En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O 2 .- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas
En este artículo
Resumen
Resumen
óxido nítrico derivado del endotelio (NO) producido a partir del endotelio NO-sintasa (eNOS) es una de las moléculas vasoprotective más importantes en la fisiología cardiovascular. Disfuncional eNOS como desacoplamiento de eNOS conduce a la disminución en la biodisponibilidad de NO y el aumento de anión superóxido (O 2 .-) de producción, y a su vez promueve las enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, la medición apropiada de NO y O 2 .- niveles en las células endoteliales son fundamentales para la investigación sobre las enfermedades cardiovasculares y las complicaciones. Debido a la naturaleza extremadamente lábil de NO y O 2 .-, es difícil medir el NO y O 2 .- directamente en un vaso sanguíneo. Numerosos métodos se han desarrollado para medir el NO y O 2 .- producción. Es, sin embargo, ya sea insensible, o no específicas, o técnicamente exigente y requiere un equipo especial. A continuación se describe una adaptacióndel método de colorante de fluorescencia para la detección simultánea en face y visualización de intracelular NO y O 2 .- utilizando la celda permeable diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE), respectivamente, en aortas intactos de un modelo de obesidad inducida ratón por la alimentación alta en grasas de la dieta. Hemos podido demostrar una disminución intracelular NO y O 2 .- mejorado los niveles en las aortas intactas recién aisladas de ratón de la obesidad, en comparación con el ratón magra control. Se demuestra que este método es una técnica fácil para la detección directa y la visualización de NO y O 2 .- en los vasos sanguíneos intactos y se puede aplicar ampliamente para la investigación de la función endotelial (dys) en (fisio) condiciones patológicas.
Introducción
Las células endoteliales vasculares mantienen la integridad funcional y estructural vascular por la liberación de factores vasoactivos 1. Entre estos factores, el óxido nítrico derivado del endotelio (NO) producido a partir de L-arginina a través endotelial NO-sintasa (eNOS) es el factor más importante y mejor caracterizado en la fisiología cardiovascular 2. NO causa la relajación del músculo liso e inhibe la proliferación celular, inhibe la agregación plaquetaria y la adhesión celular y la infiltración inflamatoria en el espacio subendotelial, por lo tanto, la protección contra el desarrollo de enfermedad vascular 3. Bajo muchas cond....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
los animales de trabajo fue aprobado por el Comité Ético de la Oficina Veterinaria de Friburgo, Suiza. El protocolo sigue las directrices sobre cuidado de los animales y la experimentación en nuestra institución.
1. Preparación de una puesta a punto para la incubación de las arterias aislada
- Construir un sistema de baño de órganos que puede ser calentado a 37 ° C y se aireó con 95% O 2 y 5% de CO 2 de un tanque de gas de carbono.
- Preparar como mucho tampón de bicarbonato Krebs-Ringer según sea necesario con la concentración de la composición siguiente: (NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, 2,5 mM CaCl 2....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La obesidad es un importante factor de riesgo de enfermedad coronaria isquémica y se asocia con una disminución de la biodisponibilidad de NO endotelial, una característica de la enfermedad vascular aterosclerótica 21. eNOS-desacoplamiento ha demostrado ser un importante mecanismo de la disfunción endotelial bajo numerosas condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo el envejecimiento 22, la aterosclerosis y la obesidad 14. Por lo tanto, aquí se com.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Detección de NO o O 2 .- con tintes fluorescentes se utiliza con frecuencia en muchos estudios en cultivos de células endoteliales y también en criosecciones de tejido 23. Aquí hemos extendido este método a los vasos sanguíneos de vida intacta, es decir, en la detección de rostros de NO y O 2 .- niveles en la capa endotelial con DAF-2DA y DHE, respectivamente, que sea eficaz, relativamente simple y intuitiva. En comparación con el método e.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (310030_141070/1), la Fundación Suiza del Corazón y el Centro Nacional de Competencia en Investigación (NCCR-Kidney.CH) Suiza. Yu Yi cuenta con el apoyo del Consejo Chino de Becas.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dihidroetidio (DHE) | Invitrogen | D 1168 | se disuelve con DMSO a 5 mmol/L como 1.000x stock, almacenado a -20 ° C |
| Diacetato de diamininofluoresceína-2 (DAF-2DA) | Calbiochem | 251505 | disolver con DMSO a 5 mmol/L como 1.000x stock, almacenado a -20 ° C |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | se disuelve con agua a 300 y micro; mol/L como 1.000x stock, almacenado a 4 ° C |
| Medio de montaje | Mano de obra vectorial. (ReactoLab) | H-1000 | |
| Nω -Nitro-L-arginina clorhidrato de éster metílico (L-NAME) | Sigma-aldrich | N5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Microscopio danés Myo Technology A/ | S modelo 610M | |
| Microscopio | Nikon | SMZ800 | |
| Leica | DM6000 | ||
| Software de procesamiento de imágenes | National Institute of Health (NIH) | Image J | |
| Tijeras quirúrgicas | S& T AG | SDC-11 | |
| Tijeras microquirúrgicas | F.S.T | 15000-01 | |
| Pinzas | S& T AG | JF-5 | |
| Cubreobjetos redondo diámetro 15 mm | VWR | 631-1579 | |
| Puntas 1 ml | VWR | RFL-1200c | |
| Consejos 200 μ l | VWR | 613.0659 | |
| Eppendorf Tubos Safe-Lock 1,5 ml | Eppendorf | ||
| Cloruro de acetilcolina | Sigma-aldrich | A-6625 |
Referencias
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149(2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
