Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Resumen

Para investigar las velocidades de flujo y la direccionalidad de la actina filamentosa en la sinapsis inmunológica de las células T, se combinan imágenes de superresolución de células vivas con fluorescencia de reflexión interna total y se cuantifican con espectroscopía de correlación de imágenes espacio-temporales.

Resumen

-Actina filamentosa juega un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, incluyendo la motilidad y, en las células inmunes, la formación de una interacción célula-célula clave conocida como la sinapsis inmunológica. F-actina También se especula que desempeñan un papel en la regulación de las distribuciones moleculares en la membrana de las células incluyendo la dinámica de vesículas sub membranosa y la agrupación de proteínas. Si bien las técnicas de microscopía de luz estándar permiten observaciones generalizadas y difracción de limitarse a realizar, muchos eventos celulares y moleculares, incluyendo clustering y el flujo molecular se producen en las poblaciones en longitud escalas muy por debajo de la capacidad de resolución del microscopio óptico estándar. Mediante la combinación de fluorescencia total reflexión interna con el súper resolución de imagen método estructurado iluminación microscopía, se registró el flujo molecular bidimensional de F-actina en la sinapsis inmunitaria de las células T. Espacio-temporal espectroscopia de correlación de imágenes (STICS) y luego se aplicó, que genera resul cuantificablets en forma de histogramas de velocidad y mapas vector que representa la direccionalidad del flujo y la magnitud. Este protocolo describe la combinación de las técnicas de imagen y STICS super-resolución para generar vectores de flujo a nivel sub-difracción de detalle. Esta técnica se utilizó para confirmar un flujo de actina que es simétricamente retrógrada y centrípeta lo largo de la periferia de las células T en la formación de sinapsis.

Introducción

El objetivo del experimento es a la imagen y caracterizar el flujo molecular de filamentous- (F-) de actina en las células T de estar, más allá del límite de difracción con el fin de establecer la dirección del flujo y la magnitud durante la sinapsis inmunológica (IS) formación. Esta técnica se llevará a cabo usando un microscopio de iluminación estructurada (SIM) en el modo de fluorescencia total reflexión interna (TIRF), la formación de imágenes de células T Jurkat que forman una sinapsis artificial sobre la activación cubreobjetos recubiertos con anticuerpos anti-CD28 anti-CD3 y. Las formas se encuentra entre una célula T y su objetivo; una célula presentadora de antígeno (APC) al receptor de células T (TCR) ^1,2 activación. Como este es el primer paso para determinar si el sistema inmune adaptativo genera una respuesta inmune a una infección, las consecuencias de la capacidad de respuesta a los estímulos incorrecta puede causar una serie de enfermedades. La importancia de la interacción de células T-APC está bien documentada, sin embargo, el papel (s) del madura es después si inicial TCRinternalización gnal son todavía ser plenamente comprendido.

Como se cree que el citoesqueleto para ayudar a dos procesos ligados a la activación de TCR (el movimiento de las moléculas en la membrana plasmática y el control de las moléculas de señalización dependientes de la actina del citoesqueleto ^3,4), la comprensión de cómo el citoesqueleto reorganiza espacial y temporalmente se dilucidar los pasos de la reorganización molecular durante la formación de sinapsis. Se cree que el flujo retrógrado de F-actina de corral racimos de TCR hacia el centro de la sinapsis inmunológica, se cree que esta translocación a ser vital para dejar de señal y el reciclado; ayudar al delicado equilibrio de la activación de las células T ^5.

Mientras que la microscopía de fluorescencia estándar es una herramienta flexible que sigue ofreciendo una visión sobre muchos eventos biológicos, incluyendo interacciones célula-célula, está limitado por la capacidad del sistema para resolver con precisión múltiples fluoróforos que residen más cerca que el diffrlímite de acción (≈200 nm) uno del otro. Como muchos eventos moleculares dentro de las células involucran poblaciones densas de moléculas y exhiben reordenamiento dinámico, ya sea en reposo o con la estimulación específica, microscopía óptica convencional no proporciona una imagen completa.

El uso de imágenes de súper resolución ha permitido a los investigadores para eludir el límite de difracción usando una variedad de técnicas. Microscopía sola molécula de localización (SMLM), tales como palma y ^6,7 STORM tiene la capacidad de resolver la ubicación de las moléculas hasta una precisión de alrededor de 20 nm, sin embargo, estas técnicas se basan en largos tiempos de adquisición, la construcción de una imagen sobre muchos marcos . Generalmente esto requiere muestras sean fijos o estructuras para exhibir baja movilidad fluoróforos tan solo no están mal interpretado como múltiples puntos. Si bien el agotamiento de la emisión estimulada (STED) de imágenes permite super-resolución a través de muy selectivo de excitación confocal ^8, el escaneo requeridoenfoque puede ser lento sobre los campos de células enteras de vista. STED también demuestra fototoxicidad significativa para resoluciones más altas debido al aumento de la potencia del haz de agotamiento.

Microscopía de iluminación estructurada (SIM ⁹⁾ ofrece una alternativa a estos métodos, capaces de duplicar la resolución de un microscopio de fluorescencia estándar y es más compatible con imágenes de células vivas que las técnicas actuales SMLM. Utiliza los poderes de láser más bajos, en un sistema de gran campo para los campos de células enteras de vista; proporcionando una mayor velocidad de adquisición, y es compatible con el etiquetado fluoróforo estándar. La naturaleza de campo amplio de SIM también permite la utilización de fluorescencia total reflexión interna (TIRF) para la excitación altamente selectivo, con profundidades de penetración en la dimensión axial de <100 nm.

Espectroscopia de correlación de imagen (ICS) es un método de correlación de las fluctuaciones en la intensidad de fluorescencia. Una evolución del ICS; Im espacio-temporaledad correlación de espectroscopia (STICS ¹⁰⁾ correlaciona señales fluorescentes intracelulares en tiempo y espacio. Al correlacionar las intensidades de píxeles y la zona píxeles en marcos rezagados a través de una función de correlación, se obtiene información sobre las velocidades de flujo y direccionalidad. Para asegurar objetos estáticos no interfieren con el análisis STICS, un filtro de objetos inmóviles se implementa, que funciona restando una media móvil de las intensidades de los píxeles.

La técnica que aquí se presenta se cree que es la primera demostración de la espectroscopia de correlación de imágenes que se aplica a los datos de microscopía de super-resolución para cuantificar el flujo molecular en células vivas ^11. Este método mejora en las imágenes de difracción limitada del flujo de F-actina a través de análisis STICS ^{12 y} se adaptaría a los investigadores que deseen determinar el flujo molecular bidimensional en células vivas, a partir de los datos adquiridos con resoluciones espaciales más allá del límite de difracción de la luz.

Protocolo

Nota: Etapas 1 y 2 tienen lugar antes del día de las imágenes; asegurar que todos los medios de comunicación y los suplementos a utilizar antes o el día de la proyección de imagen se equilibran. Equilibrado se consigue mediante el calentamiento de los medios de comunicación y los suplementos a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO _2. Todas las etapas de trabajo de cultivo celular y cubreobjetos de chapado se llevan a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.

La transfección 1. celular

1. Transfectar las células T para obtener imágenes 24 hr antes del experimento con un plásmido que codifica una fusión fluorescente construir para el etiquetado GFP F-actina y formación de imágenes. Nota: Las células deben dividirse las 24 horas antes de la transfección (48 horas antes de la proyección de imagen) para asegurar las células están en óptima salud y en su fase de crecimiento logarítmico.
   1. Colocar 5 ml de suplemento de RPMI (RPMI 1640 más del 10% de FBS y 1% Pen-Strep (opcional)) en un solo pocillo de una placa de 6 pocillos en la incubadora se equilibre.
   2. Pellet 2 x 10 ⁷ células T cultoured a 37 ° C 5% de CO ₂ en el suplemento RPMI usando un tubo de centrífuga a 327 xg durante 5 min y lavar en un volumen igual de medio de electroporación pre-calentado. Nota: medio electroporación es un medio de suero reducido que contiene tampones y suplementos (ver consumibles).
   3. Después de volver a la granulación a 327 xg durante 5 min, resuspender las células en 500 l de medios de electroporación y se añade lentamente a una cubeta, añadir 5 g de plásmido en dH ₂ O de grado PCR para el etiquetado de F-actina.
   4. Golpee suavemente la cubeta en el espacio de trabajo de la campana para asegurar la eliminación de las burbujas de aire en los medios de comunicación, que pueden causar la formación de arcos de la electricidad y para distribuir las células uniformemente dentro de los medios de comunicación.
   5. Encienda el aparato de electroporación y el voltaje ajustado a 300 V y la capacitancia a 290 Ω. Muestra electroporar utilizando un decaimiento exponencial durante 20 ms. Nota: Optimización puede ser necesaria para las diferentes células y diferentes construcciones de plásmidos.
   6. Una vez que el protocolo de transfección escompletos, almacenar células en hielo durante 1 min antes de continuar.
   7. Transferir cuidadosamente las células de la cubeta a la placa de 6 pocillos que contiene 5 ml de suplemento de RPMI equilibrada desde el paso 1.1.1.
   8. Se incuban las células O / N a 37 ° C + 5% de CO _2.

2. Cubreobjetos Coat y Pre-caliente Suplemento Imaging

1. Cubreobjetos capa con anticuerpos para inducir la estimulación de células T.
   1. Escudo cada cámara de un cubreobjetos 8 pocillos con 1 mg / ml αCD3 y αCD28 en 200 l de PBS.
   2. Almacenar a 4 ° CO / N. Alternativamente, cubreobjetos capa 2 horas antes de la proyección de imagen y mantienen en una incubadora a 37 ° C para reducir la deriva durante el proceso de formación de imágenes, minimizando los cambios de temperatura en el cubreobjetos.
2. Crear una muestra de prueba cubreobjetos con microesferas fluorescentes 0,1 micras sub-difracción.
   1. Vortex solución madre de los granos para evitar grumos.
   2. En una nueva, cubreobjetos limpio de le mismo tipo que los utilizados en el paso 2.1.1, pipeta de 5 l de microesferas fluorescentes solución madre sobre la superficie (según las instrucciones del fabricante).
   3. Corre solución de microesferas sobre el cubreobjetos con punta de la pipeta.
   4. Deje que se seque, luego aplique 200 l medio de montaje tales como PBS.
      Nota: el medio de montaje debe coincidir con la utilizada para muestras de células de imágenes.
3. Equilibrar HBSS (+ 20 mM HEPES, en adelante denominado "suplemento HBSS ') en un tubo de centrífuga colocando en una incubadora O comprobar la validez de frío / N a 37 ° C + 5% de CO _2.
   Nota: la adición de HEPES es para amortiguar CO _2, si se utiliza una cámara de incubación con CO ₂ de entrada saltarse esta suplementación.

3. Microscopio Set-up

1. Encienda la incubadora de etapa superior del microscopio y lugar suficiente agua destilada TIRF-SIM en el depósito del microscopio para cubrir la totalidad de la base del elemento de calefacción. Deje que el agua Equilibrate a 37 ° C. Añadir el collar de calentamiento a la lente objetivo, también se establece en 37 ° C.
   Nota: Debido a la sensibilidad de la puesta a punto, estos pasos se llevan a cabo la noche anterior para los componentes ópticos están a una temperatura estable antes de la imagen.
2. Coloque el TIRF 488 bloque de rejilla compatible en la trayectoria de la luz del microscopio y seguro en su lugar.
   1. Cambie el modo de canal y el cable de fibra a la posición 'Individual' en el escenario cama láser y microscopio, respectivamente, para acoplarse a la trayectoria óptica correcta para el modo TIRF-SIM. Nota: Saltarse este paso dará lugar a un error (Figura 1 A) dentro de la ventana del software.
3. Encienda todos los componentes del microscopio y la computadora y abrir el software de control de la adquisición.
   1. Abra el panel de OC, Ti Pad, N-SIM Pad y ND Adquisición ventanas (Figura 1B). En el 'Panel de OC' seleccione la opción 'TIRF 488' (Figura 2B, flecha amarilla).
   2. En la ventana N-SIM Pad, seleccione el 'TIRF-SIM "y ajustes' Moving '(Figura 2C, flechas amarillas). Seleccione el botón de configuración (Figura 1C, caja amarilla) y seleccione 'TIRF 488 (de 100x TIRF 488 nm)' en el menú desplegable, de favoritos Aplicar 'y' OK '.
   3. Establezca los ajustes de la cámara dentro de los 'ajustes' DU897 a: Velocidad de cuadros 50 ms, modo de lectura, EM Ganancia 3 MHz a 14 bits, y EM Ganancia multiplicador 300 con una ganancia de conversión de 1 (Figura 1C, caja verde).
      Nota: Véase representativos Resultados para consideraciones de velocidad de cuadro.
   4. Calibrar la iluminación del microscopio para TIRF-SIM seleccionando el objetivo 100x 1,49 NA CFI Apocromático TIRF, en la 'N-SIM Pad' gire a la potencia del láser 488 nm a 10%.
      Nota: tamaño de píxel de las imágenes en bruto es 60 nm, con un campo de 512 x 512 pixel de vista.
   5. Limpie la lente del objetivo utilizando tejido de lentes para eliminar el polvo y el aceite.
4. Encuentra el plano focal TIRF-SIM.
   1. Comience con el objetivo de la posible plano z más bajo. Coloque una gota de aceite de la lente del objetivo y añadir la muestra de microesferas fluorescentes desde el paso 2.2 de la platina del microscopio.
   2. Seleccione la función Perfect Sistema de enfoque (PFS), ubicado en el cuerpo del microscopio.
   3. Mueva lentamente el objetivo a través del plano z hasta que el botón PFS deja de parpadear para confirmar el plano focal se ha alcanzado.
   4. Cambie a la vista 'en vivo' en el software de control y la imagen de las microesferas para ajustes finales realizados mediante el uso de la rueda de micro-manipulador PFS.
5. Observe la iluminación uniforme sin emisión de fluorescencia fuera de foco por encima de la onda evanescente 75 nm.
   Nota: Confirme iluminación estructurada se cumple mediante la observación de un patrón de iluminación fluctuante de la muestra de microesferas fluorescentes.
6. Mida la muestra de microesferas fluorescentes y cuantificar la resoluc de imagen mejoradaión observando la anchura a media altura (FWHM) del perfil de intensidad.
   1. Abra el software Analizar (v4.20.01), con el módulo de NIS-N-SIM Análisis instalada y seleccione "Aplicaciones" -> "ventana demostración N-SIM".
   2. Con el contraste de modulación de iluminación (IMC) y supresión de ruido de alta resolución (HRNS) se establece en 1 para conjuntos de datos TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir la imagen de la muestra de microesferas para generar una imagen reconstruida de 1.024 x 1.024 píxeles con un tamaño de píxel de 30 Nuevo Méjico.
   3. Con la herramienta perfil de la línea con un ancho de 1 píxel (Figura 3A, caja amarilla), trazar una línea a través del centro de un solo microesfera.
   4. Seleccione el botón FWHM (Figura 3B, caja amarilla) y haga clic en los máximos de intensidad de la distribución de Gauss, seguido por su minima intensidad.
   5. Confirmar la FWHM de la microesfera está en el intervalo de 100 nm (Figura 3C). Nota: la resolución achCuando la imagen muestras biológicas ieved variarán dependiendo de la relación señal a ruido de la eficiencia del etiquetado y la fluorescencia de fondo.

4. Preparación de muestras para Imaging

1. Preparación Coverslip.
   1. Recuperar cubreobjetos recubiertos de αCD desde el paso 2.1 de la nevera o incubadora y eliminar PBS que contenía αCD3 y αCD28 de cada pocillo.
   2. Añadir 200 l de HBSS suplemento pre-calentado desde el paso 2.3 a cada pocillo de la cubreobjetos. Lavar y quitar para asegurar una mínima αCD3 y αCD28 se deja en solución. Añadir otros 200 l de HBSS el suplemento a los pocillos de cubreobjetos.
   3. Limpie la parte inferior del cubreobjetos con papel para lentes para eliminar el aceite y las partículas.
2. Posición cubreobjetos sobre la platina del microscopio y encontrar el plano focal TIRF del cubreobjetos usando el plano z PFS como se encuentra en el paso 3.4.
3. Preparación de las células.
   1. Pipetear 200 l de la con los medios de comunicacióncontienen células transfectadas del paso 1.1.8 en un tubo de microcentrífuga.
   2. Células de pellets en un micro-centrifugar a 268 xg durante 20 segundos y retirar medios celulares.
   3. Resuspender las células en 200 l precalentado suplemento HBSS desde el paso 2.3.

5. Las células Imaging

1. Tome suplemento de HBSS que contiene células al microscopio y la pipeta suavemente 200 l en uno de los pozos.
2. Si bien se mantiene en el plano focal TIRF en el cubreobjetos (en el modo SLP), utilice el ocular microscopios de epifluorescencia y la iluminación para rastrear células fluorescentes se aproximan a la cubreobjetos.
3. Una vez que las células de la tierra en el cubreobjetos, cambie al modo 'Live' en la N-SIM cojín para que la imagen en el monitor y compruebe las células están en el foco en la pantalla del ordenador.
4. Para registrar los tiempos de los cursos, abra la ventana ND Adquisición y seleccione la pestaña 'Time', haga clic en "Añadir" y establecer 'Intervalo' en Sin demora, 'Duración'a 10 minutos, 'Loops' se establece en 1.
   Nota: La duración puede ser cambiado dependiendo del proceso de interés; el software STICS puede extraer resultados cuantitativos con pilas de imágenes de ≈10 marcos cuando fue capturado con 'No Delay'.
5. Con los ajustes de adquisición idénticos a la muestra de cuentas, iniciar la grabación de datos seleccionando "Ejecutar ahora" en la ventana ND Adquisición.

6. Imágenes Reconstructora SIM

1. Después de imágenes, abra el software Analizar (v4.20.01), con el módulo de NIS-N-SIM Análisis instalada y seleccione "Aplicaciones" -> "ventana demostración N-SIM".
2. Con el contraste de modulación de iluminación (IMC) y la supresión de ruido de alta resolución (HRNS) establece en 1 para los conjuntos de datos TIRF-SIM (Figura 2), la reconstrucción de una (o múltiple con la función por lotes) Archivo SIM prima para producir una imagen SIM reconstruida.
3. Confirmar el archivo reconstruida tiene un tamaño de píxel de 30 nm, se indica en elbarra de estado de la imagen.
   Nota: Tamaño de píxel no afecta análisis STICS pero debe ser al menos 2x menor dimensión que la resolución espacial PSF con el fin de garantizar la correlación espacial entre los píxeles.
4. Exportar los datos como archivos .tiff, listos para el análisis STICS.

Análisis 7. STICS

1. Descargue y extraiga el STIC (C) S paquete de software Matlab (laboratorio de Wiseman, disponible como información complementaria). El stics_vectormapping.m guión es el núcleo de un solo análisis STICS canal y las primeras 30 líneas de código se utilizan para definir los parámetros de entrada como se define en la sección 2.1 del manual. Abrir este script y definir los parámetros de entrada para el análisis de datos TIRF-SIM. Se sugiere añadir también la carpeta S STIC (C) con subcarpetas a la máquina ruta local Matlab, como se detalla en el apéndice del manual.
   1. Definir los parámetros de entrada para el análisis de datos mediante la edición de las líneas correspondientes del código
   2. Para llevar a cabo analisis de los datos TIRF-SIM para generar 1 de vectores mapa, establezca los parámetros temporales a subregión temporal en la línea 31 hasta el número máximo de fotogramas y el cambio temporal en la línea de 32 a 1. Para obtener una serie temporal de mapas vectoriales variar estos parámetros .
   3. Para el filtro de eliminación inmóvil, establezca el parámetro 'filtrado' (línea 23) a 'Promedio móvil' y establecer el parámetro 'MoveAverage' (línea 24) a 21.
      Nota: Este ajuste se ha demostrado que funciona más lento señales de fluorescencia grandes en movimiento y, ya que se basa en la sustracción de marcos de serie de la estructura que se está analizando.
   4. Cambio líneas 33-38 para establecer el nombre de los archivos de salida y los títulos de los mapas vectoriales de salida, así como la ruta del directorio de salida y definir en qué formato el mapa vectoriales imágenes se deben guardar.

Tamaño de píxel (micras)	0,03 micras	Línea 19
Velocidad de cuadro (s)	1 segundo	Línea 20
El tiempo máximo de retardo (frames)	20 cuadros	Línea 21
Tamaño Subregión (píxeles)	8 píxeles	Línea 29
Espaciamiento Subregión (píxeles)	1 pixel	Línea 30

2. Abra los run1ChannelSTICS secuencia de comandos en la ventana Matlab Editor. Cargue la serie de imágenes mediante la ejecución de las líneas 1-23 de este script.
   Nota: Este script se puede utilizar para cargar y pre-proceso de series de imágenes, trazar los mapas vectoriales e histogramas de velocidad y ejecutar un proceso por lotes para muchos archivos. Si es necesario, recortar la imagen de una región de interés mediante el uso de la línea 24-26 de este script.
   1. Ejecutar líneas 29-35 de run1ChannelSTICS para iniciar el análisis STICS. Cuando se le solicite, seleccione un polígono para indicar una región específica de interés (ROI), si se desea. Asegúrese de que la ROI no se solapa con el borde de la celda, como se producen artefactos de límite cuando STICS analiza estas reregiones.
   2. Ejecutar líneas 38-52 para mostrar los mapas de vectores. Para trazar el histograma magnitud de la velocidad, correr las líneas 53-72.

Resultados

Ajustes del microscopio

Después de lograr con éxito todos los pasos del investigador tendrá iluminación estructurada logrado (SIM) de imágenes del flujo de F-actina en una sinapsis de las células T (Video 1), y se cuantifica este flujo molecular mediante espectroscopia de correlación de imágenes espacio-temporal (Figura 4 ^11). Antes de grabar las imágenes, asegúrese de la iluminación de la muestra e...

Discusión

Esta técnica permitirá a los investigadores a imagen y cuantificar previamente detalles irresolubles en células que expresan la fluorescencia. En nuestros resultados nos muestran que la F-actina fluye en una forma simétrica de la periferia de la célula hacia el centro de la celda en la célula T es. Estos resultados son consistentes con los resultados anteriores de la línea 1D datos de perfil quimógrafo ¹³ y se extienden la capacidad de análisis de datos 2D y super-resolución.

La t...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Consumibles:
Jurkat E6.1 celdas	APCC	ATTC TIB-152
RPMI	Life Technologies	21875-091
FBS	Sigma	F7524-500ML
Penicilina-Strepromicina	Tecnologías de la Vida	15140-122
HBSS	Life Technologies	14025-050
HEPES	Life Technologies	15630-056
#1.5 cubreobjetos Labtek de 8 pocillos	NUNC, Labtek	155409
LifeAct GFP construct	Ibidi	60101
OptiMem	Life Technologies	51985-042
anti-CD3	Cambridge Bioscience	317315
anti-CD28	BD Bioscience / Insight Biotechnology	555725
PBS	Life Technologies	20012-019
Aceite
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
>Equipo:
Gene Pulsar Xcell System	BioRad	165-2660
Cubeta (0,4 cm)	Centrífuga BioRad	165-2088
(5810R)	Eppendorf	5805 000.327
Centrífuga (Heraeus)	Biofuge pico 75003235
placa de 6 pocillos	Corning	3516
Incubadora de etapa	Tokai Hit	INUH-TIZSH
Microscopio Nikon N-SIM	Nikon	Contactar empresa
Nikon Nikon Software de análisis	Nikon	Empresa de contacto
Incubadora ( 190D)	LEEC	Empresa