Aquí describimos un procedimiento que permite un análisis detallado de la activación dependiente de la fosforilación del factor de transcripción IRF3. Esto se logra mediante la combinación de un SDS-PAGE de alta resolución y un PAGE nativo acoplado a inmunoblots utilizando múltiples anticuerpos fosfoespecíficos.
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Artículo de método
Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3
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Resumen
Resumen
El factor de transcripción IRF3 es crítico para la primera línea de defensa contra patógenos, principalmente a través de la expresión de genes de interferón β y antivirales. Un análisis detallado de la activación de IRF3 es esencial para comprender cómo los patógenos inducen o evaden la respuesta antiviral innata. Las distintas formas activadas de IRF3 se pueden distinguir en función de su fosforilación y el estado del monómero frente al dímero. La discriminación in vivo entre las diferentes especies activadas de IRF3 se puede lograr mediante la separación de formas fosforiladas de IRF3 en función de sus cambios de movilidad en SDS-PAGE. Además, los niveles de monómero y dímero IRF3 se pueden controlar mediante electroforesis no desnaturalizante. Aquí, detallamos un procedimiento para alcanzar la resolución más alta para obtener la mayor cantidad de información sobre el estado de activación de IRF3. Esto se logra mediante la combinación de un SDS-PAGE de alta resolución y un PAGE nativo acoplado a inmunoblots utilizando múltiples anticuerpos totales y fosfoespecíficos. Esta estrategia experimental constituye un enfoque asequible y sensible para adquirir toda la información necesaria para un análisis completo de la activación mediada por fosforilación de IRF3.
Introducción
El factor de transcripción expresado doquier y constitutivamente interferón (IFN) Factor de Regulación 3 (IRF3) es fundamental para la primera línea de defensa contra los patógenos, principalmente a través de la inducción de IFNß, pero también a través de la inducción de la quimiocina (motivo CC) ligando 5 (CCL5 ) y varias proteínas antivirales incluyendo la proteína inducida por IFN con tetratricopeptide repite IFIT1 / 2/3 a 1-3. Activación IRF3 ha sido reportado después de la infección con numerosos virus, o la exposición a ácido poliinosínico policitidílico (poli I: C) o lipopolisacárido (LPS) 4. Es importante destacar que los virus más....
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Protocolo
NOTA: El protocolo se describe aquí usando células A549 infectadas con el virus Sendai (VSe). Sin embargo, el protocolo para SDS-PAGE y PAGE nativa también trabaja con todos los tipos de células humanas y murinas probado hasta ahora, en particular células mieloides estimuladas con diferentes 9,15,19,24,25 estímulos IRF3 activador.
1. Infección de células A549
- Mantener las células A549 en cultivo en una placa de 15 cm a 37 ° C / 5% de CO 2 en 20 ml F12K medio / Ham que contenía 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (HI-FBS) y 1% de L-glutamina (F12K completa / Jamón medio).
NOTA: Todas las s....
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Resultados
La figura 2 muestra una imagen típica de inmunoblot IRF3 detectado con anticuerpos totales IRF3 y anticuerpos IRF3-phosphospecific contra Ser396 y Ser398 después de la resolución del EBB por la alta resolución de SDS-PAGE. En las células A549 no estimuladas, IRF3 se detecta como dos bandas a 50 y 53 kDa en el SDS-PAGE correspondiente a la no fosforilada (forma I) y el hypophosphorylated (forma II) especies de IRF3. La exposición de células A549 a Sev por 3 - 9 resultados.......
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Discusión
El protocolo se describe aquí consiste en una combinación de alta resolución y SDS-PAGE-PAGE nativa acoplada a la utilización de varios anticuerpos fosfoespecíficos para distinguir el monomérica / dimérica y phosphoforms I-IV de IRF3. Detección adecuada de estas especies IRF3 es esencial para caracterizar completamente la activación IRF3 en un entorno específico. Por ejemplo, LPS estimulación de macrófagos activados conduce a la formación de dimérica, Ser396 / 398 IRF3 fosforilada que exhibe una hypophosphorylated (form.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los miembros anteriores y actuales del laboratorio por el desarrollo de los protocolos. El trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) [subvención # MOP-130527] y del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá [NSERC-355306-2012]. NG ha recibido una Cátedra de Investigación de Canadá de Nivel II. AR es becario del programa de formación de la Red de Investigación en Salud Respiratoria del Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Cálido en un 37 ° C baño antes de usar. |
| Suero fetal bovino | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamina | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Para cultivo celular. |
| Tripsina/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Virus de Sendai Cepa Cantell | Laboratorios Charles River | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Corta la extremidad de la punta y pipetea lentamente, ya que es muy gruesa. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Marca registrada correspondiente al detergente Octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol (Nonidet P-40) |
| Leupeptina | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Fluoruro de sodio | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Ortovanadato de sodio | MP Biomedicals | 159664 | Activación del ortovanadato de sodio 0,2 M : 1) Ajuste el pH a 10,0 utilizando 1 N NaOH o 1 N HCl. El pH inicial de la solución de ortotovanadato de sodio puede variar con una gran cantidad de productos químicos. 2) La solución es amarilla a pH 10.0. 3) Hervir hasta que quede incoloro. 5) Ajuste el pH a 10.0 y repita los pasos 3-4 hasta que la solución permanezca incolora y se estabilice en 10.0. Almacene las alícuotas de ortovanadato de sodio activado a -20 °C. |
| p-nitrofenilo fosfato sódico sal hexahidratada | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad | Bio-Rad | 500-0006 | citotóxico |
| Acrilamida/Bis-Acrilamida (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | citotóxico |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Ácido clorhídrico (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Trabaje debajo de la campana extractora. Tóxico e irritante. |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | irritante. |
| Persulfato de amonio | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Tóxico e irritante. |
| Azul de bromofenol | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Trabajo bajo campana extractora. Tóxico para el sistema nervioso, mucosas. Puede ser tóxico para el tracto respiratorio superior, los ojos y el sistema nervioso central. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Bioshop | SHY700 | irritante. |
| Membrana de nitrocelulosa (0,45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Ácido acético glacial | Bioshop ACE222.4 | Trabajar bajo campana de gases. Tóxico, irritante e inflamable. | |
| Ponteau rojo | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | Para la composición de PBS para inmunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | Para la composición de PBS para inmunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Para la composición de PBS para inmunoblot. |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | para PBS-T-BSA composición para inmunoblot. |
| Leche en polvo descremada | Clavel | ||
| Poly sorbato 20 (Tween) | MP Biomedicals 103168 | Cortar la extremidad de la punta y pipetear lentamente, ya que es muy espesa. | |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Almacén alistado a -20 oC. Evite congelar/descongelar. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Hecho en casa19 | Almacene alícuota a -80 oC. Evite congelar/descongelar. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Tecnología de señalización celular | 4947s | Almacene a -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Hecho en casa15 | Almacene alícuota a -80 oC. Evite congelar/descongelar. | |
| Motivo Actif | anti-IRF-3 de longitud completa | 39033 | Almacene alícuota a -80 oC. Evite congelar/descongelar. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Tienda alistada a -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini Aparato de cámara CCD GE | healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Almacene alicquoted a -20 oC. |
Referencias
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
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Reimpresiones y permisos
