neuronas individuales. A continuación, utilizamos faloidina y tinción MAP2 para detectar cambios dendríticas. A continuación, se utilizó un software especializado para cuantificar los cambios en puntos lagrimales F-actina.
Para determinar los cambios en puntos lagrimales F-actina toda la red neuronal de una neurona i.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por las subvenciones de los NIH DA013137, DA031604 y HD043680. El apoyo parcial fue proporcionado por una beca de capacitación T32 de los NIH en ciencias biomédicas y del comportamiento.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 35 mm Fondo de vidrio Platos Nº 1.5 cubreobjetos | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medio | Life Technologies | 10565-018 | |
| Tripsina-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lisina | Sigma | P9155 | |
| Ácido bórico | Sigma | B0252 | |
| Bórax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucosa | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Medio Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 suplemento | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiótico-Antimicótico solución | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Bicarbonato de sodio | Life Technologies | 25080 | |
| Tijeras Vannas | World Precision Instruments | 500086 | |
| Mundo de Tijeras de Iris | Instrumentos de precisión | 500216 | |
| Pinzas de iris | World Instrumentos de precisión | 15914 | |
| Dumont #7 Pinzas | del mundo Instrumentos de precisión | 14097 | |
| Dumont #5 Pinzas | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | |
| Cubreobjetos | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Suero de caballo normal | Life Technologies | 26050-070 | |
| Pollo policlonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugado cabra anti-pollo IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Tinción de células vivas ReadyProbes Reactivo Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| Paquete de software NIS-Elements | Nikon Instruments | ||
| TE2000-E microscopio fluorescente invertido controlado por ordenador | Instrumentos | ||
| 0.2 μ m Nalgene filtro de membrana de nailon | Fishersci | 151-4020 |
Referencias
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-a....
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Reimpresiones y permisos
