Artículo de método

Inmunotinción fosfo-epítopos en ciliadas Órganos de todo el montaje embriones de pez cebra

DOI:

10.3791/53747

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19 de febrero de 2016

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1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

En este artículo

Resumen

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Se describen las técnicas de inmunotinción fosfo-epítopos en embriones de pez cebra enteros y luego llevar a cabo la localización de dos colores confocal de fluorescencia en las estructuras celulares tan pequeños como los cilios primarios. Las técnicas para la fijación y formación de imágenes pueden definir la ubicación y la cinética de la aparición o la activación de proteínas específicas.

Resumen

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La rápida proliferación de las células, la expresión específica de tejido de genes y la aparición de las redes de señalización caracterizan el desarrollo embrionario temprano de todos los vertebrados. La cinética y la ubicación de las señales - incluso dentro de las células individuales - en el embrión en desarrollo complementa la identificación de genes de desarrollo importantes. técnicas de inmunotinción se describen que se han demostrado para definir la cinética de señales intracelulares y animales enteros en estructuras tan pequeñas como cilios primarios. Las técnicas de fijación, de imágenes y procesamiento de imágenes utilizando un microscopio compuesto confocal de escaneo láser se puede completar en tan sólo 36 horas.

El pez cebra (Danio rerio) es un organismo deseable para los investigadores que buscan llevar a cabo estudios en una especie de vertebrados que es asequible y relevante para las enfermedades humanas. knockouts o caídas genéticos deben ser confirmadas por la pérdida de la proteína producto real. Dicha confirmación de la pérdida de proteínasse puede lograr usando las técnicas descritas aquí. Pistas sobre las vías de señalización también se pueden descifrar mediante el uso de anticuerpos que son reactivos con proteínas que han sido modificados después de la traducción mediante fosforilación. Preservar y optimizar el estado fosforilado de un epítopo tanto, es crítico para esta determinación y se logra mediante este protocolo.

Este estudio describe las técnicas para solucionar los embriones durante las primeras 72 h de desarrollo y co-localizar una variedad de epítopos relevantes con los cilios en la vesícula Kupffer (KV), el riñón y el oído interno. Estas técnicas son sencillas, no requieren de disección y se puede completar en un período relativamente corto de tiempo. Proyección de pilas de imágenes confocal en una sola imagen es un medio útil para la presentación de estos datos.

Introducción

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Las técnicas descritas aquí son el resultado de estudios que han buscado definir objetivos posteriores de las señales de Ca2+ durante eventos que ocurren durante el desarrollo temprano, incluyendo la fertilización, la gastrulación, la somitogénesis y la formación del tronco, ojo, cerebro y órganos. 1-3 Los descubrimientos originales de la señalización embrionaria de Ca2+ dependieron del uso de indicadores naturales y modificados de Ca2+, como la aequorina4 y la fura-2. 5 Incluso con la tecnología actual, la detección de elevaciones transitorias de Ca2+ requiere herramientas analíticas engorrosas y no revela los objetivos de dichas señales de Ca2+.

Este laboratorio investiga las señales de Ca2+ que actúan a través de la proteína quinasa (multifuncional) dependiente de Ca2+/calmodulina conocida como CaMK-II, una enzima que está enriquecida en el sistema nervioso central y originalmente identificada como un regulador de la potenciación a largo plazo. 6 El CaMK-II no es específico del cerebro, se expresa ampliamente y se conserva en gran medida a lo largo de toda la vida y los cuerpos de las especies de todo el reino animal, incluidos los invertebrados. 7,8 CaMK-II tiene la capacidad única de mantener su propia actividad incluso después de que los niveles de Ca2+ hayan disminuido debido a su capacidad para autofosforilar a Thr287. En este estado autofosforilado, el CaMK-II permanece activo de forma independiente del Ca2+/CaM, hasta que se desfosforila. 6 Por lo tanto, la localización de CaMK-II fosforilado (Thr287) puede identificar células en las que se han producido elevaciones naturales y relevantes de Ca2+.

Un anticuerpo contra el CaMK-II de mamíferos autofosforilados (P-Thr287) ha sido bien caracterizado y se utilizó inicialmente para localizar el CaMK-II activado en el tejido cerebral. 9 El pez cebra (Danio rerio) tiene siete genes CaMK-II10,11 cuyos productos proteicos contienen una secuencia de MHRQE[pT287]VECLK en esta región. 10,11 Esta secuencia es muy similar al antígeno fosfopéptido utilizado para crear este anticuerpo policlonal de conejo (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) y, por lo tanto, no fue una completa sorpresa que este anticuerpo reaccionara de forma cruzada con el pez cebra CaMK-II. Este laboratorio demostró que este anticuerpo reacciona con el CaMK-II del pez cebra en proporción a la autofosforilación y a la actividad independiente de Ca2+/CaM. 12 También se ha demostrado que los anticuerpos CaMK-II panespecíficos adicionales reaccionan de forma cruzada con el CaMK-II del pez cebra. 13

Este anticuerpo se ha utilizado para demostrar que el CaMK-II del pez cebra se activa preferentemente en las células de un lado de la vesícula de Kupffer (KV) del pez cebra, el órgano ciliado necesario para el establecimiento de la asimetría izquierda/derecha. 12 Este anticuerpo se utilizó para demostrar que el CaMK-II se activa transitoriamente en cuatro células adyacentes en el lado izquierdo del KV durante exactamente la misma fase de desarrollo en la que se determina la posición del órgano. 12 Además de la vesícula de Kupffer (KV), la autofosforilada (P-T287) también se localizó en sitios intracelulares específicos en otros tejidos ciliados, incluidos el riñón, los neuromastos y el oído interno. 12,13 En el riñón del pez cebra, P-T287-CaMK-II está enriquecido a lo largo del borde apical de las células ductales ciliadas y dentro de los cilios cloacales donde influye en su ensamblaje. 13 Finalmente, en el oído interno en desarrollo, P-T287-CaMK-II se concentra intensamente en la base de los cilios e influye en la diferenciación celular a través de la vía de señal Delta-Notch. 14 En resumen, la detección de CaMK-II activado ha identificado sitios de liberación intracelular de Ca2+ e iluminado posibles nuevas vías de señalización.

Estos descubrimientos dependieron completamente del desarrollo de un método sensible y preciso para localizar CaMK-II activado (P-T 287-autofosforilado). Se describen los métodos para fijar e inmunoteñir el pez cebra KV, el riñón y el oído interno. También se describen las limitaciones de esta técnica. Estas técnicas deberían ser útiles para cualquier investigador que busque obtener imágenes de alta resolución en dos canales fluorescentes no solo de fosfoepítopos, sino de cualquier epítopo, durante el desarrollo temprano de los vertebrados.

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Protocolo

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Los procedimientos de pez cebra en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia Commonwealth.

1. Preparación de los reactivos

  1. PFA al 4% / PBS. Pesar 8 g de paraformaldehído (PFA) en la campana de humos. Aunque todavía en la campana de humos, se disuelve el PFA seco en ~ 80 ml ​​de H 2 O destilada con agitación y calentamiento a 50 ° C. Mientras se agita, añadir 3 - 10 gotas de NaOH 1N fresco hasta PFA se haya disuelto completamente y la solución se aclara. Retirar del fuego y añadir 100 ml de solución salina tamponada 2x con fosfato (PBS). Se ajusta el volumen a 200 ml con H2O destilada Enfriar a ta y confirmar pH de 7,4 antes de su uso. Almacenar en la oscuridad a 4 ° C, pero el uso dentro de una semana.
  2. Utilizar el 100% de metanol sin ningún tipo de suplementos. Utilizar etanol al 95% sin ningún tipo de suplementos.
  3. Preparar tamponada con fosfato Tween (PBT). Suplemento solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,1% de Tween-20. Añadir 0.5 ml de una solución de Tween-20 de la 20% a 100 ml de 1x PBS. Almacenar a temperatura ambiente.
  4. Preparar tamponada con fosfato Triton-X (PbTx). Suplemento PBS con 0,1% de Triton X-100. Añadir 0,5 ml de un 20% de Triton X-100 en el almacén a 100 ml de PBS. Almacenar a temperatura ambiente.
  5. Preparar 10% NGS / PbTx. suero de cabra (NGS) bloquea normales sitios de unión no específicos. NGS almacenar en alícuotas a -20 ° C. Para utilizar, añadir 1 ml a 9 ml PbTx.
  6. Preparar 50% de glicerol / PBS. Mezcle partes iguales de fondo 2x PBS y 100% de glicerol. Almacenar a temperatura ambiente.

2. Fijación de embriones

  1. . (. Por ejemplo, β-actina: CAAX-GFP) Obtener la cría de tipo salvaje (AB y Wik) o transgénicos embriones a través de la monta natural. Si se desea, inyectar embriones con constructos o morfolinos, como se describe 15,16.
  2. Elevar embriones. Recoger los embriones y se incuba a 28,5 ° C en presencia de 0,003% de 1-fenil-2-tiourea (PTU) para bloquear la pigmentación como se describe. 17 p>
  3. Fijar. Cuando los embriones han alcanzado la etapa de desarrollo deseado, 18,   anestesiar a los embriones utilizando MESAB, eliminar tanta agua como sea posible del sistema y añadir fresca PFA al 4% / PBS durante 3 - 4 horas a temperatura ambiente. NOTA: En tiempos de menos de 20 h después de la fecundación (HPF), antes de fijar dechorionation. A veces después de 20 hpf, dechorionate antes de la fijación utilizando dos pares de pinzas de punta fina bajo un microscopio de disección.
  4. Cambio de soluciones. Transferencia de embriones utilizando una amplia pipeta de diámetro interior, tal como se describe. 17 Cambio de soluciones en 1,5 ml tapados tubos de microcentrífuga, simplemente permitiendo que los embriones se asienten por gravedad y sin centrifugación.
  5. Después de post-fijador. 3 - 4 horas, retire PFA / PBS, reemplace con metanol al 100% y se almacena a -20 ° C durante al menos 48 horas. NOTA: Para la máxima inmunorreactividad P-CaMK-II, limitar el tiempo total de almacenamiento de metanol a una semana.
"> 3. La inmunotinción Total embriones

  1. Coloque un mínimo de 10 embriones para cada condición experimental en cubiertas tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y etiquetarlos.
  2. Permitir que los embriones se asienten. Retirar y desechar el metanol y rehidratar con lavados progresivas que contiene 0,5 ml de concentraciones decrecientes de etanol, como se indica en el siguiente paso. Cada paso es un lavado de 5 min con agitación.
  3. Progresivamente rehidratar con estos 5 soluciones: 66% de etanol / 33% PbTx, 33% de etanol / 66% PbTx, 100% PbTx, 100% PbTx (esta es la primera repetición de PbTx), 100% PbTx (esta es la segunda repetición de PbTx).
  4. Retire último lavado PbTx. Añadir 0,5 ml de 10% NGS / PbTx. Incubar durante al menos 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave y luego retirar y desechar la solución.
  5. Preparar la solución de anticuerpo primario mediante la dilución en el 10% de NGS / PbTx. Si co-inmunotinción, utilice anticuerpo de afinidad más alta primero. Para este estudio, se incuba con el anticuerpo de la tubulina monoclonal de ratón anti-acetilado diluido 1: 500. Por ejemploe, si hay 10 muestras, combinar 6 l de la solución madre de anticuerpo con 3 ml de 10% NGS / PbTx y luego distribuir 0,3 ml de esta en cada tubo.
  6. Añadir 0,2 - 0,5 ml del anticuerpo primario diluido a cada tubo para sumergir todos los embriones. Incubar con suave O / N de balanceo a temperatura ambiente.
  7. Por la mañana, retirar y desechar la solución de anticuerpo. Añadir 0,5 ml de 2% NGS / PbTx para quitar el exceso de anticuerpo primario. Agite suavemente durante 5 minutos. Retire y deseche la solución. Repetir dos veces.
  8. Dim las luces del techo y diluir el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia apropiada en el 10% de NGS / PbTx de manera que cada condición contiene al menos 0,5 ml. Con el anticuerpo primario anti-tubulina de ratón acetilado, utilizar el colorante fluorescente verde cabra anti-IgG de ratón en una dilución 1: 500.
  9. Incubar anticuerpo secundario durante 4 h con agitación suave a temperatura ambiente en la oscuridad. A partir de ahora, se procesan las muestras bajo las luces se apagaron y se incuban en un recipiente oscuro o envolviéndolos en papel de aluminio.
  10. Al final de la incubación, retirar y desechar la solución de anticuerpo secundario. Añadir 0,5 ml de 2% NGS / PbTx para lavar. Agite suavemente durante 5 minutos. Retire y deseche la solución. Repetir dos veces.
  11. Si co-inmunotinción, obtener el segundo anticuerpo primario de una especie diferente que el primer anticuerpo primario. En estos estudios, seguir el anticuerpo CaMK-II de conejo anti-fosfo por el tinte conjugado de cabra anti-IgG de conejo anticuerpo secundario rojo fluorescente.
  12. Diluir conejo anti-fosfo-II CaMK anticuerpo 1:20. Para cada tubo de embriones, suspender en 0,3 ml 10% NGS / PbTx, a continuación, añadir 15 l de la solución madre de anticuerpo.
  13. Asegúrese de que los embriones se sumergen y luces se atenúan. Incubar con suave balanceo O / N a temperatura ambiente en la oscuridad.
  14. Por la mañana bajo luces tenues, retirar y desechar la solución de anticuerpo. Añadir 0,5 ml 2% NGS / PbTx. Agite suavemente durante 5 minutos. Retire y deseche la solución. Repetir dos veces.
  15. Mantenga las luces del techo tenue y diluir lo suficiente de la fluorescencia apropiada conjuanticuerpo secundario cerrada de modo que cada condición contiene al menos 0,5 ml. En este estudio, se diluye el colorante conjugado de cabra anti-conejo IgG anticuerpo rojo fluorescente secundario (canal rojo) 1: 500 en 10% NGS / PbTx.
  16. Incubar segundo anticuerpo secundario durante 4 h con agitación suave a temperatura ambiente en la oscuridad.
  17. Al final de esta incubación y bajo luces tenues, retirar y desechar la solución de anticuerpo secundario. Añadir 0,5 ml PbTx. Agite suavemente durante 5 minutos. Retire y deseche la solución. Repetir dos veces. Tienda, ya sea en PbTx o 50% de glicerol / PBS, dependiendo del procedimiento de formación de imágenes.

4. Imagen confocal y Procesamiento

  1. Monte embriones para la imagen. Coloque 1 - 5 embriones en un portaobjetos de vidrio. Crear una cámara entre el cubreobjetos y el portaobjetos principal utilizando fragmentos cubreobjetos en cada lado de la cámara. Típicamente, cuatro # 1 cubreobjetos se utilizan para hacer estas pilas spacer sin sellar.
    NOTA: No es necesario un medio de montaje.
  2. Use un aceite de inmersión 100Xobjetivo de poner solo embrión en el foco con luz transmitida. Apaga la luz. Encienda el microscopio confocal. Asegurarse de que los láseres apropiados (verde y / o rojo) se enciende y se accessary enfoque remoto está empeñada.
  3. Encienda el programa confocal. En la "barra Adquirir," seleccionar el objetivo adecuado. En la barra de "XY Básica", establecer el tamaño de la imagen para 1024 haciendo clic en el botón de 1.024.
  4. En el "láser y el detector" barra, haga clic en el cuadro 488 de color rojo y verde de la caja 568 para activar el láser y el detector para cada canal. Conjunto del agujero de alfiler a medio y ajustar la ganancia en la barra de "ganancia" de cada canal de visualizar.
  5. En el bar "Adquirir Configuración", haga clic en "vivo" para iniciar la adquisición de imágenes. En la barra de "Configuración de la vista", desmarca la casilla "fuerza integral Zoom" para el centro de la ventana "en vivo".
  6. En la barra de "Obtener configuración", en la pestaña "Z", el paso a través de las capas de la imagen. Después de seleccionar el numbre de secciones ópticas para incorporar en la imagen, se mueve a un punto en el "centro" del plano z.
  7. En la pestaña "Z", haga clic en el cuadro pequeño "de referencia" de color rojo. Esto cero la RFA en el punto elegido como el "centro". En la casilla "Tamaño Paso", seleccionar el espesor de las capas (entre 0,25 micras y 2,0 micras es lo ideal). Prestar atención a la casilla "Tamaño de archivo" y tratar de limitar a 1 GB.
    NOTA: Por lo general, hasta 40 secciones ópticas de 0,5 a 1,0 micras se obtienen, pero el número de secciones puede ser determinada empíricamente.
  8. Para encontrar el extremo superior de la imagen, haga clic en el círculo al lado de "Inicio" y moverse a través de las capas z. Ahora haga clic en el círculo al lado de "inferior", el equipo tomará la imagen a la capa como el centro. moverse de nuevo a través de las capas de encontrar el extremo inferior de la imagen.
  9. Haga clic en "Live" de nuevo en el "Obtener parámetros del" cuadro para detener el láseradquisición. En este panel, haga clic en las casillas de rojos marcados media y Z-pila. Estas cajas se volverá verde.
  10. En el cuadro "Obtener parámetros", haga clic en "Single" para adquirir la serie completa de imágenes. Usted puede controlar el progreso ya que revisa en ambos canales ya través de todo el z-pila.
  11. Para guardar, haga clic en la ventana del volumen y haga clic en "guardar como" y el nombre del archivo. Guardar como un archivo ".ids". Para hacer que el archivo de volumen mientras que el z-pila está todavía abierta, seleccione el menú desplegable de datos y haga clic en "volumen de render". Guarde el archivo renderizado como un archivo TIFF. Esta es la imagen proyectada que se muestran en esta publicación.

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Resultados

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Condiciones óptimas para la visualización de fosfo-epítopos

Métodos que describen la inmunolocalización de epítopos de proteínas en embriones de pez cebra han sido relativamente escaso en comparación con aquellos para la localización de los ARNm mediante hibridación in situ. Los agentes de fijación utilizados en la localización de los epítopos de la proteína en las células ciliadas de embriones de pez...

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Discusión

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El método / metanol PFA fue desarrollado en este laboratorio con el objetivo principal de la optimización de la inmunolocalización de la fosfo-T 287 -CaMK-II epítopo durante el desarrollo de pez cebra. Este método localiza con éxito P-CaMK-II durante la formación de varios órganos incluyendo el ciliadas KV pez cebra, 12 oído interno 14 y el riñón. 13 En particular, en la etapa de KV, esta técnica era necesario. El éxito de este método es probablemente debido a una combinación ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la beca de la Fundación Nacional de Ciencia IOS-0817658.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-fenil-2-tiourea (PTU)SigmaP-76290,12% Solución madre. Diluir 1:40 en agua del sistema
Alexa488 anti-ratón IgGLife TechnologiesA11001Cabra policlonal, uso a 1:500
Alexa488 anti-conejo IgGLife TechnologiesA11008Cabra policlonal, uso a 1:500
Alexa488 faloidinaLife TechnologiesA12379Se une preferentemente a F-actina
Alexa568 anti-ratón IgGLife TechnologiesA11004Policlonal de cabra, uso a 1:500
Alexa568 anti-conejo IgGLife TechnologiesA11011Policlonal de cabra, uso a 1:500
antiacetilado α-tubulinaSigmaT7451Monoclonal de ratón, uso a 1:500
anti-fosfo-T287 CaMK-IIEMD Millipore06-881Policlonal de conejo, uso a 1:20
anti-total CaMK-IIBD Biosciences611292Monoclonal de ratón, uso a 1:20
Etanol FisherS96857Grado de laboratorio, 95% desnaturalizado
Pinzas FineScience Tools11252-20Dumont #5
Cubreobjetos de vidrioVWR16004-330#1  espesor
Portaobjetos de microscopio de vidrioFisher12-550-15Portaobjetos de vidrio estándar
MetanolFisherA411Almacenar en el congelador
Tubos de microcentrífugaVWR20170-038Tubos tapados, no estériles
Suero de cabra normalLife Technologies16210-064Tubos alícuotas de 1 ml, almacenar en el congelador
ParaformaldehídoSigmaP-6148Grado reactivo, cristalino
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Calidad Biológico119-069-13110x solución madre o hecha en laboratorio
Triton X-100SigmaBP-151solución al 10% en agua, almacenar en RT
Tween-20Life Technologies85113al 10% en agua, almacenar en RT
Microscopio compuestoNikonE-600Montaje en mesa sin vibraciones
C1 Plus escaneo confocal de dos láseresNikonC1 PlusEjecutado por el programa EZ-C1, pero las actualizaciones usan " Elementos"
solución

Referencias

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