Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de las secuencias reductoras de glicosil extremo (RE) e interno de los heteroxilanos mediante el marcaje del RE con 2 aminobenzamida antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa) y luego el análisis de los oligosacáridos resultantes mediante espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).
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Artículo de método
La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas
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Resumen
Resumen
Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización de la reducción final (RE) y la secuencia de glicosilo región interna (s) de heteroxilanos. Paredes celulares del endospermo de trigo De almidonadas-se aislaron como un residuo de alcohol insoluble (AIR) 1 y secuencialmente se extrajo con agua (W-sol Fr) y 1 M KOH conteniendo 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) como se describe por Ratnayake et al. (2014) 2. Se adoptaron dos enfoques diferentes (véase el resumen en la Figura 1). En el primero, intactos AXs W-sol se tratan con 2AB para etiquetar el RE columna vertebral residuo original de azúcar de cadena y luego tratados con una endoxilanasa para generar una mezcla de RE 2AB marcado y la región interna reducir oligosacáridos, respectivamente. En un segundo enfoque, el Fr KOH-sol se hidroliza con endoxilanasa para generar primero una mezcla de oligosacáridos que posteriormente se etiquetan con 2AB. Los liberados enzimáticamente (ONU) (etiquetados) oligosacáridos de ambosW- y los PP KOH-sol son entonces metilado y el análisis estructural detallado tanto de los oligosacáridos nativos y metilados se realiza utilizando una combinación de MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS y ESI-MS n. Endoxilanasa digerido KOH-sol AXs también se caracterizan por resonancia magnética nuclear (RMN), que también proporciona información sobre la configuración anomérica. Estas técnicas se pueden aplicar a otras clases de polisacáridos utilizando las endo-hidrolasas adecuadas.
Introducción
Heteroxilanos son una familia de polisacáridos que son los polisacáridos no celulósicos predominantes de las paredes primarias de gramíneas y las paredes secundarias de todas las angiospermas 3-6. Las cadenas principales de xilano difieren en sus tipos y patrones de sustitución con glicosil (ácido glucurónico (GlcA), arabinosa (Araf)) y los residuos en función del tipo de tejido, el grado de desarrollo y las especies no-glicosil 7 (O-acetilo, ácido ferúlico).
Paredes de trigo (Triticum aestivum L.) endospermo se componen principalmente de arabinoxilanos (AXs) (70%) y (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanos (20%) con cantidades menores de celulosa y heteromannans (2% cada uno) 8. La cadena principal de xilano puede ser diversamente un-sustituido y predominantemente mono-sustituido (principalmente O-2 posición y en menor medida O-3 posición) y (O-2 y O-3 posiciones) con α-L-Ara di-sustituido residuos de F 9. El extremo reductor (RE) de heteroxilanos de dicotiledóneas (por ejemplo, de Arabidopsis thaliana) 10 y gimnospermas (por ejemplo, el abeto (Picea abies)) 11 contiene una secuencia característica tetrasacárido glicosilo; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Para entender la biosíntesis y la función (biológica y industrial) heteroxilano, es importante para secuenciar completamente la columna vertebral de xilano entender los tipos y los patrones de sustituciones, así como la secuencia del extremo reductor (RE).
Las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de la reducción final (RE) y la secuencia de glicosilo región interna (s) de heteroxilanos se describen en este manuscrito. Las técnicas se basan en el etiquetado de fluoróforo (con 2 aminobenzamida (2AB)) el extremo reductor (RE) de la cadena heteroxilano antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa). Este enfoque, en particular para la secuenciación RE, eraprimero reportada por el laboratorio York 10,12-13 pero ahora se extiende para incluir la secuenciación región interna y es una combinación de las técnicas establecidas que es igualmente adaptable a todos los heteroxilanos independientemente de su fuente de aislamiento. Este enfoque también se puede aplicar a otras clases de polisacáridos usando (si está disponible) las endo-hidrolasas adecuadas.
En el presente estudio, las paredes de-almidonado celulares del endospermo de trigo se aislaron como un residuo de alcohol insoluble (AIR) y secuencialmente se extrajo con agua (W-sol Fr) y 1 M KOH conteniendo 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) como se describe en Ratnayake et al. (2014) 2. Los oligosacáridos liberados tanto de Frs KOH-sol W- y son entonces metilado y el análisis estructural detallado tanto de los oligosacáridos nativos y metilados se realiza utilizando una combinación de MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-acoplado con HPLC con el separación cromatográfica en línea usando una columna RP C-18y ESI-MS n. Endoxilanasa digerido KOH-sol AXs también se caracterizó por resonancia magnética nuclear (NMR).
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Protocolo
1. El etiquetado del extremo reductor (RE) Azúcar Residuo de la W-sol AXs con 2-aminobenzamida (2AB)
- Incubar W-sol AXs con 2AB (0,2 M) en presencia de 1 M NaBH 3 CN (cianoborohidruro de sodio) (pH 5,5) durante 2 horas a 65 ° C para convertir los extremos reductores de las cadenas de polisacárido de cadena principal a sus derivados fluorescentes.
PRECAUCIÓN: El siguiente paso se debe realizar en la campana de humos como NaBH 3 CN libera gas cianuro venenoso cuando está en contacto con el agua.- Pesar NaBH 3 CN (62,8 mg) y disolver en agua (1 ml) en un tubo de microcentrífuga (1,5 ml) para preparar una solución 1 M NaBH 3 CN. Disolver reactivo 2AB (27,2 mg) en una solución 1 M NaBH 3 CN (1 ml) por calentamiento a 65 ° C y ajustar el pH de la mezcla de reacción (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) a pH 5,5 con ácido acético al 10%.
- Añadir 200 l de mezcla de reacción (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) para W-sol AXs (1 mg) en un tubo de vidrio con una tapa y se mezclan usando un mezclador de vórtice. Incubar durante 2 horas a 65 ° C en una campana de humos. Se enfría la suspensión a temperatura ambiente y añadir 4 vols. de etanol absoluto.
- Coloque la suspensión en un almacenamiento en frío (4 ° C) O / N para precipitar polisacáridos.
- Se centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) para eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento extensamente con etanol absoluto (4x), acetona (1 x) y metanol (1 x), centrifugando entre cada lavado. seca al vacío a 40 ° CO / N.
Nota: Lavado extenso también elimina 2AB residual.
2. Generación de xilo-oligosacáridos de 2 AB Etiqueta W-sol AXs
- Disolver 2AB etiquetado W-sol AXs (1 mg) en 500 l de tampón de acetato de sodio (100 mM, pH 5) en un tubo de microcentrífuga (1,5 ml). Añadir 4 unidades de endoxilanasa (GH 11, [M1]) y se incuba a 37 ° C durante 16 horas.
- Destruir la actividad de la enzima por calentamiento de las mixto de reacciónUre durante 10 minutos en un baño de agua hirviendo. Se enfría la suspensión a temperatura ambiente y transferir al tubo de vidrio con una tapa. Añadir 4 vols. de etanol absoluto y colocar la suspensión en un almacenamiento en frío (4 ° C) O / N para precipitar cualquier polisacáridos no digeridos.
- Se centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) para separar los polisacáridos no digeridos (pellet) y endoxilanasa generado xilo-oligosacáridos (sobrenadante). Decantar el sobrenadante en un tubo de vidrio limpio y colocarlo en un baño de agua caliente (40 ° C).
- Se evapora el etanol bajo una corriente de gas nitrógeno a un volumen punto final (~ 500 l). Congelar el sobrenadante a -80 ° C durante 4 horas y se seca el sobrenadante congelado en un liofilizador para recuperar xilo-oligosacáridos.
3. Generación de xilo-oligosacáridos de KOH-sol AXs y Etiquetado 2AB
- El tratamiento de KOH-sol AXs con endoxilanasa (GH 11, [M1]) para generar xilo-oligosacáridos como se describió anteriormente (secciones 2.1-2.4).
- Tratar a Endoxylanase genera xilo-oligosacáridos de KOH-sol AXs con la mezcla de reacción 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) como se describió anteriormente (secciones 1.1.1-1.1.2).
- Decantar el sobrenadante en un tubo de vidrio limpio y colocarlo en un baño de agua caliente (40 ° C). Se evapora el etanol bajo una corriente de gas nitrógeno a un volumen punto final (~ 500 l). Congelar el sobrenadante a -80 ° C durante 4 horas y se seca el sobrenadante congelado en un liofilizador para recuperar xilo-oligosacáridos.
4. MALDI-TOF-MS
- Preparación de la solución matriz de MALDI-
- Añadir una pequeña bola de 2, ácido 5-dihydroxbenzoic (DHB) a 50% de acetonitrilo (500 ml) que contenía ácido fórmico al 0,1% en un tubo (solución MALDI-matriz). Mezclar utilizando un vórtice, si se disuelve rápidamente, añadir otra cucharada pequeña de DHB. Nota: concentración ideal de la solución de MALDI-matriz es 10 g / l -1.
- Preparación de la placa de MALDI-objetivo
- Depositar el aqueonos oligosacáridos muestras (nativas) (5-10 mg) (W-sol y / o KOH-sol) sobre una placa MALDI-objetivo. Añadir la solución matriz de MALDI-0,3 l usando una punta separada y mezclar pipeteando arriba y abajo. Dejar que la mezcla se seque a temperatura ambiente.
Nota: Las muestras secadas correctamente deben consistir en cristales largos en forma de aguja apuntando hacia el centro de la mancha. Si el depósito es pegajoso y / o smeary la muestra puede ser o bien demasiado concentrada o consiste de sales, tales depósitos son poco probables para producir buena espectros y la muestra debe ser purificados adicionalmente. - Introducir la placa del objetivo en la fuente MS y operar en el modo de ion positivo (+ iva). Ajustar la tensión de acelerador a 19,0 kV en la fuente de iones de 1 y 16,3 kV en la fuente de iones 2. ajustar la potencia de láser para mayor que 70%. Seleccione el punto de la muestra en la placa de MALDI-objetivo y haga clic en inicio para comenzar disparos de láser.
Nota: Todas las zonas del objetivo no producirán señales. Un punto particular sólo dará una señal por unos disparos de láser, ya sea debido aagotamiento de la mezcla de muestra / matriz o las características del cristal.- Mueva el láser a diferentes áreas del objetivo durante la adquisición y el promedio de aproximadamente 200 espectros aleatorio para obtener señal-ruido satisfactoria.
- Depositar el aqueonos oligosacáridos muestras (nativas) (5-10 mg) (W-sol y / o KOH-sol) sobre una placa MALDI-objetivo. Añadir la solución matriz de MALDI-0,3 l usando una punta separada y mezclar pipeteando arriba y abajo. Dejar que la mezcla se seque a temperatura ambiente.
5. ESI-QTOF-MS
- Analizar oligosacáridos generados endoxilanasa-(nativo) usando nano-HPLC junto con una ionización por electrospray (ESI) Tiempo de cuadrupolo de vuelo por instrumentos (QTOF) MS con separación cromatográfica en línea utilizando un RP columna C-18 (75 micras x 150 mm; 3,5 micras del grano tamaño).
- Transfiera la mezcla de oligosacáridos acuosas generadas endoxilanasa-en un vial y el lugar en el muestreador automático de HPLC. Programar el gradiente de elución de 5 a 80% con las fases móviles 0,1% (v / v) de ácido fórmico en agua y 0,1% (v / v) de ácido fórmico en acetonitrilo, respectivamente, durante 60 min.
- Ajustar la velocidad de flujo de 0,2 l / min. Ajustar el modo de iones positivos en el rango de exploraciónde 300-1,600 m / z y a-velocidad de barrido de 0,5 exploraciones / segundo utilizando las condiciones de la fuente de ESI como sigue: gas cortina 10, GS1 4, temperatura de la fuente 100 ° C, la tensión de pulverización iónica 2.300 V, y de-la agrupación de potencial 50 V. Ejecutar el programa LC cromatográfico y oligosacáridos eluir. El cromatograma de iones totales resultante (TIC) se guarda automáticamente por el software.
- Abra el TIC guardado y seleccione cromatograma del extracto. Escriba las masas esperadas (por ejemplo, 271, 403, 535, 667, 799 y 931 m / z) en la línea de comandos. cromatograma de análisis haciendo clic Intro. Procesar las exploraciones de iones seleccionadas de los datos del cromatograma ESI-QTOF MS utilizando el software de acuerdo con las instrucciones del fabricante 14.
6. ESI-MS n
- Introduzca 1 a 2 l de oligosacárido per-O-metilado (metilado como se describe por Pettolino et al. 1) de muestra en 50% de acetonitrilo en una punta de nanopulverización usando una jeringa. Recortarla punta nano-pulverización utilizando un cortador de vidrio para encajar en el soporte de nano-aerosol discreto unido a la MS.
- Establecer la masa de acuerdo con el rango esperado de masas (200-1,500 m / z) y el gas de cortina a 10, tensión ionspray a 1.900 V y la polaridad de positivo.
- Pulse el botón ADQUISICIÓN para abrir la ventana correspondiente, introduzca el nombre del archivo de datos para obtener un escaneo total de iones (ESI-MS 1). A continuación, pulse el botón STOP.
- Cambiar el tipo de escaneo de iones producto a fragmentar un pico de interés. Ingrese la masa de interés (por ejemplo, 885 m / z) para fragmentar y ajustar el rango de masa (200-900 m / z). Pulse el botón adquirir y ajustar la energía de colisión (hacia arriba y / o hacia abajo en la pestaña compuesto) para conseguir toda la fragmentación del ion primario (885 m / z) y adquirir una exploración fragmento de iones (ESI-MS 2).
- Ingrese la masa del ión fragmento de interés (por ejemplo, 711 m / z) y ajustar el rango de masa (200-720 m / z). Presione el botón de adquirir unad ajustar la energía de colisión para lograr toda la fragmentación del ion precursor (711 m / z) y adquirir una exploración de iones fragmento (ESI-MS 3).
7. H 1 NMR Spectroscopy
- Disolver endoxilanasa generada mezcla de oligosacáridos (KOH-sol, forma nativa) (~ 500 g) en D2O (1,0 ml, 99,9%) en un tubo de ensayo de plástico (15 ml). Congelación de la suspensión a -80 ° C durante 4 horas y se seca la suspensión congelada en un liofilizador para recuperar xilo-oligosacáridos.
- Repetir dos veces 7.1 con el fin de intercambiar plenamente el H2O con D2O
- Disolver oligosacáridos secos en D2O (0,6 ml, 99,9%) y añadir 0,5 l de acetona (5% en D2O) como estándar interno. La transferencia de los oligosacáridos deuterados en el tubo de la muestra de RMN.
- Mantenga el tubo que contiene la muestra de RMN por la parte superior e insertar el tubo de muestra en una centrifugadora de plástico. Coloque el control de giro en el medidor de profundidad de la muestra. Push o tire del tubo de muestra para ajustar la profundidad de la muestra para asegurar que la línea central de la parte superior de la muestra y calibres de profundidad inferior son iguales.
- Retire el medidor de profundidad e inserte la muestra en el muestreador automático conectado a un espectrómetro de RMN de 600 MHz equipado con un crio-sonda.
- Inicio de sesión y el software de control espectrómetro abierta. Introduzca el nombre de archivo de ejemplo. Abrir una base de datos existente y luego utilizar el comando "EDC" para guardarlo con un nuevo nombre. Escriba el número de la posición de la muestra en el muestreador automático y pulse "ENTER".
Nota: Al pulsar el botón "ENTER" se reducirá el tubo de muestra suavemente a la cavidad del imán donde será colocado en la parte superior de la sonda. - Ajuste la temperatura de la muestra deseada escribiendo "edte" en la línea de comandos. Esperar a que la temperatura de la muestra para llegar al valor deseado antes de proceder al siguiente paso. Enter "bloqueo" en la línea de comandos y seleccione disolvente apropiado (D2O). Esperen al " bloquear mensaje de finalización "para aparecer en la parte inferior de la ventana.
- Tipo "ATMM" en la línea de comandos y haga clic en "optimizar" en la parte superior de la barra de menús ATMM. Elija Inicio de ajuste y adaptación de la sonda para el canal seleccionado (1 H en este caso).
- Tipo "topshim" en la línea de comandos para el proceso de calce en el que se hacen pequeños ajustes en el campo magnético hasta que el campo magnético uniforme se logra alrededor del sample.Acquire la señal escribiendo "ZG" en la línea de comandos y escriba.
- Analizar espectros utilizando el software 15 de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 1 desplazamiento químico H hace referencia a un estándar interno de acetona a 2,225 ppm.
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Resultados
Digestión endoxilanasa de 2AB-etiquetado W-sol AXs genera una mezcla de oligosacáridos RE 2AB marcado y una serie de oligosacáridos un-marcado (sin la etiqueta de 2AB) derivados de las regiones internas de la cadena de xilano (Figura 1; de Ratnayake et al. 2). se emplea luego una serie de enfoques cromatográficas para fraccionar el complejo de mezcla de isómeros. Por último, se utilizan técnicas MS para identificar las estructuras isoméricas que luego...
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Discusión
La mayoría de los polisacáridos de la pared celular de la fase de matriz han backbones aparentemente sustituido al azar (con tanto glicosilo y residuos no glicosilo) que son muy variable dependiendo de las especies de plantas, el grado de desarrollo y tipo de tejido 3. Desde polisacáridos son productos de los genes secundarios su secuencia no es plantilla derivada y por lo tanto no hay un enfoque analítico único, como el que existe para los ácidos nucleicos y proteínas, para su secuenciación. La disponibilida...
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue apoyado por fondos del Programa de Investigación Colaborativa Insignia de la Organización Científica y de Investigación de la Commonwealth, proporcionado al Clúster de Granos de Alta Fibra a través del Food Futures Flagship. AB también reconoce el apoyo de una subvención del Consejo de Investigación de Australia (ARC) al Centro de Excelencia en Paredes Celulares de Plantas (CE110001007).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2 aminobenzamida (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| borohidruro de sodio (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Peligroso, maneje con cuidado |
| cianoborohidruro de sodio (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Peligroso, manéjelo con cuidado |
| endo-1,4-β-Xilanasa M1 (de Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Óxido de deuterio (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Liofilizador (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1 y veces; 100 mm; 1.8 y micro; m tamaño de la cuenta) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Modelo - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Alemania) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Modelo # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - trampa de iones (Modelo # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Alemania | ||
| Topspin (versión 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Modelo # 7890B) | Agilent |
Referencias
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
- York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
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