Artículo de método

La extracción de las métricas para los sistemas de raíces de tres dimensiones: volumen y de superficie Análisis de In-suelo de rayos X de tomografía computarizada de datos

DOI:

10.3791/53788

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26 de abril de 2016

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1Environmental Molecular Sciences Laboratory

En este artículo

Resumen

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Se presenta una metodología para obtener información de la estructura de la raíz visual y cuantitativo a partir computarizada de rayos X de tomografía de datos adquiridos en el suelo.

Resumen

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raíces de las plantas juegan un papel crítico en las interacciones planta-suelo-microorganismo que se producen en la rizosfera, así como los procesos con implicaciones importantes para el cambio climático y el manejo del cultivo. información cuantitativa sobre las raíces en su ambiente nativo es muy valiosa para el estudio de crecimiento de las raíces y los procesos ambientales que involucran plantas. De rayos X de tomografía computarizada (XCT) ha demostrado ser una herramienta eficaz para la exploración in situ y el análisis de la raíz. El objetivo fue desarrollar una herramienta sin costo y eficiente que se aproxima a la superficie y el volumen de la raíz, independientemente de su forma a partir de datos tridimensional-(3D) de tomografía. La estructura de la raíz de un dropseed Prairie (heterolepis Sporobolus) espécimen fue fotografiada usando XCT. La raíz se reconstruyó, y la estructura de la raíz primaria se extrae de los datos usando una combinación de software con licencia y de código abierto. Una malla poligonal isosuperficie fue creado entonces para facilitar el análisis. Hemos desarrollado tél independiente Aplicación imeshJ, generado en MATLAB 1, para calcular el volumen de la raíz y la superficie de la malla. Las salidas de imeshJ son área superficial (en mm 2) y el volumen (en mm 3). El proceso, que utiliza una combinación única de herramientas de formación de imágenes para el análisis cuantitativo de la raíz, se describe. Una combinación de XCT y el software de código abierto demostrado ser una poderosa combinación para no invasiva muestras de raíces de plantas de imagen, datos de raíz segmento, y extraer información cuantitativa de los datos 3D. Esta metodología de procesamiento de datos en 3D debe ser aplicable a otros sistemas de material / muestra donde hay conectividad entre los componentes de la atenuación de los rayos X y similares surgen dificultades con la segmentación.

Introducción

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Roots, como parte de la rizosfera 2-5, representan una parte "invisible" de la biología vegetal desde el suelo hace que sea difícil a las raíces de la imagen no invasiva 6, 7. Sin embargo, el estudio de crecimiento de las raíces y la interacción dentro del ambiente del suelo es crítico para la comprensión root / crecimiento de las plantas y el ciclo de nutrientes, que a su vez afecta a la forestación, la seguridad alimentaria, y el clima. De rayos X de tomografía computarizada (XCT) ha demostrado ser una herramienta valiosa para la formación de imágenes no invasiva de muestras de raíces de plantas en su entorno local 8. Con el fin de medir el desarrollo de las raíces y los cambios dimensionales en diferentes condiciones, y poder comparar datos de diferentes conjuntos de datos / muestras, hay que extraer información cuantitativa de los datos de la tomografía. La segmentación de los datos de la raíz de la del suelo circundante, es decir, el aislamiento de la imagen raíz de todo lo demás alrededor de ella (incluyendo, por ejemplo, una planta vecina) es un paso crítico antes de ACCUanálisis de tamaño de tasa se puede hacer. Sin embargo, un enfoque de umbral simple es a menudo inviable para los datos del directorio raíz. Los retos asociados con raíces de las plantas de imágenes en el suelo incluyen las variaciones en las propiedades de atenuación de rayos X del material de raíz, y la coincidencia en los valores de atenuación entre la raíz y el suelo causada por el agua y la materia orgánica. Estos temas se han tratado magníficamente recientemente por Mairhofer et al. en su herramienta de seguimiento visual RooTrak 7, 9. El siguiente paso después de una segmentación exitosa es la determinación exacta del volumen raíz y superficie. El volumen puede ser estimado contando el número de voxels y multiplicando por cubos tamaño de los voxels 'como se muestra antes de 7. Para una determinación más precisa de la zona de superficie de la raíz y el volumen, la isosuperficie del sistema radicular segmentado puede ser representado por una malla de triángulos, usando un algoritmo conocido como Marching Cubes 10. La fuente abierta ImageJ 11 puede emplearse para aproximar THvolumen raíz e basado en el algoritmo de Marching Cubes. A lo mejor de nuestro conocimiento, sólo un número limitado de software de código abierto dedicado a calcular los datos de volumen / superficie basada en tomografía de muestras de raíces en el rango centímetro y actualmente está disponible por encima de 12. Un software de código abierto que nos aguarda a 13 se centra en el crecimiento de raíces y está dirigido a las funciones celulares que permiten el análisis cuantitativo del volumen en la resolución de una sola célula. Algunos programas de software de código abierto dedicado a los sistemas de raíces enteras 14 es excelente para sistemas de raíces tubular de pequeño diámetro en base a la aproximación de que su forma es en realidad tubular. Sin embargo, algunos trabajos con imágenes 2D y son incapaces de manejar 3D apila 14. Por otra parte, la aproximación forma tubular puede no ser válido cuando se estudian sistemas de raíces con superficies rugosas y formas no uniformes, tales como los de los árboles. 15 Otro enfoque utiliza dos dimensiones secuencias de imágenes rotacionales (2D) de elusión de manera innovadora THe la necesidad de un escáner CT costoso. Mide, registra y muestra erradicar longitudes del sistema. El software que hemos probado de los que sólo están disponibles comercialmente 16-18; uno no parece ser capaz de manejar la imagen 3D pilas 16, el segundo es un área de la hoja y la medición de la longitud de la raíz de herramienta 17, mientras que el tercero se basa en el análisis del color 18. Sobre la base de este estudio, se sugiere que una opción sin costo que se aproxima a la superficie y el volumen de la raíz, independientemente de su forma a partir de datos de tomografía 3D es deseable.

Sobre la base del RooTrak libremente disponible y ImageJ, hemos desarrollado un programa, llamado imeshJ (ver archivo de código complementario) que procesa una malla isosuperficie (archivo de estereolitografía superficie) generado a partir de datos del directorio raíz segmentados, y calcula el volumen y el área superficial de la raíz por haciendo cálculos geométricos sencillos en los datos del índice de triángulo de la malla. Aquí mostramos un método que combina el uso de imágenes XCT,la reconstrucción y visualización de datos (software CT Pro 3D y VG Studio), la segmentación de la raíz de la muestra de suelo en los datos en 3D (software de fuente abierta ImageJ y RooTrak), y la extracción de la información de la superficie y el volumen de una malla triangular (ImageJ y el código imeshJ ordenador).

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Protocolo

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Precaución: El funcionamiento de un escáner de tomografía de rayos X requiere tanto la formación de radiación en general, y la formación de la seguridad radiológica específica del instrumento. Todos los procedimientos correspondientes pertinentes al laboratorio del investigador deben ser seguidas.

Imaging 1. Raíz

Nota: Este paso se describe la obtención de imágenes de un espécimen de hierba mantenidas en su suelo original en una maceta de plástico tubular (un tubo de plástico con un diámetro de 40 mm, una altura de 210 mm, y el espesor de pared de aproximadamente 2 mm).

  1. Coloque la planta en maceta en el manipulador de muestras del instrumento a una distancia determinada para la ampliación de destino. Para una planta en un soporte de 2 pulgadas de diámetro, la muestra a distancia de la fuente debe ser de aproximadamente 3 pulgadas (7 cm).
  2. Ajustar la configuración de escaneo de rayos X para lograr un color óptimo (nivel de gris) contraste de la imagen en el detector. Nota: Estos ajustes están disponibles en el software de control del instrumento utilizado.
    1. Establecer la configuración de energía de rayos X; 85 kV y 190 mu se utilizaron en este examenPLE.
    2. Establecer el tiempo de exposición. Aquí, se utilizó un tiempo de exposición relativamente largo de 1 seg para una mejor relación señal-ruido.
    3. Establecer el número de proyecciones y cuadros por proyección; 4 fotogramas por proyección para un total de 3.142 proyecciones se sugiere para las buenas estadísticas de los datos.
    4. Ejecutar una corrección de sombreado usando las condiciones de medición indicados anteriormente seleccionando la pestaña "Corrección de sombras", y haciendo clic en "Crear".
      Nota: La corrección de sombreado compensa la variación en la respuesta de los píxeles del dispositivo de formación de imágenes cuando se ilumina con un conjunto constante de flujo de rayos X. El proceso de toma imágenes en blanco (con la muestra retirado del camino del haz) con el haz de rayos X activado, y con el haz de apagado. Esta corrección se aplica a todas las imágenes recogidas.
    5. Seleccionar la opción "Reducir al mínimo los artefactos de anillo" (también llamado "modo yendo y viniendo"); la muestra se hará girar en pasos angulares, mientras que las imágenes de proyección se adquieren. Esto conduce a DATuna adquisición a un ritmo más lento, pero ayuda a eliminar artefactos de anillo.
    6. Iniciar la búsqueda haciendo clic en el botón "Adquirir" en la pestaña de adquisición (con los ajustes descritos anteriormente, la colección de imágenes durará aproximadamente 4 horas).

Reconstrucción 2. Datos

Nota: En esta sección se describe la reconstrucción de los datos de volumen 3D a partir de las imágenes en bruto (radiografías de la tomografía computarizada).

  1. Cargar los datos en bruto en el programa.
  2. Comparar primera y la última imagen (que debería ser casi idéntica como la última imagen se toma después de una rotación de la muestra 360 o) para asegurarse de que el espécimen no se movió ni la configuración del análisis no cambió durante la adquisición de datos.
  3. Calcular el centro de rotación (COR), seleccionando la pestaña "Centro de rotación", y haciendo clic en "Inicio"; opciones de uso "automático" COR encontrar con "alta calidad" exactitud, y "dual" (superior e inferior) s rebanadaelecciones para el cálculo COR.
  4. Seleccione el volumen de la muestra que ser reconstruido: seleccione la pestaña "Volumen", y editar las ventanas de selección de volúmenes utilizando las miniaturas.
  5. Realizar la reconstrucción para crear el archivo de volumen que contiene datos 3D haciendo clic en "Inicio".

3. Procesamiento de Datos / Segmentación

Nota: En esta sección se describen los pasos a seguir para preparar los datos reconstruidos para su posterior procesamiento en el programa RooTrak para rastrear las raíces que se ramifican a través del suelo, y aislar las raíces de cualquier material circundante para producir una pila de imágenes binarias de sólo el raíz en sí.

  1. Tratamiento de los datos de volumen en ImageJ para preparar una pila procesable RooTrak:
    1. Cargar el archivo de volumen en ImageJ.
    2. Optimizar el contraste de la imagen entre la raíz y el suelo mediante el ajuste de brillo y contraste (imagen / Ajuste / Brillo / Contraste). Cuando la región de interés dentro de la imagen es visible y clearly distinguibles, los ajustes se consideran optimizadas.
    3. Guardar como una pila de imágenes en formato JPEG, BMP o PNG.
  2. Procesamiento en RooTrak al segmento de la raíz:
    1. Cargar pilas de imágenes en RooTrak (ir a la pestaña "Herramientas", y pulse "Tracker").
    2. Definición de puntos de semillas en el interior de la raíz: haga clic en varios puntos dentro de cada una de las secciones pertinentes de raíces visibles en la vista superior rebanada de los datos de volumen.
    3. Establecer los parámetros del gestor "lisura" y "similitud" de 0,3 y 0,8, respectivamente.
    4. Ejecutar la función de seguimiento. Esto seguirá la raíz de la rebanada de la parte superior de todo el camino a la división inferior.
    5. Después de ver los datos de volumen, seleccionar el número de cortes de acuerdo con el volumen de datos utilizable; en este caso, el seguimiento se detuvo en 200 rebanadas, equivalente a una profundidad de 6,2 mm, donde los límites de la raíz se convirtieron en mal definidos (la imagen de la raíz seguido comenzó a mezclar en la del suelo).
      Nota: Elpila imagen producida se guarda automáticamente en donde se creó el directorio de salida.

4. Volumen y Análisis de superficies

Nota: Este paso se describe la generación de mallas isosuperficie de la pila imagen creada por RooTrak.

  1. Convertir imagen pila de RooTrak en un formato de imagen binaria en ImageJ. Seleccione "Proceso", luego "binario", luego "Hacer binario".
  2. Utilizar el plugin de ImageJ de código abierto, BoneJ, para crear la red de triangulación; en ImageJ seleccionar "Plug-ins", luego "BoneJ", luego "Isosuperficie".
  3. Ajuste "remuestreo" y "Umbral" a 6 y 120, respectivamente (configuración por defecto). Comprobar los "superficie", y pulse el botón "OK".
  4. En el "visor 3D" haga clic en la pestaña Archivo, luego en "superficies de exportación", a continuación, guardar como "STL (binario)".
  5. Abrir imeshJ, seleccione el archivo STL e introduzca el tamaño del voxel en micras. Haga clic en "Calculate Superficie "para la adquisición total de la superficie de la raíz de la muestra en 2 mm. Del mismo modo, haga clic en" Calcular el Volumen "para obtener el volumen total de las raíces de la muestra en 3 mm.

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Resultados

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La muestra consta de dos tallos de la hierba nativa de la pradera dropseed (Sporobolus heterolepis) y el suelo original alrededor de ella fue tomado de una zona residencial y se coloca en un pequeño recipiente en forma de tubo se ve en la Figura 1. El tamaño del voxel datos reconstruidos fue de aproximadamente 31 micras x 31 micras x 31 micras. El archivo de volumen reconstruido se utiliza para crear una pila de imágenes desde una orientación seleccionada (vista...

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Discusión

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Una combinación de computarizada de rayos X de tomografía y varios programas de código abierto demostrado ser una poderosa combinación para no invasiva muestras de raíces de plantas de imagen, datos de raíz segmento, y extraer información cuantitativa (superficie y volumen) a partir de los datos 3D. Nuestra capacidad de visualizar y medir características es siempre limitado por la resolución de escaneado, así como por las limitaciones del software RooTrak. Sin embargo, la resolución de escaneado fue suficiente para capt...

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Divulgaciones

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No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Ciencias Moleculares Ambientales, una instalación nacional de usuarios científicos patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental del Departamento de Energía y ubicada en el Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
X-Tek/Metris XTH 320/225 kV Escáner de tomografía de rayos XNikon Metrology
Inspect XNikon MetrologySoftware de control de instrumentos
CT Pro 3DNikon MetrologySoftware de reconstrucción, versión XT 2.2
VG Studio MAXVisual Graphics GmbHSoftware de visualización para volúmenes 3D, versión 2.1.5
ImageJCódigoabiertoSoftware de procesamiento y análisis de imágenes, versión 1.6
RooTrakcódigo, versión 0.3.1-b1 beta
imeshJEMSLMATLAB script desarrollado por los autores
Muestrade pradera Muestra obtenida del suelo en una zona residencial
de Software de segmentación de raíces de abierto de hierba de semilla

Referencias

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  4. Gregory, P. J. Roots rhizosphere and soil: the route to a better understanding of soil science? Eur. J. Soil Sci. 57 (1), 2-12 (2006).
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