El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

Resumen

Hemos establecido una técnica para el aislamiento, la caracterización fenotípica y análisis funcional de células inmunes de encía murino.

Resumen

Las redes de células inmunitarias en los tejidos desempeñan un papel vital en la mediación de la inmunidad local y en el mantenimiento de la homeostasis tisular, sin embargo, se sabe poco de las poblaciones de células inmunitarias residentes en la mucosa oral y la encía. Hemos establecido una técnica para el aislamiento y estudio de células inmunitarias de tejidos gingivales murinos, un área de exposición microbiana constante y un sitio vulnerable a una enfermedad inflamatoria común, la periodontitis. Nuestro protocolo permite una caracterización fenotípica detallada de las poblaciones de células inmunitarias que residen en la encía, incluso en estado estacionario. Nuestro procedimiento también produce suficientes células con alta viabilidad para su uso en estudios funcionales, como la evaluación de la secreción de citocinas ex vivo. Esta combinación de caracterización fenotípica y funcional de la red de células inmunitarias gingivales debería ayudar a investigar los mecanismos implicados en la inmunidad oral y la homeostasis periodontal, pero también permitirá avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la inmunopatología local.

Introducción

Tejidos gingivales rodean la dentición humana y murina y están constantemente expuestos al complejo biofilm del diente ^1. La red de células inmunes la vigilancia de la barrera gingival es vital para mantener la integridad del tejido, asegurando homeostasis con los microbios comensales locales y, al mismo tiempo, proporcionando una inmunidad eficaz contra el desafío patogénico ^2. Para lograr la homeostasis, el sistema inmunológico está cuidadosamente adaptada al entorno gingival creación de una red de células inmunes altamente especializado, sin embargo, poco se conoce el detalle de las poblaciones de células inmunes gingivales y su papel en el mantenimiento de la inmunidad tisular ^2.

Cuando se interrumpe la homeostasis inmune en la encía, ya sea mediante el aumento de la susceptibilidad y / o presencia de comunidades microbianas dysbiotic, una condición inflamatoria del huésped, surge la periodontitis ^{3 4.} La periodontitis es una enfermedad inflamatoria común, lo que lleva a la pérdida del diente sPOYO estructuras. En sus formas severas se observa en aproximadamente el 10% de la población general ^5. La disección de los factores clave implicados en la susceptibilidad periodontitis y la progresión ha sido difícil ^6. Sin embargo, los modelos animales han sido extremadamente útiles en la comprensión de los mecanismos de iniciación y progresión periodontitis ^7. Los modelos pueden ser empleados para definir las poblaciones de células y mediadores moleculares clave que son vitales para el mantenimiento de la homeostasis inmune y el desarrollo de la unidad de la periodontitis. Tal visión va a transformar nuestra comprensión del control-encía específica de la homeostasis inmune y mejorar nuestra comprensión actual de la patogénesis de la enfermedad.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales descritos en este protocolo siguen las pautas requeridas y fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo, NIDCR / NIH.

1. Prepárese por adelantado

1. Preparar medio completo: RPMI suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina y 10% de FBS.
2. Preparar medios DNasa: 50 ml de medio RPMI suplementado con 7,5 mg de DNasa (Haga fresco, mantener en hielo en todo momento).
3. Preparar los medios de colagenasa-DNasa: 5 ml de medio DNasa más 3,2 mg / ml de colagenasa tipo IV (Haga fresco, mantener en hielo en todo momento).
4. Pre-cool tampón FACS: 0,5% de SFB diluido en PBS.
5. centrifugadora pre-enfriamiento a 4 ° C.
6. agitador incubadora caliente a 37 ° C.

2. El aislamiento, la disección y aislamiento de células gingivales de los bloques

1. La eutanasia a los ratones mediante la exposición a CO ₂ en una cámara apropiada, según las directrices de ARAC.
2. Abra la cavidad torácica y abdominal para exponer el corazón y los órganos internos. Para perfundir, hacer una incisión en la vena cava inferior y perfundir 3 ml de PBS a través del ventrículo izquierdo con una jeringa de 3 ml con una aguja de 27 G.
3. Inmovilizar el cuerpo y la cabeza del ratón sobre un cojín con el estómago hacia arriba.
4. Cortar cada comisura del labio hacia el cuello con unas tijeras, separando la piel que cubre la región de la mandíbula y el cuello, la exposición de los tejidos y los músculos subyacentes. Diseccionar el labio inferior para descubrir la mandíbula.
5. Corte entre los incisivos inferiores para separar ambos lados de la mandíbula e inmovilizar cada lado para acceder a la cavidad oral.
6. Visualizar y analizar el paladar lejos de la cavidad nasal.
7. Diseccionar áreas utilizando una cuchilla 10 e incluyen áreas molares maxilares y mandibulares y la zona gingival (Figura 1). Hacen incisiones verticales, justo por delante del primer molar y posterior al tercer molar y una incisión horizontal enel borde de la encía (blanco cuello de los dientes adyacentes de tejido).
8. Coloque el maxilar y mandibular bloques en un tubo cónico de 50 ml con 5 ml de colagenasa / DNasa (mantener en hielo).
9. Incubar en un incubador agitador a 37 ° C durante 1 hora y durante el último 5 min de incubación se añaden 50 l de 0,5 M EDTA.
10. Añadir 5 ml de medio de DNasa frío al tubo de 50 ml con los tejidos y agitar suavemente para mezclar.
11. La transferencia de los 4 bloques de tejido en una placa de Petri y cubrir con 500 l de DNasa medios. Eliminar encía de cada bloque de tejido, utilizando una hoja de bisturí y apuntando la hoja en las áreas gingivales y interdentales.
12. La transferencia de los tejidos y los medios de comunicación de la placa de Petri, así como los medios de comunicación de DNasa anteriores utilizados durante la disección, a un nuevo tubo de 50 ml a través del filtro de células (70 micras de tamaño). Lavar con medios DNasa (3-5 ml) todos los instrumentos utilizados y filtro.
13. Usando el émbolo de una jeringa estéril de 3 ml, triturar el tejido contra el colador,filtración con medios DNasa frío (30 a 35 ml).
14. Lavar el filtro de células con DNasa medios frío.
15. Centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 6 min.
16. Descartar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de medio completo.
17. Recuento de células (la cantidad esperada debe oscilar entre 8 x 10 ^{5 a 1,2} x 10 ⁶ células con una viabilidad de> 80%) usando un contador de células automatizado.

3. Estimulación y FACS La tinción de las células de la encía

1. Estimular la suspensión de células individuales con PMA (50 ng / ml) e ionomicina (2,5 g / ml) en presencia de 1 l / ml de Brefeldina A.
2. Incubar durante 3,5 horas a 37 ° C y _5% de CO2.
3. Centrifugar y lavar con PBS y centrifugar a 4 ° C; 314 xg durante 6 minutos.
4. Tinción de las células utilizando una mancha viabilidad siguiendo las instrucciones del fabricante.
5. Mancha de marcadores extracelulares (CD45, TCRγδ, TCR, CD4, CD8, TCRγδ o de hormigasibodies de elección) siguiendo las instrucciones del fabricante.
6. Se lavan las células con tampón frío FACS y centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
7. vórtice suavemente para perturbar el sedimento celular.
8. Fijar las células con 2% de paraformaldehído durante 20 min a temperatura ambiente.
9. Se lavan las células con tampón frío FACS, se centrifuga a 4 ° C, 314 xg durante 5 min y las manchas para citoquinas intracelulares.
   1. Llenar los tubos FACS con una solución de frío saponina 0,5% diluido en tampón de FACS y se centrifuga a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
   2. Añadir 300 l de solución de saponina 0,5% a los tubos de FACS, se incuba durante 15 min en la oscuridad a 4 ° C y centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
   3. Teñir las células para marcadores intracelulares (IL-17A y IFN o citocinas de elección) siguiendo las instrucciones del fabricante. Lavar las células con solución de saponina 0,5% y centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
   4. Lavar a continuación con FACStampón y se centrifuga a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
   5. Volver a suspender las células en 300 l de tampón FACS.
10. Analizar los resultados en un citómetro de flujo.

4. Análisis de Citometría de Flujo

1. visualizar las células a analizar en adelante (FSC) y dispersión lateral (SCC) y la puerta para excluir los desechos.
2. Seleccionar celdas individuales con área de dispersión frontal (FSC-A) vs. parámetros de altura (FSC-H).
3. Células de puertas que son en vivo (como se indica por la tinción de viabilidad) y positivos para el marcador hematopoyéticas CD45 ⁺ para el análisis adicional (Figura 2A y 2C).
4. Continuar el análisis de marcadores específicos como se muestra en la Figura 2 y la Figura 3.

Resultados

Para ilustrar la aplicación del protocolo, mostramos los resultados representativos que examinan la red de células inmunes en la encía de los ratones con y sin periodontitis (WT vs. LFA ^{- / -,} Figura 2A - C). FACS representativos gráficos muestran células CD45 ⁺ hematopoyéticos vivos en la encía (Figura 2A, 2C). El aislamiento y la transformación de las células inmunes con este protocolo da suficien...

Discusión

La técnica actual produce con éxito un gran número de células inmunes (de un solo ratón) adecuado, no sólo para la caracterización fenotípica, sino también para estudios funcionales ex vivo. Otro grupo había publicado previamente un protocolo para aislar y caracterizar células inmunes gingivales murino y se introduce el valor de la utilización de la citometría de flujo multicolor en el estudio de la periodontitis en modelos animales ^9. Tras la resolución de problemas considerables la modificación cla...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tijeras finas	Herramientas de ciencia fina	14058-11
Mango de bisturí #3	Herramientas de ciencia fina	10003-12
Hojas de bisturí #10	Herramientas de ciencia fina	10010-00	Pinzas de astilla estériles
	Integra Miltex	6-304
Agujas con bisel regular	BD Medical	305109	27 G, 12,7 mm de longitud
Jeringas Monoject	Covidien 8881513934		Punta Luer-lock, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Sin Calcio y Magnesio
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Sin L-glutamina
DNasa I de páncreas bovino	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Colagenasa tipo IV	Gibco (por Life technologies)	17104-019
Suero fetal bovino	Gemini Bioproductos	100-106
Gentamicina 50 mg/ml	Calidad biológica	120-098-661EA Pluma
Strep	Gibco (por Life technologies)	15140-122
L-Glutamina	Gibco (por Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Calidad biológica	351-027-721EA
Tubos de 50 ml	Corning	352070	Polipropileno, estéril
70 μ Filtros de células M	Corning	352350
Placas de Petri	Corning	351029	Tubos
FACS estériles de 5 ml	Corning	352052	estéril
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Contiene solución de brefeldina A
Forbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Ionomicina Sal de calcio	Sigma-Aldrich	13909
Saponina de corteza de quillaja	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Kit de manchas de células muertas Aqua reparable	Life Technologies	L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-Mouse IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-Mouse IFN-γ PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-Mouse CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-Mouse CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-Mouse CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-Ratón CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-Ratón TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-Ratón Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-Ratón Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104