Un sistema de inyección a presión de Investigación de la Neurofarmacología del procesamiento de la información en que se comporta Awake mono macaco de la corteza

Resumen

Aquí, mostramos la inyección a presión de sustancias neurofarmacológicas durante el registro de una sola célula en un mono macaco despierto y que se comporta. Este procedimiento permite la manipulación farmacológica en las inmediaciones directas de un sitio de registro cortical.

Resumen

La modulación de arriba hacia abajo del procesamiento de la información cortical es funcionalmente importante para muchos procesos cognitivos, incluida la modulación del procesamiento de la información sensorial por la atención. Sin embargo, se sabe poco sobre qué sistemas de neurotransmisores están involucrados en tales modulaciones. Una forma práctica de abordar esta cuestión es combinar el registro de una sola célula con la manipulación neurofarmacológica local y temporal en un modelo animal adecuado. En este trabajo demostramos una técnica que combina el registro agudo de una sola célula con la inyección de agentes neurofarmacológicos en las proximidades directas del electrodo de registro. El vídeo muestra la preparación del sistema de inyección/registro a presión, incluida la preparación de la sustancia que se va a inyectar. Mostramos un mono rhesus realizando una tarea de atención visual y el procedimiento de registro de una sola unidad con manipulaciones farmacológicas por bloques.

Introducción

En las áreas corticales y subcorticales, la actividad neuronal se ve afectada por varios neuromoduladores, por ejemplo la acetilcolina¹. Estos efectos moduladores sobre las respuestas neuronales han sido reportados en estudios in vitro ², así como en registros electrofisiológicos de animales anestesiados³ y manipulaciones farmacológicas sistémicas en humanos⁴. Sin embargo, el papel exacto de los diferentes neuromoduladores y la participación de varios subtipos de receptores son en gran medida desconocidos. Para medir los efectos de neuromoduladores específicos en la actividad de neuronas individuales, es deseable inducir un cambio temporal del neuromodulador lo más cerca posible del electrodo de registro. Además, es importante que esas manipulaciones se realicen en animales despiertos, ya que las funciones cognitivas solo están presentes en ausencia de anestesia. Además, la anestesia interactúa con los sistemas colinérgico y GABAérgico^5,6 y puede provocar cambios en la actividad neuronal³.

En las últimas décadas, se han desarrollado y refinado dos métodos principales de administración local de fármacos: la iontoforesis y la inyección a presión. En ambos métodos, los medicamentos se administran a través de micropipetas hechas de vidrio o acero. Con la iontoforesis, una corriente eléctrica regula la liberación del fármaco⁷. Además, hay una contribución significativa de la electroósmosis a la cantidad total de moléculas expulsadas⁸, correlacionándose con el diámetro de la punta⁹ de la micropipeta, así como con la concentración⁸ de la sustancia utilizada. La iontoforesis es una poderosa herramienta para manipular de forma rápida y precisa pequeños volúmenes de tejido nervioso. Para las inyecciones iontoforéticas, se suelen utilizar micropipetas de varios cilindros¹⁰, una de las cuales actúa como dispositivo de registro y las otras como pipetas de administración. Una limitación de este método es que solo se pueden utilizar moléculas cargadas, lo que limita severamente la selección de fármacos.

La inyección a presión utiliza la compresión de aire o la presión mecánica para expulsar una sustancia de una micropipeta. Con este método se puede utilizar cualquier sustancia soluble, cargada o sin carga, incluidas las moléculas grandes. El método de inyección a presión fue descrito por primera vez por Reyniers en 1933 y refinado aún más en la década de 1950 (véase Lalley¹¹ para una revisión). En la década de 1980, el método se refinó aún más para permitir la entrega de cantidades en el rango de nanolitros (principalmente lidocaína¹²) a un área definida del cerebro¹³ mientras se realizaba simultáneamente el registro de una sola célula. El volumen expulsado se controló generalmente mediante la observación del movimiento de un marcador, como el menisco en la parte superior de la pipeta¹³. La inyección a presión se utilizó por primera vez en la década de 1990 en animales despiertos, tanto extracelularmente¹⁴ como intracelularmente^15,16. Sobre la base de la experiencia acumulada adquirida en estos estudios, ahora es posible registrar de forma fiable diferentes estructuras cerebrales en combinación con la manipulación farmacológica (véase¹⁷ para una comparación de los sistemas de inyección a presión recientes).

Un problema pendiente para ambos métodos de administración de fármacos es la dificultad para determinar el volumen preciso inyectado. Este es un desafío aún mayor para los experimentos con monos rhesus despiertos y que se comportan, donde el animal realiza la tarea experimental en una habitación separada. Esto puede aliviarse mediante el uso de un sistema controlado por software en lugar de depender de un marcador visual para monitorear continuamente una inyección.

El sistema descrito aquí es una extensión de un sistema de registro electrofisiológico bien establecido (Mini Matrix System) y combina una pipeta de inyección con múltiples electrodos de registro orientados en paralelo a distancias definidas en una disposición personalizable. La manipulación farmacológica del tejido cercano al electrodo de registro es posible utilizando solo una pequeña cantidad de sustancia, lo que garantiza una recuperación rápida y permite múltiples bloques de inyección y control/recuperación dentro de la ventana de tiempo limitada que ofrece la tarea conductual del animal.

Protocolo

cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las leyes alemanas que rigen el cuidado de animales y aprobados por el gobierno del distrito de Braunschweig, Baja Sajonia, Alemania.

Nota: A medida que el experimento se realiza in vivo, es crucial para mantener las normas de higiene más estrictas posibles. Siempre que sea posible, trabajar en condiciones estériles.

1. Preparación del sistema de inyección / grabación

1. Esterilizar el tubo que conecta la micropipeta con la jeringa. Use la longitud más corta del tubo posible en el montaje experimental entre la bomba de inyección y sistema de registro electrofisiológico.
2. Limpiar los tubos de guía del sistema de impresión que utiliza cables de limpieza. Sumergirlos en aceite de silicona estéril y alimentarlos a través de los tubos de guía de forma reiterada.
3. Insertar la micropipeta de vidrio de cuarzo en un tubo de guía del sistema de grabación. Vea la Figura 1A.
4. Después de fijar la micropipeta enel sistema de grabación, conecte el tubo estéril al pasador de metal de la micropipeta. Cuídate; aunque la micropipeta se fija en el sistema se puede romper fácilmente cuando se fija el tubo. Use dos pinzas estériles para aplicar la misma presión en el pin y el tubo.
5. Utilice pegamento líquido para sellar la unión entre el tubo y la micropipeta. Espere por lo menos 3 horas para que el pegamento se endurezca antes de llenar la micropipeta con el líquido.
6. Inserte microelectrodos (por ejemplo, vidrio de cuarzo con aislamiento de tungsteno de platino) en las otras posiciones del sistema de grabación antes o después de la inserción micropipeta.

2. Preparación de la sustancia

1. Esterilizar 1,5 ml tubos de microcentrífuga para el almacenamiento posterior de soluciones de inyección utilizando un autoclave u otro procedimiento fiable.
2. Pesar el correspondiente hidrocloruro de escopolamina sustancia para preparar 5 ml de una solución molar 0.1. Disolver en solución salina estéril (0,9% NaCl).
3. En condiciones estériles ina campana de ventilación, filtrar la solución utilizando un filtro de jeringa con diámetro suficientemente grande de poros, por ejemplo, 0,2 micras.
4. Bajo la campana de humos, alícuota de la solución en un volumen suficiente para un solo experimento, por ejemplo, por la escopolamina, 500 l en tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril. Use tubos oscuros para proteger la sustancia de la luz; alternativamente, envolver en papel de aluminio tubos. Para escopolamina, almacenar la solución para un máximo de 14 días a 4 ° C.

3. Preparación diaria del sistema de inyección / grabación

Nota: Cuando se monta en el sistema de grabación, los electrodos y micropipeta se almacenan en una solución de enzima (Tergazyme, solución al 1% con agua desionizada) entre grabaciones. Los siguientes pasos se deben realizar antes de cada grabación.

1. Recoger un tubo de la sustancia a inyectar. Deje que alcance la temperatura ambiente si se refrigera.
2. Eliminar el sistema de inyección / grabación a partir de la solución de enzima y enjuague electrodosy micropipeta con agua desionizada para limpiar completamente de la solución de enzima.
3. Retire la cubierta frontal del sistema de registro con el fin de comprobar visualmente el sello entre la micropipeta y el tubo.
4. Aplicar aceite de silicona estéril a la brecha de tubo de guía (véase la Figura 1A) y las puntas de electrodos y micropipeta con el fin de lubricar el sistema para un movimiento suave.
5. Compruebe punta de micropipeta electrodos y utilizando un microscopio para asegurarse de que están intactos. Alinear los electrodos y la micropipeta bajo el microscopio de manera que se extienden fuera de los tubos de guía con la misma longitud. Conducirlos hacia los tubos de guía, deteniéndose tan pronto como ya no son visibles. Esto se define como la posición del electrodo cero. Ajuste la profundidad de los electrodos y la micropipeta a 0 en el software.
6. Llene una jeringa estéril con solución salina estéril e insertar la aguja en el tubo, teniendo cuidado de no perforar la pared del tubo. Conducir la micropipeta fuera del tubo guía para visual control del flujo de sustancias.
7. Flush al menos 2 ml de solución salina estéril a través del tubo y micropipeta para asegurar que no queda aire en la jeringa o en el tubo. No aplicar demasiada presión al émbolo de la jeringa. Garantizar la unión entre el tubo y la micropipeta se sella. Si la fuga es visible, vuelva a pegar la unión (véase el paso 1.5) y posponer la grabación.
8. Llenar una nueva jeringa estéril con la solución a inyectar y el intercambio con el cañón de la jeringa de solución salina, es decir, mantener la aguja de la jeringa llena de solución salina en el tubo. Asegúrese de que el aire no se transfiere en el sistema. Esto se consigue mejor por el llenado del cubo de la aguja con solución salina después de quitar el barril lleno de solución salina.
9. Enjuague el sistema con 250 l de la solución a inyectar, con el fin de eliminar completamente la solución salina desde el tubo.
10. Usando el software de control de motor, retraer los electrodos y micropipeta en el guidetubesto una profundidad de al menos -500 m.
11. inferior del anillo de tubo de guía (Figura 1A) a la parte inferior de los tubos de guía para mantener su posición relativa fija.
12. Limpiar la base del sistema con etanol, en particular, en el que tocará cámara de registro del mono.
13. Cierre el sistema de registro mediante la sustitución de la cubierta frontal y apriete los tornillos.

4. Validación del Sistema de Inyección

Nota: Aunque la compañía calibra el sistema, se recomienda para validar los volúmenes eyectados con los materiales utilizados en el montaje experimental (tubos, jeringas, etc.).

1. Preparar el sistema tal como se describe en el paso 3, manteniendo los electrodos y micropipeta extendidos fuera de los tubos guía. Se recomienda una profundidad de al menos 7,000 m para evitar la pérdida de volumen de medición debido a la adhesión a lo largo de la superficie exterior de la micropipeta y electrodos.
2. Coloque el sistema de grabación en la posición que se utilizará en durante el experimento y poner el Syringe en la bomba de microinyección. Fijar la jeringa en su lugar utilizando la banda de goma y agarre ajustable (véase la Figura 1A). Deslice la parte móvil de la bomba hasta que esté firmemente en su lugar detrás del émbolo de la jeringa.
3. El uso de la unidad de motor controlado por software, expulsar un volumen lo suficientemente grande como para ser medida con precisión, por ejemplo., 1.000 nl. Es preferible utilizar un solo paso para expulsar el volumen total con el fin de evitar los efectos de la acción capilar a lo largo de la superficie de micropipeta. velocidades muy bajas (1 nl / s) también pueden conducir a este efecto durante el procedimiento de validación.
4. Recoger el volumen total en un recipiente colocado debajo de la micropipeta, o cobrar cuidadosamente la gota expulsada directamente desde la punta de la micropipeta. Estimar el volumen eyectado con una pipeta o pesando con una balanza de precisión.
5. Repita el procedimiento varias veces para confirmar las mediciones.

5. Grabaciones agudos

1. Establecer la posición xydel sistema de grabación. Esto define el punto en el que los tubos de guía llegan a la duramadre dentro de la cámara de registro implantado crónicamente. Asegúrese de que los tubos de guía se retiran por completo (tubo guía de posición z 0).
2. Llevar el sistema de grabación en su posición y coloque la jeringa en la bomba de microinyección. Fijar la jeringa en su lugar utilizando la banda de goma y agarre ajustable (véase la Figura 1A). Deslice la parte móvil de la bomba hasta que esté firmemente en su lugar detrás del émbolo de la jeringa. Si una gota de sustancia es visible en la punta de los tubos de guía, retirar con cuidado utilizando un bastoncillo de algodón estéril.
3. Preparar el animal para el registro de acuerdo con el procedimiento del laboratorio (véase, por ejemplo, ¹⁸ directrices).
4. montar de forma segura el sistema de grabación de la cámara de registro del mono.
5. Lentamente baje manualmente los tubos de guía en la cámara de la grabación hasta que se alcanza la duramadre, luego en coche los electrodos utilizando el motor de control de software.
6. Como no es posible medir la impedancia de la micropipeta, primero en coche con electrodos y comprobar sus impedancias regularmente a diferentes profundidades. Después de una penetración de la duramadre se realiza con éxito, sin dañar los electrodos, avanzar en la micropipeta.
7. Conducir los electrodos y la micropipeta a la profundidad del electrodo de destino a la que se espera que el área del cerebro de interés que se encuentran. avanzar lentamente el electrodo hasta que está lo suficientemente cerca para registrar la actividad de una sola unidad, como se evidencia por una buena relación señal-ruido en la señal grabada. Es importante destacar que la posición del electrodo de registro y la micropipeta a la misma profundidad para asegurar la distancia mínima entre el electrodo y micropipeta.
   1. Si es posible, mantener los electrodos y micropipeta a esta profundidad durante toda la grabación. Sin embargo, si la única manera de mantener la calidad de señal de la célula registrada es mover los electrodos, a continuación, conducir los electrodos y la micropipetaal mismo tiempo para mantener la distancia entre ellos.

6. atención espacial de tareas

1. En una serie de ensayos, presentan dos patrones de puntos en movimiento en la pantalla, una situada dentro del campo receptivo de la neurona registrada y el otro fuera de él, junto con un punto de fijación presenta centralmente que el animal tiene que foveate lo largo de cada ensayo ^{19, 20.}
   Nota: El mono está capacitado para responder a un cambio de dirección en el patrón de puntos con claves (el evento de destino) sin tener en cuenta cualquier cambio de dirección en el otro patrón de puntos, y es recompensado con una gota de líquido por cada finalización con éxito de un ensayo ^{19, 20.} Como una condición de control sensorial, el mono tiene que reportar un cambio de luminancia del punto de fijación sin tener en cuenta los dos patrones de puntos en movimiento (véase la Figura 2 para una descripción más detallada de la tarea).

7. Mientras que la manipulación farmacológica de grabación

Nota: Mientras que el mono está realizando la tarea, inyectar la sustancia en una forma en bloque. Tres bloques consecutivos se definen: control, que actúa como una línea de base; inyección, durante la cual se expulsa una sustancia; y la recuperación, durante el cual las células diana por el retorno de la inyección a la línea base.

1. Durante un bloque de inyección, inyectar una cantidad predefinida de la sustancia a intervalos regulares por ejemplo., 2 nl cada minuto a una velocidad de 2 / s nl. Para este ejemplo, el uso de hidrocloruro de escopolamina. El proceso de inyección se controla mediante software que proporciona varias opciones. Por ejemplo, utilice la función de paso para definir el volumen de inyección, y presione el botón de inyección cada minuto según el reloj del software de grabación.
   Nota: La duración exacta del bloque de inyección es la sustancia y el experimento depende, por ejemplo, para el uso de escopolamina 2 inyecciones nl por minuto durante 10 minutos (20 nl en total).. Es preferible no para avanzar los electrodos y duri micropipetang del bloque de inyección.
2. Tenga en cuenta el tiempo y la prueba durante el cual se inyecta la sustancia, la profundidad de los electrodos y micropipeta, así como la cantidad de sustancia expulsado.
3. Siga el bloque de inyección con un bloque de recuperación, en la que se inyecta ninguna sustancia. La duración del bloqueo de recuperación depende de las sustancias y necesita ser definido en pruebas previas. Controlar y mantener la calidad de la grabación de las unidades individuales seleccionados hasta el final del bloque de recuperación.
4. Repita los tres bloques durante el tiempo que la calidad de grabación y la motivación del mono permiten.

8. Procedimientos posteriores a la grabación

1. Después de la grabación de datos, retraer los electrodos y micropipeta en los tubos de guía y luego retraer manualmente los tubos guía. Eliminar el sistema de grabación de la cámara de registro del mono. Soltar la jeringa de la bomba de inyección y transferir el sistema a la zona de preparación para la limpieza.
2. Manejar el animal(incluyendo la limpieza de la cámara de registro ¹⁸⁾ de acuerdo con los procedimientos estándar de laboratorio y devolverlo a las instalaciones de la vivienda.
3. Enjuague el exterior de los tubos de guía con peróxido de hidrógeno (3%) y luego con agua desionizada. electrodos de accionamiento y micropipeta fuera de los tubos de guía, enjuague con peróxido de hidrógeno y agua desionizada a continuación.
4. Cambiar el cilindro de la jeringa con un barril de una jeringa llena de solución salina estéril, manteniendo la aguja en el tubo. Enjuague bien el tubo y la micropipeta con 1-2 ml de solución salina. Después de lavado, retire el cilindro y llenarlo de aire. Vuelva a insertar el barril en la aguja y se seca el tubo y la micropipeta desde el interior empujando suavemente aire a través.
5. Guarde los tubos de guía, electrodos extendidos y micropipeta sumergidos en la solución de enzima para evitar el secado, así como para asegurar la descomposición de la materia orgánica.

Resultados

La Figura 2 representa la tarea de atención espacial el mono lleva a cabo mientras el proceso de inyección se llevó a cabo. El mono fue entrenado para asistir a cualquiera de los estímulos situado dentro del campo receptivo de la neurona registrada (asistir-in), el estímulo situado fuera del campo receptivo (asistir en salir) o en el punto de fijación (asistir a-fix). Estas condiciones permiten una comparación de la actividad neuronal en diferentes estados de atención.

La Figura 3 muestra un tiempo de peri-estímulo histograma de una neurona de la muestra en un experimento utilizando la escopolamina, un antagonista colinérgico muscarínico. La trama demuestra la supresión de la respuesta durante la inyección de escopolamina versus ningún inyección, cuando un patrón se mueve en dirección preferida de la celda se presenta dentro del campo receptor de la neurona y es atendido por el animal. Los dos primeros picos representan la neurona9; s respuesta a las masas del balance y el desplazamiento de la señal espacial, que aparece dentro de su campo receptivo. Esto es seguido por la respuesta al patrón de movimiento que aparece en la pantalla 500 ms después del inicio de localización. La superficie gris representa el período de análisis se utiliza para calcular la tasa media de disparo para cada prueba. El área verde pone de manifiesto la influencia supresiva de la inyección de escopolamina en la tasa de disparo de la célula. La región de color verde oscuro muestra la supresión dentro del período de análisis.

La Figura 4A muestra el efecto de la escopolamina en la tasa de disparo de la neurona promedio de la muestra en cada una de las tres condiciones de atención. tasa de la neurona de disparo para las dos condiciones de atención espaciales (atención dentro o fuera del campo receptivo de la neurona grabación), así como para la condición sensorial (la atención en el punto de fijación) cayeron poco después de la primera inyección del bloque de inyección (sombreados en gris sona) y durante el bloque de recuperación después de un aumento de la demora al mismo nivel que antes de la inyección.

La Figura 4B muestra una grabación de una segunda neurona muestra de control en el que se inyectó solución salina (0,9% NaCl), usando el mismo protocolo que para la inyección de escopolamina. Durante la inyección de bloqueo no se observó ningún cambio en la tasa de disparo de la neurona en comparación con el bloque de control.

Figura 1. Configuración utilizada para la manipulación farmacológica durante la grabación. (A) Representa la bomba de microinyección y el sistema de registro electrofisiológico y equipado con electrodos de micropipeta. La brecha guidetube, en el que se introduce aceite de silicona para lubricar los electrodos y micropipeta, se muestra ampliada. (B) Muestra un ejemplo micropipeta (arriba)y electrodo de registro (abajo). Para la comparación de tamaño, de un céntimo de euro (diámetro: 16 mm). Se coloca debajo favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. diseño de tareas para guiar la atención espacial. Los monos fueron entrenados para detectar un cambio de dirección de movimiento en el patrón de puntos con claves. La señal fue colocada ya sea dentro del campo receptor de la neurona (asistir-in), como se muestra en la figura, o fuera de ella (asistir en salir). Como control sensorial, el mono fue entrenado para detectar un cambio de luminancia del punto de fijación (asistir a-fix). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Influencia de la escopolamina antagonista sobre la tasa de disparos. El histograma tiempo peri-estímulo para una neurona se muestra un ejemplo para la asistir-en la condición (atención dentro del campo receptivo de la neurona registrada) durante el bloque de inyección y durante el bloque de control. El eje x representa el tiempo en milisegundos después del inicio del taco y el eje y muestra la velocidad de disparo en espigas / seg. El área gris representa el período de análisis (300-800 ms después del inicio del estímulo) que se utiliza para calcular la tasa de disparos de prueba promediadas. La zona de sombra verde muestra la supresión de la tasa a través de las dos condiciones de la cocción. El color verde oscuro destaca la supresión dentro del período de análisis. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Efecto de la escopolamina y solución salina en la tasa de disparos. De inyección de escopolamina (A) Antagonista. La tasa de disparos de prueba de un promedio de la celda de muestra de la figura 3 en el curso del experimento se muestra para el estímulo preferido para las tres condiciones de atención. El eje x representa el tiempo de inicio de prueba en minutos y el eje y muestra la tasa de disparo de la unidad de espigas por segundo. (símbolos asistir a, asistir a-fix, asistir de salida) representan tasa de disparo de las neuronas dentro del período de análisis en cada ensayo realizado con éxito, y las líneas horizontales (línea continua: asistir de entrada, línea punteada: asistir a-fix, línea discontinua: asistir en salir) mostrar tasa media de disparo para el tres bl experimental diferenteocks (control, inyección, recuperación). La superficie gris muestra el bloque de inyección, comenzando con la primera inyección y termina 1 min después de la última inyección. Durante la inyección de bloqueo 2 nl de 0,1 molar escopolamina se inyectaron cada minuto con una velocidad de inyección de 2 s / nl. (B) la inyección de solución salina. La velocidad de disparo de una celda de muestra en el transcurso del experimento de control se muestra para el estímulo preferido para las tres condiciones de atención. Área sombreada gris visualiza el bloque de inyección de solución salina. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Aquí hemos ilustrado en detalle cómo realizar inyecciones fiables y precisos y grabaciones de una sola célula de alta calidad con un sistema de inyección a presión "off-the-shelf". Si bien este método de administración del fármaco se ha utilizado anteriormente en comportarse monos (revisado en ^17), el sistema que aquí se presenta tiene ventajas, se examinan a continuación.

Como se ilustra en la Figura 4A, el sistema aquí descrito puede proporcionar una medición estable de actividad de la neurona individual con y sin inyecciones farmacológicas en la proximidad inmediata del sitio de grabación. Como se muestra en la Figura 4B, la inyección de una sustancia de control, solución salina, no dio lugar a un cambio en la tasa de disparos. Este control demuestra que el proceso de inyección en sí tiene ninguna influencia mensurable en las propiedades de descarga de las neuronas registradas.

La configuración espacial de las neuronas, electrodo de registro, y micropipeta es de fundamental importancia en estos experimentos. A pesar de que una medición precisa de sus posiciones relativas en el tejido durante la grabación no es posible, podemos considerar y control de las posibles fuentes de variación. En primer lugar, durante la inyección de volumen hay un riesgo de que la neurona de interés puede ser desplazado lejos del electrodo de registro, que afecta a la estabilidad de las señales registradas. Por esa razón, es prudente comparar la tasa de disparos antes y después del bloque de inyección para verificar la estabilidad de la señal. En segundo lugar, la configuración de tubo de guía del sistema de grabación define la distancia entre los electrodos y micropipeta (por ejemplo., 305 micras en el sistema de 3 canales concéntricos usado en este experimento). A medida que el sistema proporciona un control de posición preciso de la profundidad de los electrodos y micropipeta en el tejido, la distancia entre ellos se puede minimizar calibrando cuidadosamente profundidad relativa antes de la grabación (etapa 3.5), y mantenerlos a una profundidad común durante las grabaciones.

ent "> Posibles limitaciones
Además del control de calidad interno por el fabricante, el sistema necesita ser validado en condiciones de laboratorio, ya que diferentes marcas de tubos, jeringas, etc se pueden utilizar y podrían dar lugar a diferencias en los volúmenes eyectados. Aunque el sistema se puede utilizar para inyectar volúmenes muy pequeños, como en el experimento mostrado aquí, estos son a continuación el volumen mínimo que puede ser validado debido a los límites prácticos de medición en un ambiente normal de laboratorio. Sin embargo, los volúmenes de inyección más grandes se pueden utilizar para deducir la relación entre el volumen definido por software y el volumen expulsado por el hardware. Si se utilizan tubos transparentes, una comprobación visual adicional del proceso de inyección es posible midiendo el desplazamiento de un marcador visual.

Inserción de la micropipeta en el sistema es más exigente que la inserción del electrodo, como el diámetro de la micropipeta es ligeramente más grande y el material es más frágil. En adición,unir el tubo para el pasador de la micropipeta es difícil, ya que implica un alto riesgo de rotura de la parte superior de la micropipeta. Sin embargo, la vida útil de una micropipeta cargado correctamente es de varios meses, incluso con el uso diario.

En la práctica, todavía no hemos encontrado un bloqueo en el sistema de inyección durante la limpieza posterior a la grabación del sistema. Sin embargo, sin verificación de "en línea" es posible, y hay un riesgo de que un bloqueo físico (tal como tejido en la punta de la micropipeta) podría evitar la inyección de sustancias. Por tanto, sería conveniente analizar los datos de forma conservadora, como la inclusión de sólo aquellas células en un análisis más detallado que muestran cambios significativos en las tasas de disparar entre los bloques de control e inyección del experimento.

A pesar de su pequeño diámetro, microelectrodos y pipetas desplazarán tejido cerebral y pueden causar algún daño tisular local. Esto puede ser minimizado mediante el posicionamiento manual de la punta de THtubos de guía e justo por encima de la duramadre. Los electrodos entonces penetran en la duramadre y su integridad se infiere midiendo sus impedancias de línea. Después, se inserta la micropipeta. Cuando se utiliza este enfoque, se recomienda la eliminación regular de tejido por encima de la duramadre para reducir aún más el riesgo de electrodo o pipeta rotura.

Comparación con otros métodos
El sistema utilizado aquí muestra claras ventajas en comparación con otros sistemas de inyección de presión. Una ventaja fuerte es el diámetro de la micropipeta (aproximadamente 100 micras), que es la mitad del tamaño de otras sondas disponibles ¹⁷ y por lo tanto reduce al mínimo el daño tisular neural. En contraste con los diseños anteriores, el sistema actual emplea espacialmente separada electrodo de registro y micropipeta. Aunque otros sistemas proporcionan una menor distancia entre el electrodo y la pipeta, el sistema descrito aquí permite cambios de profundidad independientes de los electrodos y de la pipeta, por lo tanto permitting distancias relativas variables dentro de una sesión de grabación. Es importante destacar que no hay compromiso en relación con la calidad de grabación necesita ser hecho, como el sistema de inyección es una extensión de un dispositivo de registro establecido. Mientras que sólo una micropipeta y por lo tanto una sustancia se utiliza en este protocolo, es posible inyectar varias sustancias dentro de un procedimiento experimental. Para lograr esto, varios micropipetas pueden ser roscados en los tubos de guía separados y conectados a jeringas montadas en bombas de inyección individuales. Por último, el control del sistema es fácil, ya que sólo se necesita un programa de ordenador para hacer avanzar los electrodos y micropipeta, y para realizar la inyección a presión durante el experimento.

La comparación de inyección a presión a la iontoforesis, hay ventajas y desventajas relativas. Por ejemplo, la inyección de presión requiere un mayor volumen para ser introducido en el tejido de la iontoforesis, lo que aumenta el riesgo de desplazamiento neuronal. El proto actualcol utiliza volúmenes en el rango de latitud norte, y rara vez experimentado cambios notables en la calidad de la señal de una célula registrada. El sistema también permite volúmenes más grandes para ser inyectados, que es potencialmente útil para las manipulaciones de comportamiento pero podría afectar la estabilidad de la grabación neuronal. Una clara ventaja de la inyección de presión sobre la iontoforesis es la más grande variedad de sustancias utilizables ya que no hay necesidad de utilizar sustancias cargadas. Sin embargo, los valores de pH deben ser revisados ​​y comparados entre sustancias experimentales y de control (por ejemplo., Solución salina).

La cuestión podría plantearse por qué utilizar el método de larga data de inyección a presión en lugar de las técnicas más recientes, como la optogenética para la manipulación de la actividad neuronal. Aunque bien establecida en los roedores, la optogenética aún no se establece de forma fiable en monos rhesus. En particular, aún no permite la manipulación local de células selectivas para un tipo de neurotransmisor en particular. A más largo plazo, vemosun gran potencial para la combinación de las ventajas de las manipulaciones farmacológicas con las ventajas de manipulaciones optogentic en la aclaración de la base neural de las funciones cognitivas.

Aquí hemos demostrado que la inyección a presión se puede utilizar para manipular farmacológicamente una zona restringida localmente en el cerebro de despierto, comportándose monos rhesus. Esperamos que este método inspira a otros científicos para investigar las contribuciones neuromoduladores a la dinámica de la actividad neuronal.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(-)-Clorhidrato de escopolamina	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339.81 g/mol
NaCl 0.9%	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich		Z273287 detergen enzimático
Peróxido de hidrógeno	Roth		Utilizado en solución al 3% con agua desionizada
Etanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Agua
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Jeringa y aguja
Tubos de microcentrífuga Eppendorf Safe-Lock, ámbar	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Micropipeta de vidrio de cuarzo	Thomas Recording
Electrodo de grabación	Thomas Recording		Electrodo de fibra de cuarzo/platino-tungsteno; valor de impedancia 1-2 MΩ   y 0,3-0,5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Tamaño: 0,25 x 2,05 mm (Ancho: 0,9mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Superglue
Aceite de silicona	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761----------R	Filtro de jeringa
Sistema de microinyección multicanal	Thomas Recording		manipulador de microelectrodos multicanal" Sistema Eckhorn" equipado con microelectrodos y micropipetas y una bomba de microinyección multicanal de precisión
personalizado			McLab para controlar la presentación de estímulos

desionizadaSoftware de laboratorio interno