Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

George Ashdown; Elvis Pandžić; Andrew Cope; Paul Wiseman; Dylan Owen

doi:10.3791/53749

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Artículo de método

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

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DOI:

10.3791/53749

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17 de diciembre de 2015

George Ashdown¹ , Elvis Pandžić³ , Andrew Cope² , Paul Wiseman⁴ , Dylan Owen¹

¹Department of Physics and Randall Division of Cell and Molecular Biophysics, King's College London, ²Academic Department of Rheumatology, Centre for Molecular and Cellular Biology of Inflammation, Division of Immunology, Infection and Inflammatory Disease, King's College London, ³ARC Centre for Advanced Molecular Imaging, Australian Centre for NanoMedicine, University of New South Wales Australia, ⁴Departments of Chemistry and Physic, McGill University

En este artículo

Resumen

Para investigar las velocidades de flujo y la direccionalidad de la actina filamentosa en la sinapsis inmunológica de las células T, se combinan imágenes de superresolución de células vivas con fluorescencia de reflexión interna total y se cuantifican con espectroscopía de correlación de imágenes espacio-temporales.

Resumen

-Actina filamentosa juega un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, incluyendo la motilidad y, en las células inmunes, la formación de una interacción célula-célula clave conocida como la sinapsis inmunológica. F-actina También se especula que desempeñan un papel en la regulación de las distribuciones moleculares en la membrana de las células incluyendo la dinámica de vesículas sub membranosa y la agrupación de proteínas. Si bien las técnicas de microscopía de luz estándar permiten observaciones generalizadas y difracción de limitarse a realizar, muchos eventos celulares y moleculares, incluyendo clustering y el flujo molecular se producen en las poblaciones en longitud escalas muy por debajo de la capacidad de resolución del microscopio óptico estándar. Mediante la combinación de fluorescencia total reflexión interna con el súper resolución de imagen método estructurado iluminación microscopía, se registró el flujo molecular bidimensional de F-actina en la sinapsis inmunitaria de las células T. Espacio-temporal espectroscopia de correlación de imágenes (STICS) y luego se aplicó, que genera resul cuantificablets en forma de histogramas de velocidad y mapas vector que representa la direccionalidad del flujo y la magnitud. Este protocolo describe la combinación de las técnicas de imagen y STICS super-resolución para generar vectores de flujo a nivel sub-difracción de detalle. Esta técnica se utilizó para confirmar un flujo de actina que es simétricamente retrógrada y centrípeta lo largo de la periferia de las células T en la formación de sinapsis.

Introducción

El objetivo del experimento es a la imagen y caracterizar el flujo molecular de filamentous- (F-) de actina en las células T de estar, más allá del límite de difracción con el fin de establecer la dirección del flujo y la magnitud durante la sinapsis inmunológica (IS) formación. Esta técnica se llevará a cabo usando un microscopio de iluminación estructurada (SIM) en el modo de fluorescencia total reflexión interna (TIRF), la formación de imágenes de células T Jurkat que forman una sinapsis artificial sobre la activación cubreobjetos recubiertos con anticuerpos anti-CD28 anti-CD3 y. Las formas se encuentra entre una célula T y su objetivo; una célula presentadora de ....