Dirigida Método Evolución en Saccharomyces cerevisiae: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

Summary

Presentamos un protocolo detallado para construir y cribar bibliotecas de mutantes para campañas de evolución dirigida en Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

La evolución dirigida en Saccharomyces cerevisiae ofrece muchas ventajas atractivas en el diseño de enzimas para aplicaciones biotecnológicas, un proceso que consiste en la construcción, la clonación y la expresión de bibliotecas de mutantes, junto a la alta frecuencia de recombinación homóloga de ADN in vivo. A continuación, se presenta un protocolo para crear y bibliotecas mutantes de levadura en pantalla basado en el ejemplo de un fungicida aril-alcohol oxidasa (AAO) para mejorar su actividad total. Dos segmentos de proteínas se sometieron a la evolución dirigida-centrado por mutagénesis aleatoria y recombinación de ADN in vivo. Voladizos de ~ 50 pb que flanquean cada segmento permite el correcto montaje del gen AAO-fusión en un vector linealizado que da lugar a un plásmido de replicación autónoma completa. Bibliotecas mutantes enriquecidos con variantes funcionales AAO se rastrearon en S. sobrenadantes cerevisiae con un ensayo de alto rendimiento sensible basado en la reacción de Fenton. El proceso general deconstrucción de la biblioteca en S. cerevisiae se describe aquí se puede aplicar fácilmente a evolucionar muchos otros genes eucarióticos, evitando reacciones adicionales de PCR, en la recombinación de ADN y la ligadura pasos in vitro.

Introduction

Evolución molecular dirigida es un método robusto, rápido y fiable para diseñar enzimas ^{1, 2.} A través de rondas iterativas de mutación al azar, recombinación y análisis, versiones mejoradas de las enzimas se pueden generar que actúan sobre los nuevos sustratos, en las reacciones novedosas, en no natural ambientes, o incluso para ayudar a la célula para alcanzar nuevos objetivos metabólicos ^3-5. Entre los anfitriones utilizados en la evolución dirigida, levadura Saccharomyces cerevisiae de cerveza ofrece un repertorio de soluciones para la expresión funcional de las proteínas eucariotas complejos que no son de otra manera disponible en ....

Protocol

1. Mutante de construcción de biblioteca

1. Elegir las regiones para ser sometidos al de transformación con la ayuda de algoritmos de cálculo en base a la estructura cristalina o de homología de ¹⁸ modelos disponibles.
   1. Aquí, el objetivo de dos regiones de AAO de Pleurotus eryngii para la mutagénesis al azar y la recombinación (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mientras que la amplificación de la resto del gen (844 bp) por PCR de alta fidelidad (Figura 1).
      Nota: Varios segmentos pueden ser estudiados por MORPHING de manera independiente o combinada ^16.
2. Amplific....

Results

AAO de P. Eryngii es un flavooxidase extracelular que suministra peroxidasas fúngicas con H ₂ O ₂ a empezar a atacar la lignina. Dos segmentos de AAO se sometieron a la evolución dirigida centrado-morphing con el fin de mejorar su actividad y su expresión en S. ¹⁹ cerevisiae. Independientemente de las enzimas extranjeros albergadas por S. cerevisiae, el problema más crítico en la construcción de bibliotecas de mutantes .......

Discussion

En este artículo, hemos resumido la mayor parte de los consejos y trucos empleados en nuestro laboratorio para diseñar enzimas por evolución dirigida en S. cerevisiae (usando AAO como ejemplo) para que puedan ser adaptados para su uso con muchos otros sistemas de enzimas eucariotas simplemente siguiendo el enfoque común se describe aquí.

En cuanto a la creación de la biblioteca, el morphing es un método rápido de un solo recipiente para introducir y recombinar las mutaciones al azar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Medios de cultivo
Ampicilina sódica sal	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactosa	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Rafinosa pentahidratada	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptona	Difco	211677
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracilo	Sigma Aldrich	U1128
Extracto de Levadura	Difco	212750
Levadura Base de Nitrógeno sin Aminoácidos	Difco	291940
Levadura Sintética Drop-out Medio Suplementos sin uracilo	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	>Número de catálogo	Comentarios
2. Reacciones de PCR
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM cada uno
iProof ADN polimerasa de alta fidelidad	Bio-rad	172-5301
Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq ADN polimerasa	Sigma-Aldrich	D4545	Por error PCR
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3. Linealización de plásmidos
	New England Biolabs	R0136S
Albúmina sérica bovina	New England Biolabs	B9001S
Enzima de restricción XhoI	New England Biolabs	R0146S
Enzima de restricción Not I	New England Biolabs	R0189S
Gel Rojo	Biotium	41003	Para teñir el ADN
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4. Ensayos FOX
hierro (II) hexahidratado	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Peróxido de hidrógeno 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX curva estándar
Xilenol Sal disódica naranja	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Número de catálogo	Comments
5. Gel de agarosa
Agarosa	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel	Red Biotium	41003	Tinte de análisis de ADN
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. estándar
Tinte de carga 6x	Thermo Scientific	R0611
Agarosa a baja temperatura de fusión	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Número de catálogo	Comments
6. Kits y células
S. cerevisiae cepa BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	cepa deficiente en proteasa con genotipo: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Azul células competentes	Agilent genomics	200150	Para la purificación y amplificación de plásmidos
NucleoSpin Gel y kit de limpieza de	PCRMacherey-Nagel	740,609,250	Extracción de gel de ADN
NucleoSpin Kit de plásmidos	Macherey-Nagel	740,588,250	Kit de minipreparación de columna
Kit de transformación de levadura	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Incluido portador de ADN (testículos de salmón)
Zymoprep miniprep de plásmido de levadura I	Zymo research	D2001	Extracción de plásmidos de levadura
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
7. Placas
placas de 96 pocillos	Greiner Bio-One	655101	Transparente, no estéril, poliestireno (para mediciones de actividad)
Placas de 96 pocillos	Greiner Bio-One	655161	Transparente, estéril, poliestireno (para microfermentaciones)
Tapa de placa de 96 pocillos	Greiner Bio-One		656171 Transparente, estéril, poliestireno (para microfermentaciones)