Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

Resumen

La hipofunción de las glándulas salivales, un efecto adverso importante de la radioterapia de cabeza y cuello, disminuye la calidad de vida del paciente. La demostración de la eficacia de nuevas terapias en modelos animales es un requisito previo antes de la transición clínica. Este protocolo describe la administración retroductal y la irradiación local de las glándulas submandibulares de rata.

Resumen

Los tejidos normales que se encuentran dentro de los portales de radiación se dañan inadvertidamente. Las glándulas salivales a menudo se lesionan durante la radioterapia de cabeza y cuello. El daño celular irreparable resulta en una pérdida crónica de la función salival que afecta las actividades orales básicas y aumenta el riesgo de infecciones orales y caries dentales. La hipofunción salival y sus complicaciones afectan gravemente la comodidad del paciente. El tratamiento sintomático actual de la afección es ineficaz y se necesitan terapias más nuevas para aliviar la afección.

Las glándulas salivales son glándulas exocrinas, que expulsan sus secreciones a la boca a través de conductos excretores. La canulación de estos conductos proporciona acceso directo a las glándulas. La administración retroductal de un agente de contraste a las glándulas salivales principales es un procedimiento ambulatorio de rutina para el diagnóstico por imágenes. Con un procedimiento similar, es factible el tratamiento localizado de las glándulas. Sin embargo, la realización de esta técnica en estudios preclínicos con animales pequeños plantea desafíos únicos. En este estudio describimos la técnica de administración retroductal en glándulas submandibulares de rata, un procedimiento que fue perfeccionado en el laboratorio del Dr. Bruce Baum (NIH)¹, y presentamos un procedimiento para la irradiación local de la glándula.

Introducción

destrucción colateral de los tejidos sanos representa un número de deletéreos efectos secundarios de los tratamientos contra el cáncer. Una parte o la totalidad de las glándulas salivales mayores que se encuentran en los campos de radiación se destruyen inevitablemente. Por lo tanto, la mayoría de los pacientes sometidos a radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello, linfoma de cuello de útero, o la radiación de todo el cuerpo antes del trasplante de médula ósea sufren uno de los efectos adversos más comunes y persistentes de la radiación, la hipofunción de las glándulas salivales ^2-6.

Las células acinares de fluido productoras de las glándulas salivales son extremadamente sensibles a la radiación. El daño a las glándulas salivales causa una disminución drástica del flujo salival, una condición que se refiere como hipofunción salival. La reducción crónica del flujo salival perjudica las actividades orales clave como la masticación, deglución, el habla y el gusto, pero las secuelas morboso de un intenso dolor, las lágrimas de las mucosas, disfagia, infecciones oportunistas, y la caries dental empeora unapaciente de bienestar y ^2,3 función.

Dado que la pérdida de células salival radioterapia asociada es irreversible, no existe un tratamiento correctivo de la xerostomía. El tratamiento actual que se centra en aliviando los síntomas con sustitutos salivales artificiales y drogas prosecretory es ineficaz para el alivio a largo plazo ^6. Aunque las técnicas de administración de la radiación mejorados han ayudado a disminuir la gravedad de la enfermedad, la toxicidad tejido normal y sus complicaciones siguen siendo un factor limitante en el tratamiento del cáncer ^6,7. medidas preventivas para evitar las complicaciones asociadas a la radioterapia son, por lo tanto, convirtiendo en la norma. Agentes de radio-protección que limpian las especies de oxígeno de radicales libres, repoblación de células de guarda, o mejoran la reparación del ADN están siendo exploradas para evitar la hipofunción salival ^8-11.

Las secreciones de las glándulas salivales exocrinas drenan en la boca a través de los principales conductos excretores. canulación intra-oral de THe conductos excretores para la inyección de medios de contraste se realiza de forma rutinaria como un procedimiento ambulatorio. Utilizando un enfoque similar, las glándulas salivales pueden ser dirigidos directamente para el tratamiento localizado ^12. Además de reducir el riesgo de efectos secundarios sistémicos, la instilación glándula retroductal tiene beneficios adicionales. La disposición de monocapa de células salivales alrededor del árbol ductal permite la orientación de todas las células epiteliales salivales, y la encapsulación fibrosa de los actos de la glándula como una barrera para reducir la propagación terapéutico deseado. En esencia, las glándulas salivales son óptimamente adecuadas para el tratamiento dirigido de las aflicciones de la glándula como hipofunción salivales inducida por radiación.

radiación convencional para el tratamiento del cáncer se entrega en dosis pequeñas (1.8 a 2.5 Gy / fracción / día, cinco días a la semana) durante un período de semanas. Por lo tanto, un producto terapéutico de radio-protección que muestra eficacia contra un esquema de radiación prolongada en modelos experimentales tiene mayor porte clínica. Comprofunción salival mised después de la radiación fraccionada ha sido registrado en los animales pequeños, pero fuente de radiación, la fracción de la dosis y los protocolos utilizados son variados ^9,10,13.

Este informe establece procedimientos para la administración de retroductal y radiación localizada de rata utilizando glándulas submandibulares fuente de radiación en el paciente relevante y la fracción de la dosis.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por la Salud LSU, Shreveport, Cuidado de Animales y el empleo y estaban de acuerdo con las directrices del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. La canulación de rata submandibular glándulas salivales

1. Preparación de la jeringuilla de la tubería de Asamblea
   1. Cortar una longitud de 10 cm de tubo de polietileno PE10 con un bisturí. Sostenga los dos extremos de la tubería entre el dedo índice y el pulgar. Calentar la sección media de la tubería por encima de una llama suave, y estirar suavemente el tubo ablandado para duplicar su longitud tirando de ambos lados.
   2. Corte el tubo en el medio con un bisturí en un ángulo de 45 ^° para obtener 2 cánulas - cada uno con un extremo cónico. Expandir el extremo no afilado de la cánula por su montaje sobre una aguja 29 G de 0,5 cc jeringuilla de la insulina.
   3. Retire la cánula, y dibujar 220 l de solución salina en la jeringa. Toque para desalojar las burbujas de aire. Montar el cannula sobre la aguja, y empuje el émbolo de la jeringa para expulsar el aire y asegurar la libre circulación de la solución a través de la cánula. Ajuste el volumen a 200 l.
2. La canulación intra-oral de la glándula submandibular de conductos
   NOTA: instrumentos de autoclave antes del procedimiento, y esterilizar en-entre los procedimientos en un esterilizador de cuentas caliente.
   1. Pesar la rata Sprague Dawley, y dispensar el volumen calculado de ketamina (42 mg / kg) / xilazina (8 mg / kg) / acepromazina (1,4 mg / kg) de la mezcla en una jeringa hipodérmica.
   2. Sujeción del animal sujetando la base de la cola entre el dedo índice y el pulgar de una mano y deslizando la otra mano sobre el cuerpo de captarlo. Descansar el dedo índice y medio a lo largo de los lados de la cabeza mientras se mantenga el torso con el pulgar y los dedos restantes.
   3. Se inyecta la anestesia en la musculatura de las extremidades posteriores. Confirmar la profundidad de la anestesia mediante pizca dedo del pie y reflejo palpebral. Aplicar lubricante ocular para evitar la sequedad mientrasanimal es bajo anestesia.
   4. Colocar el animal en una plataforma especialmente diseñada (Figura 1), e involucrar a los dientes incisivos superiores en la barra transversal. Tirar de la mandíbula inferior hacia abajo haciendo un bucle en una banda de goma alrededor de los incisivos inferiores y anclaje a la plataforma.
   5. Pasar una sutura estéril a través de la lengua y la levante hacia arriba para levantar el suelo de la boca. Sujetar las suturas con una pinza hemostática, y pasarlo sobre la barra transversal.
   6. Expandir las mejillas con un esparcidor de mejilla a la medida (Figura 1), y bajo un microscopio de disección localizar las papilas sublingual en el piso de la boca.
   7. Tome el extremo cónico del tubo PE10 preformado mediante un delicado fórceps. manipular suavemente la punta de la cánula en el orificio ductal en la papila sublingual. Confirmar la colocación de la cánula enroscándolo 3-5 mm en el conducto; se asegure de pasar sin ninguna obstrucción.
3. Glándula submandibular Instilación
   1. Inyectar atropina (0,5 mg / kg) por vía subcutánea en la piel del cuello, y esperar 10 minutos para una reducción en las secreciones salivares.
   2. Asegurar la cánula al orificio del conducto con una gota de cianoacrilato (pegamento), y dejar secar. Infundir la solución en la glándula (200 l / glándula) presionando lentamente el émbolo de la jeringa a una velocidad de ~ 50 l / min.
   3. Aplastar el tubo con una pinza hemostática, y retirar con cuidado la jeringa. Retener el tubo en el conducto durante 30 - 60 min hasta que el animal recupera la consciencia. Retire la sutura que mantiene la lengua.
   4. Transferir el animal a una jaula separada, y el uso de una lámpara de calor para mantener el calor durante la recuperación. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado la conciencia para mantener la posición decúbito esternal.
   5. Después de que el animal es totalmente ambulatoria, alojarlo en el vivero con acceso libre a alimento y agua.

2. La irradiación localizada fraccionadode glándulas submandibulares

1. Restringir el animal como se ha descrito antes, y anestesiar con la administración intramuscular de ketamina (33 mg / kg) / xilazina (6 mg / kg) / acepromazina (1 mg / kg) de la mezcla en la extremidad posterior. Confirmar profundidad de la anestesia, y aplicar lubricante a los ojos.
2. Coloque el decúbito supino sobre la mesa de animales acelerador lineal, y extender su cuello por la inclinación de la cabeza. Colimar el campo de radiación (3 cm ancho de la ranura) para abarcar el área desde el borde inferior de la mandíbula a la parte superior del esternón.
3. Coloque un bolo equivalente a tejido 1 cm sobre la región, y ajustar la distancia entre la fuente de radiación y la parte superior del bolo de 100 cm.
4. Irradiar el animal (2,5 Gy) utilizando un 6 MV de fotones de un acelerador lineal. Tasa de dosis, el tamaño del campo, y la distancia desde la fuente de radiación a la superficie de bolo dictará el tiempo de exposición. En la actual configuración, los animales se irradiaron con una dosis de ~ 1 Gy / min.
5. Repita la exposición; 2,5 Gy / día para un total de 8días; 4 días / semana con un intervalo de 2 días en el medio. Mantener caliente el animal durante la recuperación. Transferir el animal para el vivero después de que esté totalmente ambulatoria.
6. Recoger la saliva estimulada glándula submandibular 8 semanas después de la radiación para medir la función de la glándula ^14. La eutanasia a los animales bajo anestesia mediante perfusión cardiaca de frío paraformaldehído al 4% / tampón fosfato salino pH 7,2. Extirpar las glándulas submandibulares para histológico e inmunohistoquímico análisis ^14.

Resultados

La adaptación de una técnica mínimamente invasiva sialografías, el tratamiento local de las glándulas salivales mayores es factible. Administración Retroductal en rata glándulas salivales submandibulares se intentó por canulación intra-oral de los conductos de Wharton (Figura 2). Los conductos salivales de Wharton abiertas en las papilas sub-lingual situado en el piso de la boca, pero los orificios no son fácilmente visibles. La inserción de la cánula fue, por tanto, hec...

Discusión

Las glándulas salivales a menudo reciben dosis de radiación más allá del umbral de la recuperación del tejido en pacientes sometidos a radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello, la ablación electiva de los ganglios del cuello, o neoplasias malignas hematológicas regionales. Aunque las células acinares de fluidos secretores de la glándula son terminales diferenciadas, son paradójicamente sensibles a la radiación. La función secretora cae dentro de las primeras semanas de radiación, e irreversibles daños son el resul...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de polietileno Intramedic (PE10)	Becton Dickson	427401
Jeringa de insulina de 1/2 cc U-100	Becton Dickson	309306
Lágrimas artificiales	Miller Vet Supply	5098-9840-64
Esterilizador de perlas	calientes Fine Science Tools	18000-45
Sutura de seda Perma-Hand	Pinza Ethicon	K833H
Graefe	Fine Science Tools	11051-10
Microscopio estereoscópico Olympus SZX16 Hunt	Óptica e imagen
Acelerador lineal de 6 MV	Elekta
Bolo - Sin piel	Civco	MTCB410
	Braintree Scientific	HL-1  110V

Lámpara de calor