Dirigida Método Evolución en Saccharomyces cerevisiae: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

El objetivo general de este protocolo es mostrar cómo construir y seleccionar bibliotecas de mutantes en Saccharomyces Cerevisiae para experimentos de evolución dirigida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el uso de la creación en laboratorio para experimentos de evolución dirigida enfocada, como la forma de asignar áreas superpuestas para el ensamblaje y la clonación. La principal ventaja de esta técnica es su sencillez y robustez, ya que en un solo paso de transformación es algo que se puede asignar a niveles de buena calidad.

Este protocolo para la creación y cribado de bibliotecas de mutantes se demostrará para una oxidasa fúngica de arilo-alcohol o AAO. Las regiones para la evolución dirigida enfocada se eligen primero con la ayuda de algoritmos computacionales basados en la estructura cristalina disponible o los modelos de homología de la enzima. Dos regiones de AAO serán el objetivo de la mutagénesis aleatoria y la recombinación: la región M1 y la región M2.

Se realizará una PCR mutagénica para amplificar las áreas objetivo. Para promover el empalme in vivo en levadura, se crearán áreas superpuestas entre segmentos de aproximadamente 50 pares de bases cada uno mediante la superposición de reacciones de PCR de las regiones definidas. Prepare PCR mutagénicas de 50 microlitros de volumen, cada una con 46 nanogramos de plantilla de ADN, 90 nanomolares de cebadores sentido y antisentido, 0,3 milimolar de DNTP, 3% de DMSO, 1,5 milimolar de cloruro de magnesio, 05 milimolar de cloruro de manganeso y 05 unidades por microlitro de ADN polimerasa pegajosa.

Utilice el siguiente programa de PCR: 95 grados Celsius durante dos minutos, 95 grados Celsius durante 45 segundos, 50 grados Celsius durante 45 segundos, 74 grados Celsius durante 45 segundos durante 28 ciclos y 74 grados Celsius durante 10 minutos. El resto del gen AAO, la región HF, se amplificará mediante PCR de alta fidelidad con las áreas correspondientes superpuestas a los segmentos mutagénicos, y/o salientes vectoriales linealizados incluidos.

Prepare la PCR de alta fidelidad en un volumen final de 50 microlitros que contenga 10 nanogramos de plantilla de ADN, 250 nanomolares de cebadores sentido y antisentido, 0,8 milimolar de DNTP, 3% de DMSO y 02 unidades por microlitro de ADN polimerasa de ultra alta fidelidad iProof. Utilice el siguiente programa de PCR. 98 grados Celsius durante 30 segundos, 98 grados Celsius durante 10 segundos, 55 grados Celsius durante 25 segundos y 72 grados Celsius durante 45 segundos durante 28 ciclos y 72 grados Celsius durante 10 minutos.

A continuación, todos los fragmentos de PCR se purifican con un kit comercial de extracción en gel según el protocolo del fabricante. El siguiente paso es linealizar el vector para crear regiones flanqueantes de aproximadamente 50 pares de bases que son homólogas a los cinco extremos primos y tres primos del gen objetivo. Prepare una mezcla de reacción de linealización de 20 micolitos que contenga 2 microgramos de ADN, 7,5 unidades de BamH-ona, 7,5 unidades de XHO-ona, 20 microgramos de BSA y dos microlitros de tampón 10x BamH-ona.

Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante dos horas y 40 minutos. Después de eso, inactive la reacción a 80 grados centígrados durante 20 minutos. Para purificar el vector linealizado y evitar la contaminación con el plásmido circular residual, cargue la mezcla de reacción de digestión en el megapozo de un gel de agarosa semipreparativo de bajo punto de fusión.

Cargue cinco microlitros de la mezcla de reacción en el pozo adyacente como un reportero. Ejecute la electroforesis de ADN a cuatro grados centígrados y cinco voltios por centímetro entre electrodos. A continuación, separe el gel de agarosa correspondiente al megapozo y guárdelo a cuatro grados centígrados en un XTAE.

Mancha el carril con la escalera de peso molecular y el reportero. Visualice las bandas bajo luz ultravioleta y corte la posición donde se coloca el vector linealizado. En ausencia de luz ultravioleta y utilizando la guía de las muescas en el carril reportero teñido, identifique el vector linealizado en el fragmento del megapozo y excíquelo.

Extraiga el vector linealizado de la agarosa y purifíquelo con un kit comercial de extracción en gel según el protocolo del fabricante. Posteriormente, el vector linealizado purificado se mezcla con los fragmentos de PCR y esta mezcla de ADN se utiliza para transformar las células de levadura competentes utilizando un kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Coloque las células transformadas en placas de desagüe SC e incube a 30 grados centígrados durante tres días.

Para prepararse para este ensayo, elija colonias individuales de las placas de descarte SC y transfiéralas a 96 placas de pocillos que contengan 50 microlitros de medio mínimo por pocillo. En cada placa inocular la columna número seis con el tipo parental como patrón interno. Como control negativo, inocular el pocillo H-one lleno de medios SC suplementado con uracilo con células viscerales ESI negativas URA3 sin plásmido.

Cubra las placas con sus tapas, envuélvalas en film para e incube a 30 grados centígrados en una coctelera húmeda durante 48 horas. Después de 48 horas, agregue 160 microlitros de medio de expresión a cada pocillo y vuelva a sellar las placas. Incubar durante 24 horas más.

Después de centrifugar las placas, utilice una estación robótica múltiple de manejo de líquidos para transferir 20 microlitros del sobrenadante de los pocillos de cada placa a una placa réplica. Agregue 20 microlitros de dos milimolares de alcohol P-metoxibencílico y 100 milimolares de tampón de fosfato de sodio ph 6.0 a cada pocillo. Revuelva las placas brevemente con una batidora de placas de 96 pocillos e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue 160 microlitros del reagant FOX a cada plato de réplica y revuelva brevemente con la batidora. Lea las placas a 560 nanómetros en un lector de placas. Incube las placas a temperatura ambiente hasta que se desarrolle el color.

Vuelve a medir la absorción. La actividad relativa se calcula a partir de la diferencia entre el valor de absorción después de la incubación y el de la medición inicial normalizado al tipo parental para cada placa. Esta imagen de gel representativa muestra el vector linealizado en el carril dos, el segmento de PCR M1 en el carril tres, el segmento de PCR M2 en el carril cuatro, el segmento de PCR HF en el carril cinco y el vector reensamblado in vivo linealizado con NHE uno en el carril seis.

El siguiente gel muestra la mini-preparación del plásmido del vector reensamblado en el carril dos, el plásmido linealizado con NHE uno en el carril tres, el plásmido linealizado con BamH uno y XHO uno en el carril cuatro, y el plásmido linealizado obtenido por extracción y limpieza en gel en el carril cinco. Las cargas mutacionales se ajustaron mediante el muestreo de bibliotecas de mutantes con diferentes paisajes, calculando el número de clones con menos del 10% de la actividad enzimática parental y una verificación adicional mediante la secuenciación de una muestra aleatoria de variantes activas y no activas. Una evaluación del límite de detección de este ensayo mostró que el ensayo era lineal en presencia de sorbitol representado por círculos negros.

En ausencia de sorbitol representado por los cuadrados blancos, la linealidad fue más persistente pero la respuesta fue más débil. Se observó una correlación lineal entre la concentración de AAO y la absorbancia. Se construyó una biblioteca mutante de 2.000 clones y se seleccionó con este ensayo.

El cuadrado sombreado indica los mutantes AAO con una secreción y actividad notablemente mejoradas contra el alcohol P-metoxibencílico. Una vez dominadas, las bibliotecas mutantes se pueden hacer en aproximadamente cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asignar áreas superpuestas adecuadas para cada familia de PCR y vector linealizado para el empalme y la clonación in vivo en un solo paso de transformación.

Siguiendo un enfoque similar, se pueden realizar otros métodos como el muestreo de ADN in vivo, la biblioteca de mutagénesis de saturación o el ensamblaje de ADN para construir bibliotecas de mutantes y/o vías metabólicas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioingeniería exploraran actividades, estabilidades o incluso inventaran infinitos tipos de interacción. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aprovechar este dispositivo de Saccharomyces Cerevisiae para la construcción y detección de bibliotecas