El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

Resumen

Hemos establecido una técnica para el aislamiento, la caracterización fenotípica y análisis funcional de células inmunes de encía murino.

Resumen

Las redes de células inmunitarias en los tejidos desempeñan un papel vital en la mediación de la inmunidad local y en el mantenimiento de la homeostasis tisular, sin embargo, se sabe poco de las poblaciones de células inmunitarias residentes en la mucosa oral y la encía. Hemos establecido una técnica para el aislamiento y estudio de células inmunitarias de tejidos gingivales murinos, un área de exposición microbiana constante y un sitio vulnerable a una enfermedad inflamatoria común, la periodontitis. Nuestro protocolo permite una caracterización fenotípica detallada de las poblaciones de células inmunitarias que residen en la encía, incluso en estado estacionario. Nuestro procedimiento también produce suficientes células con alta viabilidad para su uso en estudios funcionales, como la evaluación de la secreción de citocinas ex vivo. Esta combinación de caracterización fenotípica y funcional de la red de células inmunitarias gingivales debería ayudar a investigar los mecanismos implicados en la inmunidad oral y la homeostasis periodontal, pero también permitirá avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la inmunopatología local.

Introducción

Tejidos gingivales rodean la dentición humana y murina y están constantemente expuestos al complejo biofilm del diente ^1. La red de células inmunes la vigilancia de la barrera gingival es vital para mantener la integridad del tejido, asegurando homeostasis con los microbios comensales locales y, al mismo tiempo, proporcionando una inmunidad eficaz contra el desafío patogénico ^2. Para lograr la homeostasis, el sistema inmunológico está cuidadosamente adaptada al entorno gingival creación de una red de células inmunes altamente especializado, sin embargo, poco se conoce el detalle de las poblaciones de células inmunes gingivales y su papel en el m....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales descritos en este protocolo siguen las pautas requeridas y fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo, NIDCR / NIH.

1. Prepárese por adelantado

1. Preparar medio completo: RPMI suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina y 10% de FBS.
2. Preparar medios DNasa: 50 ml de medio RPMI suplementado con 7,5 mg de DNasa (Haga fresco, mantener en hielo en todo momento).
3. Preparar los medios de colagenasa-DNasa: 5 ml de medio DNasa más 3,2 mg / ml de colagenasa tipo IV (Haga fresco, mantener en hielo en todo momento).

Resultados

Para ilustrar la aplicación del protocolo, mostramos los resultados representativos que examinan la red de células inmunes en la encía de los ratones con y sin periodontitis (WT vs. LFA ^{- / -,} Figura 2A - C). FACS representativos gráficos muestran células CD45 ⁺ hematopoyéticos vivos en la encía (Figura 2A, 2C). El aislamiento y la transformación de las células inmunes con este protocolo da suficien.......

Discusión

La técnica actual produce con éxito un gran número de células inmunes (de un solo ratón) adecuado, no sólo para la caracterización fenotípica, sino también para estudios funcionales ex vivo. Otro grupo había publicado previamente un protocolo para aislar y caracterizar células inmunes gingivales murino y se introduce el valor de la utilización de la citometría de flujo multicolor en el estudio de la periodontitis en modelos animales ^9. Tras la resolución de problemas considerables la modificación cla.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tijeras finas	Herramientas de ciencia fina	14058-11
Mango de bisturí #3	Herramientas de ciencia fina	10003-12
Hojas de bisturí #10	Herramientas de ciencia fina	10010-00	Pinzas de astilla estériles
	Integra Miltex	6-304
Agujas con bisel regular	BD Medical	305109	27 G, 12,7 mm de longitud
Jeringas Monoject	Covidien 8881513934		Punta Luer-lock, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Sin Calcio y Magnesio
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Sin L-glutamina
DNasa I de páncreas bovino	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Colagenasa tipo IV	Gibco (por Life technologies)	17104-019
Suero fetal bovino	Gemini Bioproductos	100-106
Gentamicina 50 mg/ml	Calidad biológica	120-098-661EA Pluma
Strep	Gibco (por Life technologies)	15140-122
L-Glutamina	Gibco (por Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Calidad biológica	351-027-721EA
Tubos de 50 ml	Corning	352070	Polipropileno, estéril
70 μ Filtros de células M	Corning	352350
Placas de Petri	Corning	351029	Tubos
FACS estériles de 5 ml	Corning	352052	estéril
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Contiene solución de brefeldina A
Forbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Ionomicina Sal de calcio	Sigma-Aldrich	13909
Saponina de corteza de quillaja	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Kit de manchas de células muertas Aqua reparable	Life Technologies	L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-Mouse IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-Mouse IFN-γ PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-Mouse CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-Mouse CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-Mouse CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-Ratón CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-Ratón TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-Ratón Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-Ratón Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104