Presentamos un protocolo bioquímico y conductual para evaluar la eficacia de los compuestos solubles en agua dirigidos a las mitocondrias para el tratamiento de la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) y otras enfermedades neurodegenerativas cerebelosas.
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Artículo de método
El tratamiento de ratones con SCA1 hidrosolubles compuestos para no específicamente estimular la función mitocondrial
En este artículo
Resumen
Resumen
La disfunción mitocondrial desempeña un papel significativo en el proceso de envejecimiento y en las enfermedades neurodegenerativas incluyendo varios degeneración espinocerebelosa hereditarios y otros trastornos del movimiento marcados por la degeneración progresiva del cerebelo. El objetivo de este protocolo es evaluar la disfunción mitocondrial en la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) y evaluar la eficacia de la orientación farmacológica de la respiración metabólica a través del ácido succínico compuesto soluble en agua para retardar la progresión de la enfermedad. Este enfoque es aplicable a otras enfermedades cerebelares y se puede adaptar a una serie de terapias solubles en agua.
Análisis ex vivo de la respiración mitocondrial se utiliza para detectar y cuantificar los cambios relacionados con la enfermedad en la función mitocondrial. Con la evidencia genética (datos no publicados) y la evidencia de proteómica de la disfunción mitocondrial en el modelo de ratón de SCA1, evaluamos la eficacia del tratamiento con la dosis de refuerzo metabólico s soluble en aguaácido uccinic disolviendo este compuesto directamente en el agua potable jaula. La capacidad del fármaco para pasar la barrera hematoencefálica puede deducirse usando la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La eficacia de estos compuestos puede ensayarse utilizando varios paradigmas de comportamiento entre ellos el rotarod de aceleración, prueba de barra de equilibrio y análisis de la huella. integridad cytoarchitectural del cerebelo se puede evaluar usando ensayos de inmunofluorescencia que detectan núcleos de las células de Purkinje y las dendritas de células de Purkinje y soma. Estos métodos son técnicas robustas para la determinación de la disfunción mitocondrial y la eficacia del tratamiento con los compuestos solubles en agua en la enfermedad neurodegenerativa cerebelosa.
Introducción
Las mitocondrias son los productores principales de trifosfato de adenosina (ATP), una coenzima esencial para la energía celular, con la mayoría de ATP mitocondrial producido a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) usando la cadena de transporte de electrones. El cerebro, dada su alta demanda metabólica y su dependencia de la fosforilación oxidativa para la alimentación de la actividad neuronal, es altamente susceptible a la disfunción mitocondrial. Como resultado, la disfunción mitocondrial se activa durante el proceso de envejecimiento 1 y está implicada en la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas
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Protocolo
Este protocolo sigue las directrices del IACUC en Skidmore College para trabajar con ratones.
1. El tratamiento con compuestos solubles en agua
- Disolver ácido succínico a una concentración de 0,75 mg / mL en el agua potable jaula. Tenga en cuenta que cualquier compuesto soluble en agua de interés a la concentración deseada podría ser sustituido en esta etapa. Se agita la solución para asegurarse de que el compuesto se haya disuelto completamente.
- Después de ratones llegan a la edad de tratamiento deseado, sustituir el agua de bebida jaula hogar del grupo de condiciones de tratamiento con la solución en el paso 1.1.
- Medir el peso....
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Resultados
A través de la orientación farmacológica de las mitocondrias cerebelosa con ácido succínico somos capaces de prevenir la disfunción mitocondrial en un modelo de ratón de la enfermedad neurodegenerativa SCA1 cerebelosa. El donador de electrones canónica de la succinato deshidrogenasa, ácido succínico, se disolvió en jaula de agua potable de los ratones con SCA1 durante un mes, con el comienzo evaluación de comportamiento durante la segunda semana de tratamiento y evaluación neuropatológic.......
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Discusión
Si se utilizan estos métodos como se describe, que son capaces de detectar y mitigar la disfunción mitocondrial fosforilación mediada oxidativo en modelos de ratones enfermedad neurodegenerativa cerebelosos. Los ensayos bioquímicos y de comportamiento combinados son métodos multifacéticos para determinar el grado de contribución a la patología mitocondrial enfermedad neurodegenerativa cerebelosa. Al tratar a los ratones con ácido succínico para estimular el metabolismo y estimular la función mitocondrial, que son capace.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Harry Orr de la Universidad de Minnesota por su generoso regalo de ratones transgénicos. También nos gustaría agradecer a los siguientes ex alumnos de Skidmore College por su trabajo realizando los experimentos anteriores: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson y Cheyanne Slocum. Además, nos gustaría agradecer a Skidmore College por financiar el desarrollo de estos métodos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Difosfato de adenosina | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbato | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-fenilindol | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonina | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Suero de burro | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamato | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malato | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Manitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehído | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potasio-lactobionato | Bio-Azúcares | 69313-67-3 | |
| Rotenona | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponina | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Ácido succínico | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N′,N′ -Tetrametil-p-fenilendiamina | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Medio de montaje Vectashield | Vector Labs | H-1000< | |
| strong>Antibodies | |||
| 11NQ anticuerpo (anti-ataxina-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-ratón anti-anti-ratón | |||
| Alexa Fluor 594 anti-conejo anti-conejo anticuerpo secundario | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin anticuerpo (cabra) | Santa Cruz | C-20< | |
| strong>Animals | |||
| Control de ratones transgénicos | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| ratones SCA1 | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Ratones de tipo salvaje | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L micrótomo | ERMA | Sledge Microscopio | |
| Fluoview FV1200 Microscopio Confocal | Olympus | ||
| Portaobjetos de glicerol-gelatina | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Jeringa Hamilton | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Unidad de control de electrodos Oxytherm | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. papel | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP& G | póngase en contacto con el autor para correspondencia para obtener información | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P& G Rota-Rod v3.3.3 (software rotarod) | PPP& G Póngase | en contacto con el autor para correspondencia para obtener información | |
| Phidget21.dll (necesario para el software rotarod) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
Referencias
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A.
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Reimpresiones y permisos
