Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3

11.9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/53723

⸱

24 de enero de 2016

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un procedimiento que permite un análisis detallado de la activación dependiente de la fosforilación del factor de transcripción IRF3. Esto se logra mediante la combinación de un SDS-PAGE de alta resolución y un PAGE nativo acoplado a inmunoblots utilizando múltiples anticuerpos fosfoespecíficos.

Resumen

El factor de transcripción IRF3 es crítico para la primera línea de defensa contra patógenos, principalmente a través de la expresión de genes de interferón β y antivirales. Un análisis detallado de la activación de IRF3 es esencial para comprender cómo los patógenos inducen o evaden la respuesta antiviral innata. Las distintas formas activadas de IRF3 se pueden distinguir en función de su fosforilación y el estado del monómero frente al dímero. La discriminación in vivo entre las diferentes especies activadas de IRF3 se puede lograr mediante la separación de formas fosforiladas de IRF3 en función de sus cambios de movilidad en SDS-PAGE. Además, los niveles de monómero y dímero IRF3 se pueden controlar mediante electroforesis no desnaturalizante. Aquí, detallamos un procedimiento para alcanzar la resolución más alta para obtener la mayor cantidad de información sobre el estado de activación de IRF3. Esto se logra mediante la combinación de un SDS-PAGE de alta resolución y un PAGE nativo acoplado a inmunoblots utilizando múltiples anticuerpos totales y fosfoespecíficos. Esta estrategia experimental constituye un enfoque asequible y sensible para adquirir toda la información necesaria para un análisis completo de la activación mediada por fosforilación de IRF3.

Introducción

El factor de transcripción expresado doquier y constitutivamente interferón (IFN) Factor de Regulación 3 (IRF3) es fundamental para la primera línea de defensa contra los patógenos, principalmente a través de la inducción de IFNß, pero también a través de la inducción de la quimiocina (motivo CC) ligando 5 (CCL5 ) y varias proteínas antivirales incluyendo la proteína inducida por IFN con tetratricopeptide repite IFIT1 / 2/3 a 1-3. Activación IRF3 ha sido reportado después de la infección con numerosos virus, o la exposición a ácido poliinosínico policitidílico (poli I: C) o lipopolisacárido (LPS) 4. Es importante destacar que los virus más estudiadas han desarrollado mecanismos para evadir la respuesta mediada por IRF3, y por lo tanto escapar de la defensa inmune innata 5 host. Por lo tanto, el seguimiento de la activación IRF3 es de gran importancia para comprender los mecanismos moleculares de la defensa del huésped antiviral innata, sino también para identificar la estrategia usada por los virus para contrarrestar esta respuesta.

ent "> Muchos informes publicados sin embargo proporcionan sólo un análisis limitado de la activación IRF3 realizado por el seguimiento de la inducción de genes IRF3-objetivo (IFNB1 y IFIT1) y / o ensayo de gen informador de luciferasa acoplado a electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de baja resolución de sodio (SDS- PAGE) análisis de IRF3. Sin embargo, numerosos estudios bioquímicos, el análisis del comportamiento de los diversos mutantes IRF3 y elucidación de la estructura cristalina IRF3 6 a 11 han contribuido a establecer que IRF3 se somete a un complejo conjunto de modificaciones post-traduccionales secuenciales por fosforilación en múltiples sitios. El conjunto de fosforilación implicado en la activación IRF3 parece ser dependiente del estímulo y lo más probable en el tipo de célula. En las células no infectadas, IRF3 coexiste como especies no fosforilados y hypophosphorylated que contiene phosphoresidues, incluyendo Thr135 y Ser173, en el 1 -198 aa región N-terminal 6,12-14. La acumulación de este f hipofosforiladaorm de IRF3 es inducida por inductores de estrés, factores de crecimiento y agentes que dañan el ADN 6. La fosforilación de residuos de Ser / Thr en la región C-terminal de IRF3 que contiene el dominio de transactivación se desencadena después de la activación por virus, poli I: C o LPS en un tipo de célula de manera dependiente 15-17 de. Fosforilación C-terminal de IRF3 implica no menos de 7 sitios phosphoacceptor distintos organizados en dos grupos principales, Ser385 / Ser386 y Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, que cada contribuir a la activación IRF3 a través de la dimerización, la acumulación nuclear, asociación con la CREB -la proteína de unión (CBP) / coactivadores p300, la unión a IFN elemento de respuesta sensible (ISRE) secuencias consenso y transactivación de los genes diana 9,10,17-19 ADN. La fosforilación de Thr390 también se cree que contribuyen a la activación inducida por el virus IRF3-20. Los análisis de espectrometría de masas de IRF3 han demostrado que los residuos Ser386, Thr390, Ser396 y Ser402 son directamente phosphorylatcado por el inhibidor de quinasa kappa B ε (IKKε) / unión TANQUE-quinasa 1 (TBK1) quinasas 9,10. La fosforilación en los residuos C-terminal también es necesaria para la terminación de la activación a través de IRF3 polyubiquitination y la degradación mediada por proteasoma-10. Este proceso es también dependiente de la fosforilación en Ser339, que es necesaria para la contratación de la isomerasa Pin1 propilo 10,11. Especies IRF3 que contienen al menos fosfo-Ser339 / 386/396 residuos se consideran formas hiperfosforilada. La secuencia exacta y la función de cada sitio sigue siendo un tema de discusión 10,21. Ahora está claro que IRF3 activado no representa un estado homogéneo, pero existe esa especie activados diferentes expositoras de fosforilación o dimerización características distintas 10,22.

Para proporcionar una comprensión completa de la activación IRF3 en respuesta a patógenos específicos, lo que es necesario a characterize cuál de las especies activadas son inducidos. La inducción de genes diana IRF3, IFNB1 y IFIT1, ha demostrado proporcionar una lectura fiable para la activación IRF3. Sin embargo, el seguimiento expresión de estos genes no distingue entre los diferentes estados de activación de IRF3. Un análisis completo de estados de activación IRF3 en un ambiente particular, se basa en la caracterización detallada de su fosforilación y dimerización estado 10. No fosforilada (formulario I), hypophosphorylated (forma II) y hiperfosforilada (formas III y IV) formas IRF3 6,18,23 se puede resolver con éxito por la movilidad reducida en alta resolución de análisis de SDS-PAGE. Especies monoméricas y diméricas IRF3 se pueden identificar de manera eficiente por análisis de PAGE nativa. Estos enfoques se mejoran en gran medida cuando se utiliza en combinación con anticuerpos fosfoespecíficos dirigidos contra sitios phosphoacceptor IRF3 distintas.

Protocolos estándar permiten una pobre resolución deproteínas que no permite la separación eficiente de los distintos IRF3 formas fosforiladas. Aquí se describe en detalle un procedimiento para lograr la más alta resolución para monitorizar la inducción de especies IRF3 virus activado por distintos utilizando SDS-PAGE acoplado a-PAGE nativa en combinación con inmunoblot utilizando anticuerpos totales y fosfoespecíficos. In vivo discriminación entre las diferentes activado formas de IRF3 se realiza sobre la base de sus turnos de movilidad observados en SDS-PAGE. Además, IRF3 monómero y el dímero se pueden distinguir por electroforesis no desnaturalizantes. La combinación de estas dos técnicas complementarias con inmunoblot resulta ser un enfoque accesible y sensible a adquirir toda la información necesaria para un análisis completo de la activación de la fosforilación mediada por IRF3.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

NOTA: El protocolo se describe aquí usando células A549 infectadas con el virus Sendai (VSe). Sin embargo, el protocolo para SDS-PAGE y PAGE nativa también trabaja con todos los tipos de células humanas y murinas probado hasta ahora, en particular células mieloides estimuladas con diferentes 9,15,19,24,25 estímulos IRF3 activador.

1. Infección de células A549

  1. Mantener las células A549 en cultivo en una placa de 15 cm a 37 ° C / 5% de CO 2 en 20 ml F12K medio / Ham que contenía 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (HI-FBS) y 1% de L-glutamina (F12K completa / Jamón medio).
    NOTA: Todas las soluciones utilizadas para la cultura y los tratamientos de células deben ser estériles.
  2. A las 24 h antes de la infección, aspirar el medio y se lavan las células con 10 ml de agua destilada salina tamponada con fosfato (D-PBS) a TA.
  3. Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA 0,25% a cada placa para cubrir las células y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
  4. Detener la incubación tan pronto como sea ªcélulas electrónicos empiezan a desprenderse de la placa tocando suavemente la placa con una mano. Inactivar la tripsina mediante la adición de 10 ml de medio F12K / jamón completa pre-calentado por placa y transferir las células a un tubo cónico de 15 ml.
  5. Centrifugar a 350 xg durante 3 min a TA. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 8 ml de medio F12K / jamón completa para obtener una suspensión de células individuales homogénea.
  6. Contar las células utilizando un hemocitómetro. Semilla las células a una densidad de 1 x 10 6 células por placa de 60 mm en 4 ml de F12K medio / Jamón precalentado completa. Incubar durante 20 a 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2. Después de 20 a 24 h, las células forman una monocapa confluente 90% (lo que corresponde a 1,5 x 10 6 células).
  7. Retire el medio y se lavan las células con 2 ml de F12K libre de suero / medio Jamón (SFM). Añadir 2 ml de SFM fresco por placa de 60 mm.
  8. Descongelar una alícuota de virus Sendai (SEV) (almacenado en alícuotas a -80 ° C) en el hielo y agitar brevemente.
  9. Diluir ªe virus en precalentado SFM para obtener 60 HAU / 100 l. Mezclar pipeteando arriba y abajo suavemente y añadir 100 l de virus diluido por placa para realizar la infección en 40 HAU / 10 6 células. No agregue virus en la placa de control no infectado.
  10. Se incuban las células en la incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2. Agitar las placas a mano 3 o 4 veces, o utilizando un agitador orbital o balanceo automático colocado directamente en la incubadora, durante la primera hora de la infección.
  11. A las 2 horas después de la infección, añadir 2 ml de medio F12K / Ham que contenía 20% HI-FBS para obtener una concentración final de 10% HI-FBS.
  12. Se incuban las células en la incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 1, 4 y 7 horas para llegar a los tiempos totales de infección de 3, 6 y 9 horas, respectivamente. En cada uno de estos puntos de tiempo, vaya al paso 2.1.

2. Preparación de extractos de células enteras (EBB)

  1. Retire el medio de infección. Recoger las células por raspado en 1 mlde helado D-PBS y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 1,5 ml pre-enfriada.
  2. Sedimentar las células por centrifugación a 16.000 xg a 4 ° C durante 20 segundos y decantar cuidadosamente todos los restos de D-PBS.
    NOTA: En este paso, el sedimento celular puede estar directamente sometió a una extracción de proteínas o-flash congelado en nitrógeno líquido o baño de hielo / etanol seco y se almacenaron a -80 ° C hasta que la lisis.
  3. Preparar el tampón de lisis que contiene 50 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 10% de glicerol y 1% Nonidet P-40 en agua desionizada (ddH 2 O). Añadir extemporáneamente proteasa (1 mg / ml de leupeptina y / ml de aprotinina 2 g) inhibidores de la fosfatasa y (fluoruro de sodio 5 mM, 1 mM activa ortovanadato de sodio, 2 mM p-nitrofenil fosfato y 10 mM β-glicerofosfato pH 7,5).
    NOTA: El tampón de lisis sin inhibidores se puede almacenar a 4 ° C. Un protocolo específico para la activación de ortovanadato de sodio se describe en la Tabla de reactivos específicos / EquipmeNuevo Testamento.
  4. Resuspender el sedimento celular en 70 l de tampón de lisis. Típicamente la concentración lisado será de alrededor de 2 mg / l.
  5. Incubar en hielo durante 20 min. Flash congelar el lisado por incubación en un baño de nitrógeno líquido durante 15 seg. Descongele el lisado a temperatura ambiente hasta que se derrita por completo y agitar durante 10 segundos. Repita el deshielo ciclo de congelación / / vórtice 3 veces.
    1. Alternativamente, lleve a cabo la etapa de congelación en un / baño de hielo seco de etanol durante 1 min.
  6. Centrifugar a 16.000 xga 4 ° C durante 20 min. Transferir el sobrenadante (correspondiente a la WCE) a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml pre-enfriada. Mantenga el EBB en hielo en todo momento.
  7. Cuantificar proteínas utilizando cualquier procedimiento de cuantificación de proteínas compatible con el tampón de lisis tal como a base de Bradford ensayo de proteínas 26.

3. Resolución del EBB por Alta Resolución SDS-PAGE

  1. Prepare tres desnaturalización geles de electroforesis.
    1. Para la detección deFormas IRF3, vierta dos geles de un mínimo de 16 cm de longitud con un gel de separación compuesta de 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS ), persulfato de 1% de amonio y 0,1% TEMED en ddH 2 O y un gel de apilamiento compuesta de 4% de acrilamida, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, persulfato de amonio 1% y 0,1% TEMED en ddH 2 O.
      ¡Precaución! La acrilamida, TEMED y SDS son tóxicos y / o irritantes. Use guantes de protección y manipular bajo una campana de humos.
    2. Para la detección de las proteínas SeV, vierta una gel de un mínimo de 8,5 cm de longitud con características similares al gel se describe en 3.1.1, excepto que el gel de separación contiene 12% de acrilamida.
  2. Desnaturalizar la WCE obtenido en la etapa 2.6 mediante la adición de 1: 4 (v / v) de tampón 5x de carga (Tris-HCl 125 mM pH 6,8 (RT), 10% de SDS, 20% (v /) de glicerol p, 0,0005% de azul de bromofenol y 25% β-mercaptoetanol en ddH 2 O) seguido de calentamiento a 100 °C durante 10 min. Vuelta rápida de los tubos para reducir la condensación que se forma en la tapa.
    ¡Precaución! β-mercaptoetanol es tóxico por inhalación. Use guantes de protección y manipular bajo una campana de humos.
  3. Montar los geles en el aparato de la migración. Llenar las cámaras superior e inferior con el funcionamiento de tampón que contiene 25 mM Tris-base, 0,1% SDS y glicina 192 mM en agua destilada (dH 2 O).
  4. Cargar 14 l de patrón de peso molecular en un pocillo de cada gel 16 cm y 7 l de patrón de peso molecular en un pocillo del gel 8,5 cm. Cargar 30 g de WCE desnaturalizado (preparado como se describe en el paso 3.2) por pocillo de los dos geles preparados en la etapa 3.1.1 para la detección de formas IRF3. Carga de 8 - 10 g de WCE desnaturalizado (preparado como se describe en el paso 3.2) por pocillo en el gel preparado en la etapa 3.1.2 para el análisis de SeV.
  5. Ejecutar los geles a 30 mA de corriente constante hasta que el frente de migración alcanza la parte inferior del gel.
    NOTA: La migración suele durar approximately 3 h para un gel de 16 cm y 45 min para un gel de 8,5 cm.
  6. Proceder a la transferencia a membranas de nitrocelulosa (paso 5).

4. Análisis de IRF3 Dimerización por Native PAGE

NOTA: Este método fue descrito originalmente por el grupo del Dr. T. Fujita 27.

  1. Preparar los superiores (-) e inferior (+) tampones de electroforesis cámara. El tampón de cámara superior consta de 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), glicina 192 mM y 1% desoxicolato de sodio (DOC) en ddH 2 O. El tampón de cámara inferior contiene 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) y 192 mM glicina en ddH 2 O.
    NOTA: Los tampones superior e inferior de la cámara de electroforesis se pueden almacenar a 4 ° C hasta su uso. Sin embargo, asegúrese de que están pre-calentado a temperatura ambiente antes de realizar la electroforesis.
  2. Verter un gel no desnaturalizante de resolución de un mínimo de 8,5 cm de longitud que contiene 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% municiónpersulfato nio y 0,1% TEMED en ddH 2 O.
  3. Pre-correr el gel a 40 mA de corriente constante durante 30 minutos en hielo. Pulse el aparato en funcionamiento en el hielo aproximadamente al nivel del tampón de electroforesis cámara baja. Es importante que el gel no está en el hielo.
  4. Durante la pre-carrera, mezclar WCE mantuvo en hielo con 2x-PAGE nativa tampón de carga 1: 1 (v / v) que contiene 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% de glicerol y 0,1% de azul de bromofenol en ddH 2 O.
  5. Carga de 8 - 10 g WCE (preparado como se describe en el paso 4.4) inmediatamente al final de la pre-carrera.
  6. Correr el gel a 25 mA de corriente constante en el hielo, como se describe anteriormente para la pre-carrera, hasta que el frente de migración alcanza la parte inferior del gel (aproximadamente 40 min).

5. Análisis de inmunotransferencia IRF3 Especies

  1. Preparar el tampón de transferencia que contiene 25 mM Tris-Base y glicina 192 mM en ddH 2 O. Refrigere el tampón de transferencia a 4 ° C antes de su uso.
  2. Seco tres piezas de membrana de nitrocelulosa cortan a un tamaño ligeramente mayor que los geles en una caja de plástico / vidrio que contiene el tampón de transferencia. Indicar la orientación de la membrana mediante la reducción de una esquina. El tampón de transferencia puede ser reutilizado 3 veces. Almacene el tampón a 4 ° C entre usos.
  3. Uncast los geles (SDS-PAGE y-PAGE nativa) y cortar una esquina de cada gel para la orientación adecuada.
    1. Para-PAGE nativa, incubar el gel a temperatura ambiente con agitación suave durante al menos 30 min en el tampón de SDS-PAGE corriente para eliminar el DOC antes de transferir a la memoria tampón de transferencia.
  4. Incubar los geles (SDS-PAGE y-PAGE nativa) en el tampón de transferencia durante 5 - 10 min.
  5. Montar un sándwich de transferencia por gel en un casete de transferencia con la membrana hacia el electrodo positivo (papel pista / filtro de espuma / membrana / gel / filtro de papel / almohadilla de espuma). Tenga cuidado de eliminar todas las burbujas entre las capas del sandwich.
  6. Realizar la transferencia como se recomienda by el fabricante para el aparato de transferencia utilizado.
    NOTA: Realice todas las incubaciones y lavados en los próximos pasos sobre una plataforma de agitación oscilante u orbital.
  7. Al final del tiempo de transferencia, las membranas se incuban durante 15 min en la solución de fijación que contienen ácido acético 7%, etanol al 40% y 3% de glicerol en ddH 2 O. Lave las membranas 3x 5 min en PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 y 1,8 mM KH 2 PO 4 en dH 2 O).
    ¡Precaución! El ácido acético es tóxico, irritante e inflamable. Use guantes de protección y manipular bajo la campana de humos.
    NOTA: La solución de fijación se puede reutilizar varias veces.
  8. Para la membrana-PAGE nativa vaya directamente al paso 5.11.
  9. Enjuagar las tres membranas SDS-PAGE rápidamente en dH 2 O antes de incubarlos durante 1 min en solución Ponceau roja que contiene 6,57 mM rojo Ponceau y ácido acético al 1% en ddH 2 O.
    NOTA: La solución ponceau rojo puede ser r eused varias veces.
  10. Enjuague las membranas en dH 2 O hasta que el fondo es lo suficientemente blanca para ver las bandas de proteínas teñidas de rojo. Tenga en cuenta los marcadores con un lápiz y cortar el exceso de membrana que rodea las proteínas. Destain las membranas mediante incubación durante 5 min en PBS con agitación.
  11. Se incuban las membranas durante 1 hora a RT o O / N a 4 ° C en la solución de bloqueo (PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y la leche en polvo al 5% sin grasa (PBS-T-leche). Lavar las membranas 3x 5 min en PBS-T.
    NOTA: El lavado PBS-T es opcional y sólo estrictamente necesario al aplicar anticuerpos diluidos en PBS-T que contiene 5% de albúmina de suero bovino (PBS-T-BSA) (Figura 1 y Tabla 1) en el próximo paso.
  12. Incubar las cuatro membranas (desde SDS-PAGE y-PAGE nativa) con los anticuerpos primarios de acuerdo con el orden secuencial detalla en la Figura 1 y en la Tabla 1. Realizar 5x 5 min lavados en PBS-T.
"> figure-protocol-1
Figura 1. Secuencia de análisis inmunoblot. El esquema describe los geles de SDS-PAGE y-PAGE nativa individuales requeridas para detectar las diversas formas fosforiladas y monoméricos / dimérica IRF3. El orden específico de anticuerpos aplicadas a la membrana resultante de cada gel en el procedimiento de inmunotransferencia se describe. Tenga en cuenta que los anticuerpos anti-actina se utilizó por primera vez para asegurar la igualdad de carga de las muestras antes de aplicar cualquier otra anticuerpos específicos. La secuencia alterna, con anticuerpos anti-actina se aplica después de los anticuerpos anti-fosfo-IRF3, también funciona. Stripping se utiliza entre anti-actina y anticuerpos anti-SEV o entre anticuerpos anti-IRF3 debido a las dimensiones de las señales superpuestas anti-fosfo-IRF3 y. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los anticuerpos primarios Dilución Tampón de dilución Incubación Los anticuerpos secundarios Comentarios
Anti-actina 1 / 10.000 PBS-T-BSA 15 min a RT Anti-ratón Utilizar después de SDS-PAGE
Antibodyies diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica.
Anti-IRF3-P-Ser386 1/200 PBS-T-BSA O / N a 4 ° C Anti-conejo Utilizar después Nativo-PAGE.
No se recomienda volver a utilizar el anticuerpo diluido
Anti-IRF3-P-Ser396 1 / 10.000 PBS-T-BSA O / N a 4 ° C Anti-conejo Utilice después de SDS-PAGE.
No se recomienda volver a utilizar el diluyó anticuerpo anti-IRF3-P-396 también está disponible de señalización celular. Dilución óptima se definió como 1 / 1.000 para este anticuerpo, pero puede variar entre los lotes.
Anti-IRF3-P-Ser398 1 / 10.000 PBS-T-BSA O / N a 4 ° C Anti-conejo Utilice después de SDS-PAGE. No se recomienda volver a utilizar el anticuerpo diluido
Longitud completa anti-IRF3 1 / 7.500 PBS-T-leche 3 h a RT Anti-conejo Utilice después de SDS-PAGE. El anticuerpo anti-IRF3 de longitud completa se puede utilizar después-PAGE nativa, pero es menos sensible para detectar el monómero. Anticuerpos diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica.
Anti-IRF3-NES 0,5 g / ml PBS-T-leche 3 h a RT Anti-conejo Utilizar después Nativo-PAGE. Antibodyies diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica.
Anti-SEV 1 / 14.000 PBS-T-BSA 3 h a RT Anti-conejo Utilice después de SDS-PAGE. Antibodyies diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica.
NOTA: Dilución y tampón utilizado para anticuerpos secundarios acoplados a HRP necesitan ser optimizado, ya que varía de una compañía a la otra.

Tabla 1. Especificaciones de los anticuerpos utilizados en el procedimiento de inmunotransferencia.

  1. Se incuban las membranas con la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios como se detalla en la Figura 1 y en la Tabla 1. Lavar las membranas 5x 5 min en PBS-T, seguido por 2x 5 min en PBS para eliminar totalmente las trazas de Tween.
  2. Se incuban las membranas durante 1 min en un volumen de reactivo de quimioluminiscencia mejorada suficiente para cubrir la totalidad de las membranas. Secar las membranas utilizando papel de filtro.
  3. Coloque las membranas en un analizador de imágenes luminiscentes para visualizar las bandas inmunorreactivas.
    1. Alternativamente, realice la detección de bandas inmunorreactivas utilizando películas X-Ray sensibles.
  4. Lave las membranas 3x 5 min en PBS.
    NOTA: En este paso las membranas pueden mantenerse seco. Sin embargo, si se requiere más de desmontaje, es mejor llevar a cabo la extracción antes de secar la membrana. Las membranas también se pueden almacenar a corto plazo en PBS.
  5. Para las membranas que no requieren separación entre la incubación con anticuerpos (véase la Figura 1) vaya directamente al paso5.20.
  6. Cuando se requiere separación entre los anticuerpos (ver Figura 1), incubar las membranas en pre calentado solución de decapado que contiene SDS al 2%, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) y el 0,7% β-mercaptoetanol en ddH2O a 50 ° C durante 20 min con agitación regular. Lave las membranas 3x 5 min en PBS.
    NOTA: La agitación durante el procedimiento de extracción es la clave. Excluyendo se puede realizar en un horno de hibridación. Alternativamente, desprendimiento se puede realizar utilizando membranas selladas en bolsas de plástico y se sumerge en un baño de agua. En este caso, es importante para agitar las membranas 4 - 5 veces durante la incubación.
  7. Se incuban las membranas durante 1 hora a RT o O / N a 4 ° C en PBS-T-leche.
  8. Repetir los pasos 5.12 a 5,16 según la figura 1.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La figura 2 muestra una imagen típica de inmunoblot IRF3 detectado con anticuerpos totales IRF3 y anticuerpos IRF3-phosphospecific contra Ser396 y Ser398 después de la resolución del EBB por la alta resolución de SDS-PAGE. En las células A549 no estimuladas, IRF3 se detecta como dos bandas a 50 y 53 kDa en el SDS-PAGE correspondiente a la no fosforilada (forma I) y el hypophosphorylated (forma II) especies de IRF3. La exposición de células A549 a Sev por 3 - 9 resultados...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El protocolo se describe aquí consiste en una combinación de alta resolución y SDS-PAGE-PAGE nativa acoplada a la utilización de varios anticuerpos fosfoespecíficos para distinguir el monomérica / dimérica y phosphoforms I-IV de IRF3. Detección adecuada de estas especies IRF3 es esencial para caracterizar completamente la activación IRF3 en un entorno específico. Por ejemplo, LPS estimulación de macrófagos activados conduce a la formación de dimérica, Ser396 / 398 IRF3 fosforilada que exhibe una hypophosphorylated (form...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los miembros anteriores y actuales del laboratorio por el desarrollo de los protocolos. El trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) [subvención # MOP-130527] y del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá [NSERC-355306-2012]. NG ha recibido una Cátedra de Investigación de Canadá de Nivel II. AR es becario del programa de formación de la Red de Investigación en Salud Respiratoria del Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
F12/HamLife Technologies11765-054Cálido en un 37 ° C baño antes de usar.
Suero fetal bovinoLife Technologies12483-020
L-glutaminaLife Technologies25030-081
D-PBSLife Technologies14190-144Para cultivo celular.
Tripsina/EDTA 0.25%Life Technologies25200-072
Virus de Sendai Cepa CantellLaboratorios Charles River600503
HepesBioshopHEP001
Cloruro de sodio (NaCl)BioshopSOD001.5
EDTABioshopEDT001
GlycerolBioshopGLY001.1Corta la extremidad de la punta y pipetea lentamente, ya que es muy gruesa.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771Marca registrada correspondiente al detergente Octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol (Nonidet P-40)
LeupeptinaBioshopLEU001
AprotininBioshopAPR600.25 
Fluoruro de sodioSigma-Aldrich201154
Ortovanadato de sodioMP Biomedicals159664Activación del ortovanadato de sodio 0,2 M : 1) Ajuste el pH a 10,0 utilizando 1 N NaOH o 1 N HCl. El pH inicial de la solución de ortotovanadato de sodio puede variar con una gran cantidad de productos químicos. 2) La solución es amarilla a pH 10.0. 3) Hervir hasta que quede incoloro. 5) Ajuste el pH a 10.0 y repita los pasos 3-4 hasta que la solución permanezca incolora y se estabilice en 10.0. Almacene las alícuotas de ortovanadato de sodio activado a -20 °C.
p-nitrofenilo fosfato sódico sal hexahidratadaSigma-AldrichP1585
Beta-glicerofosfatoSigma-AldrichG6376 
Reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad  Bio-Rad500-0006 citotóxico
Acrilamida/Bis-Acrilamida (37.5 : 1) 40%BioshopACR005 citotóxico
Tris-BaseBioshopDEO701
Ácido clorhídrico (HCl)LabChemLC15320-4 Trabaje debajo de la campana extractora. Tóxico e irritante.
Dodecil sulfato de sodio (SDS)BioshopSDS001.1 irritante.
Persulfato de amonioSigma-AldrichA3678
TEMEDInvitrogen15524-010Tóxico e irritante.
Azul de bromofenolFisher ScientificB392-5
Beta-mercaptoetanolSigma-AldrichM6250Trabajo bajo campana extractora. Tóxico para el sistema nervioso, mucosas. Puede ser tóxico para el tracto respiratorio superior, los ojos y el sistema nervioso central.
GlycineBioshopGLN001.5
Desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750
Hidróxido de sodio (NaOH)BioshopSHY700 irritante.
Membrana de nitrocelulosa (0,45 mm)Bio-Rad162-0115
Ácido acético glacialBioshop ACE222.4Trabajar bajo campana de gases. Tóxico, irritante e inflamable.
Ponteau rojoSigma-AldrichP3504   
Cloruro de potasio (KCl)Sigma-AldrichP3911 Para la composición de PBS para inmunoblot.
Na2HPO4BioshopSPD307.5Para la composición de PBS para inmunoblot.
KH2PO4Sigma-AldrichP0662 Para la composición de PBS para inmunoblot.
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA7906para PBS-T-BSA composición para inmunoblot.
Leche en polvo descremadaClavel
Poly sorbato 20 (Tween)MP Biomedicals 103168Cortar la extremidad de la punta y pipetear lentamente, ya que es muy espesa.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-America18783Almacén alistado a -20 oC. Evite congelar/descongelar.
Anti-IRF-3-P-Ser396Hecho en casa19Almacene alícuota a -80 oC. Evite congelar/descongelar.
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)Tecnología de señalización celular4947sAlmacene a -20 oC.
Anti-IRF-3-P-Ser398Hecho en casa15Almacene alícuota a -80 oC. Evite congelar/descongelar.
Motivo Actifanti-IRF-3 de longitud completa39033Almacene alícuota a -80 oC. Evite congelar/descongelar.
Anti-IRF3-NESIBL-America18781Tienda alistada a -20 oC.
Western Lightning Chemiluminescence Reagent PlusPerkin-Elmer Life SciencesNEL104001EA
LAS4000mini Aparato de cámara CCD GEhealthcare
SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad RangeBio-Rad161-0317Almacene alicquoted a -20 oC.

Referencias

  1. Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
  2. Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
  3. Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
  4. Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
  5. Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
  6. Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
  7. Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
  8. Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
  9. Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  10. Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
  11. Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
  12. Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
  13. Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
  14. Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
  15. Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
  16. Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).
  17. Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
  18. Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
  19. Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
  20. Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
  21. Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
  22. Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
  23. McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
  24. Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).
  25. Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  28. tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
  29. Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
  30. Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Activaci n de IRF3An lisis de fosforilaci nSDS PAGENative PAGEInmunotransferenciaVirus de SendaiExtracto celular totalAnticuerpos fosfoespec ficosElectroforesis no desnaturalizanteGel de alta resoluci n
Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.