Las viroterapias oncolíticas están en desarrollo como nuevas terapias para el tratamiento del carcinoma hepatocelular (CHC). En este trabajo describimos un método para el tratamiento locorregional del CHC mediante la administración arterial hepática de virus oncolítico.
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Artículo de método
Administración transarterial de virus oncolíticos para locorregional Terapia de HCC ortotópico en ratas
En este artículo
Resumen
Resumen
El carcinoma hepatocelular (CHC) es una enfermedad con opciones de tratamiento limitadas y mal pronóstico. En los últimos años, las viroterapias oncolíticas han demostrado ser herramientas potencialmente poderosas para combatir las neoplasias malignas. Debido al suministro dual de sangre único en el hígado, es posible aplicar terapias localmente a los tumores hepáticos ortotópicos, que se alimentan predominantemente del flujo sanguíneo arterial. Hemos demostrado previamente que la administración arterial hepática de virus oncolíticos da lugar a una transducción segura y eficiente de las lesiones multifocales de CHC, lo que resulta en una prolongación significativa de la supervivencia en ratas inmunocompetentes. Este procedimiento imita de cerca la aplicación de la embolización transarterial en los pacientes, que es el tratamiento paliativo estándar que se brinda a muchos pacientes con CHC. La capacidad de administrar terapias tumorales a través de la arteria hepática en ratas permite un modelo preclínico altamente sofisticado para evaluar nuevos vectores virales en desarrollo. En este trabajo describimos el protocolo detallado para la microdisección de la arteria hepática para la infusión de vectores oncolíticos del virus en el tratamiento del CHC ortotópico.
Introducción
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más frecuente en todo el mundo, y la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer, por lo que es un importante problema de salud 1,2. Para los pacientes que no son candidatos para la resección del tumor, o aquellos que esperan un trasplante de hígado, la terapia locorregional la técnica de embolización transarterial (TAE) o la quimioembolización transarterial (TACE) se aplican como estándar de cuidados paliativos 3,4. Estas terapias se aprovechan de la característica única de doble suministro de sangre en el hígado mediante el cual los tumores se alimentan casi exclusivamente por el flujo sanguíneo arterial hepática, mientras que el hígado circundante recibe la mayor parte de su suministro de sangre de la vena porta 5,6.
Debido a las eficacias extremadamente limitadas de las terapias establecidas para el CHC, virus oncolíticos han surgido como alternativas terapéuticas prometedoras. JX-594, recientemente rebautizada Pexa-Vec, es una quinasa eliminado en vectores vaccinia timidina, armado de granulocitos-macrophage factor estimulante de colonias (GM-CSF), que se ha completado la fase II de ensayos clínicos para el CHC 7. Más recientemente, un vector recombinante virus de la estomatitis vesicular (VSV) que expresa interferón beta humano ha entrado en una fase I de ensayos clínicos para el CHC sorafenib-refractario (NCT01628640). Como los virus oncolíticos se acercan más a la obtención de la aprobación para la aplicación clínica de HCC en pacientes, la necesidad de una vía de administración eficaz para apuntar enfermedad multifocal es evidente. Mientras que la administración sistémica es en gran parte ineficaz debido a la transducción de tumor ineficiente, aplicaciones intratumorales podrían limitar la eficacia de la terapia para el tumor inyectado, dejando lesiones microscópicas uninjectable susceptibles a la progresión de la enfermedad.
Hemos establecido un método de aislamiento de la arteria hepática en ratas para administrar la terapia virus oncolítico de una manera locorregional para apuntar HCC ortotópico. Hemos demostrado que esta vía de administración da como resultado seguro y effective la transducción de nódulos HCC multifocales, lo que resulta en una prolongación significativa la supervivencia en ratas inmunocompetentes 8-10. A continuación, se describe el método de acceso, disección, e inyectar en la arteria hepática en ratas. Un esquema del procedimiento se muestra en la Figura 1 (previamente publicado 9)
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Protocolo
Nota: Los siguientes pasos se han realizado de acuerdo con las directrices de nuestra institución y el gobierno local de Baviera, Alemania. Todos los intentos de reproducir este protocolo se deben hacer en la adhesión a las directrices locales para el tratamiento humanitario de los animales, según lo dictado por el cuidado de animales local y el empleo. Por ejemplo, muchos institutos requieren que los guantes estériles se usan durante la cirugía de roedores. Por otra parte, el trabajo con los virus debe realizarse de acuerdo con las regulaciones locales, teniendo cuidado para la seguridad personal y ambiental. Se debe tener cuidado para disponer adecuadamente de residuos contaminados y para limpiar instrumentos y espacio de trabajo (es decir, por tratamiento en autoclave y la limpieza con un desinfectante antiviral apropiado de acuerdo con las instrucciones del fabricante).
1. Preparativos antes de la cirugía A partir
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos (es decir, por tratamiento en autoclave).
- Diluir el virus a la correspondconcentración IATE, que variará dependiendo de la toxicidad del virus específico que está siendo utilizado y de la susceptibilidad de la cepa de rata.
Nota: Por ejemplo, cuando el uso de virus de la estomatitis vesicular en ratas Buffalo macho, por lo general la inoculación de 10 7 pfu en un volumen de 1 ml, que es la dosis máxima tolerada en ese modelo.- Rellenar previamente el virus (utilizando una técnica aséptica) en jeringuillas de 1 ml, y adjuntar 30 g de agujas, teniendo cuidado de eliminar el aire de la jeringa y la aguja.
- Preparar el espacio quirúrgico con todos los materiales y equipos necesarios, y rociar la zona con etanol para desinfectar. Llenar un pequeño recipiente con solución salina estéril (NaCl al 0,9%) para humedecer torundas de gasa y bastoncillos de algodón.
2. Preparación de la rata
- Administrar un analgésico (como se especifica por el comité de cuidado de los animales y el uso local), en la apropiada dosis 30 minutos antes de comenzar el procedimiento quirúrgico. Por ejemplo,administrar una dosis alta de metamizol (100-200 mg / kg).
- Anestesiar la rata de usar la inhalación (isoflurano) o inyectable (es decir, una mezcla de medetomidina (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), y el fentanilo (0,005 mg / kg), también conocido como MMF) anestesia. Administrar isolflurane a través de un vaporizador a 1-3% y ajustar según sea necesario para mantener la respiración normal y la frecuencia cardíaca.
- Antes de continuar, asegúrese de que la rata está completamente sedado y no pueda sentir dolor pellizcando la almohadilla de la pata y la observación de una reacción.
- Aplicar un ungüento oftálmico veterinario para evitar la sequedad durante la anestesia.
- Afeitar el área abdominal desde el esternón hasta justo por encima de los genitales utilizando una pequeña cortadora de cabello veterinaria. Tenga cuidado para conseguir un afeitado apurado sin dañar la piel.
- Fijar la rata en el lecho quirúrgico utilizando cinta adhesiva en las patas delanteras y las patas traseras, y, si se utiliza la anestesia de inhalación, coloque el hocico en un cono de la nariz de dimensiones adecuadas. Coloque una almohadilla térmicapor debajo de la rata para mantener la temperatura corporal. Desinfectar la zona abdominal usando un desinfectante de grado quirúrgico, seguido de un enjuague con alcohol y la aplicación de una pintura antiséptico.
3. La laparotomía
- Usando un pequeño bisturí curvo, tal como # 15, hacer una pequeña incisión vertical en la capa de la piel directamente a lo largo de la línea media. Extender la incisión hasta el proceso xifoides. A continuación, una incisión en la capa muscular levantando suavemente hacia arriba con un par de pinzas de Adson para hacer una incisión con bisturí, y luego extender la incisión hasta el proceso xifoides con tijeras quirúrgicas. Tener cuidado de no perforar los órganos de la cavidad abdominal o de dañar los pequeños vasos en cada lado del proceso xifoides.
- Coloque un retractor a través del abdomen para difundir el músculo y la piel y exponer toda la zona abdominal.
- Humedecer dos 7,5 x 7,5 cm 2 hisopos de gasa con solución salina fisiológica estéril y se extiende uno en la parte superior de la cirugíala apertura y uno en la parte inferior, como se muestra en la Figura 2A.
4. Aislamiento de la arteria hepática
- El uso de dos hisopos de aplicador de algodón humedecido humedecidos con solución salina fisiológica estéril, levante suavemente los intestinos y el ciego fuera de la cavidad abdominal, y colocarlos en el hisopo de gasa inferior. Doble la gasa sobre los órganos de mantener húmeda y para mantenerlos fuera del camino.
- El uso de dos hisopos aplicador de algodón humedecido, levante suavemente el lóbulo hepático lateral izquierdo, que será el lóbulo más predominante en vista en esta etapa. Da la vuelta al lóbulo hacia arriba, y, usando un pequeño par de tijeras de primavera, cortar a través de la membrana fibrosa en la parte inferior del lóbulo, permitiendo que el lóbulo a ser completamente volteado hacia arriba y descansar en la parte superior de la torunda de gasa previamente colocado. Doblar el hisopo de gasa sobre el lóbulo para mantenerlo en su lugar.
- Continuar con el siguiente lóbulo (el caudado anterior), que es ahora el lóbulo más anterior a la vista. con THe ayuda de un microscopio de disección y pinzas finas, diseccionar la membrana delgada que rodea el lóbulo con el fin de liberarlo y permitir que se volcó libremente hacia arriba. Coloque el lóbulo debajo de la torunda de gasa junto con el lóbulo lateral izquierdo.
- Observar el lóbulo caudado posterior, que ahora serán visibles. Repita el paso 4.3 para diseccionar completamente el caudado lóbulo posterior y darle la vuelta hacia arriba y hacia el interior de la gasa junto con los lóbulos del hígado previamente colocados.
- Justo debajo de la posición original del lóbulo caudado, encontrar la arteria hepática común, que ahora serán visibles y fácilmente reconocido por su fuerte pulsación. A raíz de la arteria hacia la derecha anatómica, observar el material membranoso de espesor oscureciendo las arterias hepáticas gastroduodenales y propios de la vista. Con unas pinzas finas, levanta este material y suavemente arrancarla, teniendo cuidado de evitar cualquier vasos pequeños en esta área. Use hisopos de algodón del aplicador para detener cualquier sangrado que puede ocurrir.
- Busque la unaramas rterial, que será claramente visible con la ayuda de un microscopio de disección cuando las membranas se disecan correctamente.
- El uso de dos, una pinza atraumática finas, diseccionar cuidadosamente la arteria hepática común, la arteria gastroduodenal, y la arteria hepática propia de tal manera que se liberan de las membranas que rodean (Figura 2B).
5. Preparación de la arteria para Inyección
- Pasar una sutura de prolene 7-0 por debajo de la arteria gastroduodenal, y el uso de un micro-porta-agujas para atar una ligadura permanente en el extremo distal, justo por encima de la bifurcación (véase la figura 1 para la colocación adecuada). Permitir aproximadamente 2 pulgadas de material de sutura restantes en los extremos, y la abrazadera con un soporte de aguja para tirar de la arteria enseñado, como en la figura 2C.
- Coloque una pequeña pinza en la arteria hepática común para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo (Figura 2C).
Nota: Esta es importante para prevenir el sangrado masivo una vez que la aguja se retira de la arteria. Además, el bloqueo del flujo sanguíneo arterial permitirá la administración del virus más lento y una mayor eficiencia de transducción.- Importante: Trabajar rápidamente para limitar la cantidad de tiempo que el flujo sanguíneo se detiene - realizar la inyección y la posterior ligadura de la arteria dentro de 5 min de pinzamiento de la arteria hepática común.
- Si es posible, aumentar la ampliación en el microscopio de disección, de modo que la arteria gastroduodenal es en un enfoque nítido y aparece lo suficientemente grande como para insertar con precisión la aguja G 30. Coloque la aguja de la jeringa de inyección en el lumen de la arteria gastroduodenal y empuje lentamente el émbolo.
Nota: La colocación correcta de la aguja resultará en la solución inyectada fluye directamente a través de la arteria hepática propia y hacia el hígado.- Realizar la inyección muy lentamente para maximizar la eficiencia de transducción.
- Una vez se ha administrado todo el volumen de la inyección, se retrae lentamente la aguja de la arteria.
Nota: No debe haber sangrado del sitio de inyección. En el caso de que el sangrado se produce, esto indica que la abrazadera no está correctamente colocado y debe ajustarse rápidamente.
6. Cierre
- Pasar una segunda sutura de prolene 7-0 por debajo de la arteria gastroduodenal, y atar una segunda ligadura permanente por encima del punto de inyección.
- Retire la abrazadera de la arteria hepática común. Confirmar que el flujo de sangre a través de la arteria hepática propia hacia el hígado se ha restaurado.
- Cortar los extremos sueltos de las ligaduras.
- Confirmar que no hay sangrado antes de devolver los intestinos y el hígado a la cavidad abdominal. Tenga cuidado de que el apéndice se devuelve en su orientación original.
- Suturar el músculo y la piel en capas separadas utilizando material de sutura Vicryl 4-0 con una aguja curva. lugar continuous suturas de aproximadamente 1 mm de distancia y tirar con fuerza.
- Durante la fase de sutura, administrar un analgésico tal como buprenorfina (0,05 mg / kg).
- Retire la rata de la anestesia. Si se ha utilizado isoflurano, la rata debe recuperar la consciencia dentro de varios minutos. Si MMF se ha utilizado como una anestesia inyectable, antagonizar con una inyección subcutánea de atipamezol (0,75 mg / kg), Flumazenil (0,2 mg / kg), y la naloxona (9,12 mg / kg), que revertir los efectos de la anestesia y permitir que los animales puedan recobrar el conocimiento dentro de los 20 min. Mantener calientes ratas con una lámpara de calentamiento por infrarrojos durante la fase inicial de despertar.
- No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
- No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Supervisar las ratas después de la operación para detectar signos patológicos de la angustia, y el seguimientocon analgésicos como es requerido por el comité de cuidado y uso de animales local. Por ejemplo, la buprenorfina puede administrarse a 0,05 mg / kg cada 12 horas.
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Resultados
Con la experiencia, se puede lograr una tasa de éxito de casi el 100% (lo que significa que la arteria se diseccionó y se inyecta con éxito, y el animal sobrevivió cirugía). Sin embargo, el estado de salud de la rata antes de la cirugía (grado de carga tumoral, la función hepática subyacente, etc.), obviamente, jugar un papel en el resultado de la intervención quirúrgica. Después de la cirugía, las ratas se puede esperar que experimentar pérdida de peso transitoria y una ligera ...
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Discusión
Aunque la inyección intratumoral directa es sin duda el método más simple para dar como resultado una transducción tumoral eficiente de un solo nódulo tumoral, la infusión arterial hepática representa una vía de administración ideal para atacar el CHC ortotópico multifocal. Este método ha demostrado ser seguro y eficaz para tratar el CHC en ratas inmunocompetentes con virus oncolíticos. Además, dado que los pacientes con CHC se tratan de forma rutinaria mediante la aplicación transarterial de quimioembolización, el mét...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo cuenta con el apoyo de los subproyectos SFB 824 C6 y C7 (DFG Sonderforschungsbereich 824), Fundación Alemana de Investigación, Bonn, Alemania.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Maquinillas veterinarias | Aesculap | GT415 | Pequeña recortadora inalámbrica ideal para eliminar el pelo de la zona quirúrgica |
| Microscopio estereoscópico | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Agujas | Braun | 4656300 | 30 G x ½ " |
| Jeringas de 1 ml | Braun | 9161406V | Jeringa de tuberculina |
| Bisturí desechable | Feather | 2975#15 | #15 cuchilla |
| tijeras quirúrgicas estándar | Fine Science Tools | 14001-13 | Afilado/romo, para abrir la piel y los músculos |
| Pinza Adson | Fine Science Tools | 1101-12 | Con dientes, para agarrar la piel y los músculos |
| Retractor de Alm | Fine Science Tools | 17008-07 | Con dientes romos, para abrir la cavidad abdominal durante la cirugía |
| Hisopos de gasa | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7,5 cm x 7,5 cm, debe esterilizarse en autoclave antes de usarlo |
| Hisopos aplicadores con punta de algodón | Lohmann & Rauscher | 11970 | Estéril |
| Foreceps de punta fina | Fine Science Tools | 11063-07 | 0,4 mm, punta angulada, para la disección de la arteria hepática |
| Tijeras de resorte Vannas | Fine Science Tools | 91500-09 | Para cortes delicados |
| Soporte para microagujas | Fine Science Tools | 12076-12 | Para ligar la arteria gastroduodenal |
| Portaagujas | Fine Science Tools | 12005-15 | Mordazas de carburo de tungsteno |
| 7-0 Suturas de Prolene | Ethicon | 8648H | Sutura de polipropileno con aguja curvada, para ligadura de la arteria gastroduodenal |
| 4-0 Suturas Vicryl | Ethicon | V3040H | Con aguja curva |
| acoplada Lámpara de calentamiento por infrarrojos | Beurer | IL11 | Para el mantenimiento de la temperatura corporal en el postoperatorio |
Referencias
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- Bruix, J., Sala, M., Llovet, J. M. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127, 179-188 (2004).
- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
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