Dirigida Método Evolución en

El objetivo general de este protocolo es mostrar cómo construir y analizar bibliotecas mutantes en Saccharomyces Cerevisiae para experimentos de evolución dirigida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la creación de laboratorio utilizadas en experimentos enfocados de evolución dirigida, como por ejemplo cómo asignar regiones solapadas durante el ensamblaje y la clonación. La principal ventaja de esta técnica es su simplicidad y robustez, ya que en un solo paso de transformación es posible obtener niveles con buena calidad.

Este protocolo para la creación y cribado de bibliotecas mutantes se demostrará utilizando una aril-alcohol oxidasa fúngica o AAO. Las regiones para la evolución dirigida enfocada se seleccionan primero con la ayuda de algoritmos computacionales basados en la estructura cristalina disponible o en modelos de homología de la enzima. Se dirigirán dos regiones de la AAO para mutagénesis aleatoria y recombinación: la región M1 y la región M2.

Se realizará una PCR mutagénica para amplificar las regiones diana. Para promover el empalme in vivo en levaduras, se crearán regiones solapadas entre segmentos de aproximadamente 50 pares de bases cada uno mediante la superposición de reacciones de PCR de las regiones definidas. Prepare reacciones de PCR mutagénica de 50 microlitros de volumen, cada una conteniendo 46 nanogramos de molde de ADN, 90 nanomolares de cebadores sentido y antisentido, 0,3 milimolares de dNTPs, 3% de DMSO, 1,5 milimolares de cloruro de magnesio, 0,5 milimolares de cloruro de manganeso y 0,5 unidades por microlitro de la ADN polimerasa tack.

Utilice el siguiente programa de PCR: 95 grados Celsius durante dos minutos, 95 grados Celsius durante 45 segundos, 50 grados Celsius durante 45 segundos y 74 grados Celsius durante 45 segundos durante 28 ciclos, y 74 grados Celsius durante 10 minutos. El resto del gen AAO, la región HF, se amplificará mediante PCR de alta fidelidad con las regiones correspondientes que solapan los segmentos mutagénicos y/o los extremos sobresalientes del vector linealizado incluidos.

Prepare la PCR de alta fidelidad en un volumen final de 50 microlitros que contenga 10 nanogramos de molde de ADN, 250 nanomolares de cada cebador sentido y antisentido, 0,8 milimolar de dNTPs, 3% de DMSO y 0,2 unidades por microlitro de polimerasa de ADN iProof de ultra alta fidelidad. Utilice el siguiente programa de PCR: 98 grados Celsius durante 30 segundos, 98 grados Celsius durante 10 segundos, 55 grados Celsius durante 25 segundos y 72 grados Celsius durante 45 segundos durante 28 ciclos, y 72 grados Celsius durante 10 minutos.

Todos los fragmentos de PCR se purifican luego con un kit comercial de extracción de gel según el protocolo del fabricante. El siguiente paso consiste en linearizar el vector para crear regiones flanqueantes de aproximadamente 50 pares de bases que sean homólogas a los extremos cinco prima y tres prima del gen diana. Prepare una mezcla de reacción de linearización de 20 microlitros que contenga 2 microgramos de ADN, 7,5 unidades de BamH-1, 7,5 unidades de XHO-1, 20 microgramos de BSA y dos microlitros de tampón 10x BamH-1.

Incube la mezcla de reacción a 37 grados Celsius durante dos horas y 40 minutos. Después, inactívela a 80 grados Celsius durante 20 minutos. Para purificar el vector linealizado y evitar la contaminación con el plásmido circular residual, cargue la mezcla de la reacción de digestión en el mega-pocillo de un gel de agarosa de punto de fusión baja semipreparativo.

Cargue cinco microlitros de la mezcla de reacción en el pozo adyacente como un reportero. Realice la electroforesis de ADN a cuatro grados Celsius y cinco voltios por centímetro entre electrodos. Luego, separe el gel de agarosa correspondiente al mega-pozo y almacénelo a cuatro grados Celsius en un XTAE.

Tiña la calle con la escalera de pesos moleculares y el reportero. Visualice las bandas bajo luz UV y haga un corte en la posición donde se encuentra el vector linealizado. En ausencia de luz UV y utilizando como guía los cortes en la calle teñida del reportero, identifique el vector linealizado en el fragmento del pocillo grande y extráigalo.

Extraiga el vector linealizado del agarosa y purifíquelo con un kit comercial de extracción de geles según el protocolo del fabricante. Posteriormente, se mezcla el vector linealizado purificado con los fragmentos de PCR y esta mezcla de ADN se utiliza para transformar células de levadura competentes usando un kit comercial según las instrucciones del fabricante. Siembre las células transformadas en placas SC de selección negativa y incúbelas a 30 grados Celsius durante tres días.

Para preparar este ensayo, seleccione colonias individuales de las placas de descarte SC y transfiéralas a placas de 96 pocillos que contengan 50 microlitros de medio mínimo por pocillo. En cada placa, inocule la columna número seis con el tipo parental como estándar interno. Como control negativo, inocule el pocillo H1, lleno con medio SC suplementado con uracilo, con células viscerales ESI URA3 negativas sin plásmido.

Cubra las placas con sus tapas, envuélvalas con película de parafina y incúbelas a 30 grados Celsius en un agitador húmedo durante 48 horas. Después de 48 horas, agregue 160 microlitros de medio de expresión a cada pocillo y vuelva a sellar las placas. Incube durante 24 horas adicionales.

Después de centrifugar las placas, utilice un robot multicanal de manipulación de líquidos para transferir 20 microlitros del sobrenadante de los pocillos de cada placa a una placa réplica. Añada 20 microlitros de alcohol p-metoxibencílico 2 milimolar y tampón de fosfato sódico 100 milimolar pH 6,0 a cada pocillo. Agite brevemente las placas con un mezclador para placas de 96 pocillos e incúbelas durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue 160 microlitros del reactivo FOX a cada placa réplica y mezcle brevemente con el mezclador. Lea las placas a 560 nanómetros en un lector de placas. Incube las placas a temperatura ambiente hasta que se desarrolle el color.

Mida nuevamente la absorción. La actividad relativa se calcula a partir de la diferencia entre el valor de absorción después de la incubación y el de la medición inicial, normalizado al tipo parental para cada placa. Esta imagen representativa de un gel muestra el vector linealizado en la banda dos, el segmento PCR M1 en la banda tres, el segmento PCR M2 en la banda cuatro, el segmento PCR HF en la banda cinco, y el vector reensamblado in vivo linealizado con NHE uno en la banda seis.

Este siguiente gel muestra la mini-preparación del plásmido del vector reensamblado en la banda dos, el plásmido linealizado con NHE uno en la banda tres, el plásmido linealizado con BamH uno y XHO uno en la banda cuatro, y el plásmido linealizado obtenido mediante extracción en gel y purificación en la banda cinco. Las cargas mutacionales se ajustaron mediante el muestreo de bibliotecas mutantes con diferentes paisajes, calculando el número de clones con menos del 10 % de la actividad enzimática parental y posterior verificación mediante secuenciación de una muestra aleatoria de variantes activas e inactivas. Una evaluación del límite de detección de este ensayo mostró que el ensayo fue lineal en presencia de sorbitol, representado por círculos negros.

En ausencia de sorbitol, representada por los cuadrados blancos, la linealidad fue más persistente pero la respuesta fue más débil. Se observó una correlación lineal entre la concentración de AAO y la absorbancia. Se construyó y analizó una biblioteca de mutantes de 2.000 clones con este ensayo.

El cuadrado sombreado indica los mutantes de AAO con una secreción y actividad notablemente mejoradas frente al alcohol p-metoxibencílico. Una vez dominado, se pueden generar bibliotecas de mutantes en aproximadamente cuatro horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asignar áreas de solapamiento adecuadas para cada familia de PCR y el vector linealizado para la empalme y clonación in vivo en un solo paso de transformación.

Tras seguir un enfoque similar, se pueden realizar otros métodos como muestreo de ADN in vivo, biblioteca de mutagénesis por saturación o ensamblaje de ADN con el fin de construir bibliotecas de mutantes y/o vías metabólicas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioingeniería exploraran actividades, estabilidades o incluso inventaran infinitos tipos de interacciones. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo aprovechar este dispositivo de Saccharomyces cerevisiae para la construcción y cribado de bibliotecas.