Artículo de método

El aislamiento de las células mieloides de ratón de la piel y el drenaje de ganglios linfáticos Siguiendo intradérmica La inmunización con viva atenuada

DOI:

10.3791/53796

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18 de mayo de 2016

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1Unité de Biologie et Génétique du Paludisme, Institut Pasteur, 2Unité dImmunobiologie des Cellules Dendritiques, Institut Pasteur

En este artículo

Resumen

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Describimos aquí un protocolo para aislar células mieloides de la piel del ratón y drenar el ganglio linfático después de la inyección intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. La citometría de flujo de las células recolectadas proporciona un ensayo confiable para caracterizar la respuesta inflamatoria de la piel y los ganglios linfáticos de drenaje al parásito.

Resumen

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Infección de la malaria comienza cuando la fase de esporozoito de Plasmodium se inocula en la piel de un huésped mamífero a través de una picadura de mosquito. El parásito muy móviles no sólo llega al hígado a invadir hepatocitos y transformar en forma globular-infeccioso. También migra en la piel y a los ganglios linfáticos de drenaje proximal del sitio de inyección, en los que puede ser reconocido y degradado por residentes y / o células mieloides reclutados. Intravital de imágenes informó el reclutamiento temprano de brillantemente fluorescente Lys-GFP leucocitos positivos en la piel y las interacciones entre los esporozoitos y CD11c + células en el ganglio linfático de drenaje. Presentamos aquí un procedimiento eficaz para recuperar, identificar y enumerar los subconjuntos de células mieloides que son reclutados a la piel del ratón y drenan los ganglios linfáticos después de la inyección intradérmica de inmunización de dosis de esporozoitos en un modelo murino. Caracterización fenotípica utilizando el flujo multi-paramétrico proporciona citometríaun ensayo fiable para evaluar los cambios celulares tempranos dinámicos durante la respuesta inflamatoria a la infección por Plasmodium.

Introducción

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La malaria es una de las enfermedades infecciosas más mortales en el mundo, matando a más de medio millón de personas por año. La infección por Plasmodium, el agente causal de la enfermedad, comienza por una fase pre-eritrocítica (PE). Durante esta fase, los esporozoitos inyectados en la piel de acogida por un mosquito anófeles hembra llegan al hígado a través del torrente sanguíneo y se diferencian los hepatocitos dentro en las formas de parásitos que infectan a las células rojas de la sangre y causan los síntomas de la enfermedad.

Las etapas de educación física de Plasmodium representan un objetivo privilegiado para la vacunación contra la malaria. De hecho, las vacunas vivas atenuadas contra estas etapas, tales como esporozoitos atenuados por radiación (RAS), parásitos detenidos genéticamente (BPA) o quimioprofilaxis y esporozoitos (CPS) han demostrado su capacidad para proteger tanto a los roedores y humanos anfitriones 1-9. En el modelo de roedores, se llevan a cabo la mayoría de los estudios de vacunación utilizando la inmunización por vía intravenosa, Que es el estándar de oro en términos de eficacia protectora. Sin embargo, la descripción de una etapa de la piel y la importancia de los ganglios linfáticos de la piel asociada de drenaje (DLN) en la obtención de la protección ha cambiado nuestra percepción de la fase de PE y enfatizó la importancia de la vía intradérmica de la inyección. Intravital de imágenes de P. esporozoitos berghei inyecta en la piel de los roedores se ha demostrado que sólo ~ 25% del inóculo llega al hígado a través del torrente sanguíneo. El restante 75% ~ distribuye entre el DLN proximal (~ 15%) y la piel (~ 50%) 10,11, donde una pequeña proporción puede transformar y permanecer con vida durante semanas dentro de las células de la piel 12,13. Por otra parte, los estudios posteriores describen que el establecimiento de la inmunidad protectora eficaz después de la inmunización intradérmica se realiza principalmente en la piel-DLN, donde se activan las células T CD8 + específicas del parásito, y sólo de forma marginal en el bazo o del hígado-dLNs 14,15.

Mientrasla mayoría de los estudios se han centrado en la caracterización de las células efectoras implicadas en el establecimiento de la respuesta inmune protectora, se sabe mucho menos sobre el destino de parásitos vivos atenuados inyectados en la piel, especialmente sus interacciones con el sistema inmune innato. En particular, la caracterización de las células presentadoras de antígenos que participan en la absorción de antígeno del parásito, el procesamiento y la presentación a las células T CD8 + es de importancia crítica, sabiendo que la adquisición antígeno PE puede ocurrir tanto en la piel y compartimentos DLN. Anteriores estudios de imagen intravital describen una afluencia temprana de las células fluorescentes brillantes Lys-GFP positivas en la piel después de una picadura de un mosquito infectado 16, mientras que se observaron las primeras interacciones entre los esporozoitos y las células dendríticas en el DLN 10,17. Más recientemente, se ha informado de que los esporozoitos inoculados en la piel por los mosquitos aumenta la motilidad de tanto las células T reguladoras dendríticas y en la piel delos ratones, mientras que se observó una disminución del número de células presentadoras de antígenos en el DLN 18.

El objetivo fue identificar y cuantificar con más precisión los subconjuntos de leucocitos reclutados en la piel y los correspondientes DLN, así como aquellos que interactúan con el parásito después de la inyección intradérmica de la inmunización de dosis de RAS 19. En este contexto, aislamos células mieloides (CD45 + CD11b +) de ambos tejidos y caracterizado subpoblaciones de interés por el multi = flujo paramétrico citometría. De acuerdo con la respuesta inmune se describe en la etapa temprana de Leishmania major infección de la piel 20, la respuesta del huésped primario a esporozoitos de inyección consta de un reclutamiento sucesiva de los neutrófilos polimorfonucleares (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguidos de monocitos inflamatorios (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) que se identifican sobre la base de Differential expresión de los marcadores de superficie Ly6G y Ly6c.

Se describe aquí un protocolo para el aislamiento de células mieloides de la piel del ratón y DLN después de la inyección intradérmica de la inmunización de dosis de RAS extraídos de las glándulas salivales de mosquitos infectados. inyecciones intradérmicas reproducibles y procesamiento de tejidos son pasos críticos para cuantificar los cambios fenotípicos de infiltrarse en la población de células dentro de los tejidos infectados. El enfoque se detalla a continuación proporciona un ensayo fiable para evaluar la piel y la respuesta inflamatoria DLN a Plasmodium parásito y se puede extender a varios sistemas experimentales.

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Protocolo

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Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité del Instituto Pasteur y por el Comité de Ética local de Experimentación Animal (Comité Ético IDF-París 1, París, Francia; número de contrato: 2.012-0.015) y realizan de acuerdo con las directrices y regulaciones aplicables.

1. Materiales y Reactivos

  1. Utilice la hembra Anopheles stephensi (cepa mosquitos Sda500) que se alimentan de ratones infectados 3-5 días después de la emergencia y posterior, tal como se ha descrito previamente 21.
  2. Use parásitos Plasmodium berghei ANKA clon que expresa el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de la proteína de choque térmico constitutiva 70 (HSP70) promotor. Esto produce fluorescencia brillante durante todo el ciclo de vida del parásito 22.
  3. los ratones C57BL / 6JRj uso femenino (de 7 semanas de edad).
    NOTA: Todos los reactivos utilizados en el protocolo descrito se enumeran en la T abla de Materiales / Equipos.
_TITLE "> 2. La radiación atenuada Aislamiento esporozoitos de las glándulas salivales del mosquito

  1. Entre 18-25 días después de la harina de sangre infecciosa, recoger y fría-anestesiar a los mosquitos en un tubo de 15 ml en hielo como se ha descrito previamente 21. transferir cuidadosamente en una placa de Petri invirtiendo el tubo. Mantener los insectos en el hielo y exponer los mosquitos a una dosis de 12 krad de γ- o X-irradiación.
  2. Aislar esporozoitos atenuados de las glándulas salivales de mosquitos irradiados como se ha descrito previamente 21. Recoger las glándulas salivales infectadas en un volumen pequeño (alrededor de 15 l) de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x (DPBS) en hielo y suavemente aplastarlos para liberar los esporozoitos.
    NOTA: La inyección de una suspensión de parásitos altamente concentrada en un pequeño volumen de ser crítico, es por lo tanto esencial para cosechar un número suficiente de glándulas salivales de un alto número de mosquitos infectados preseleccionados bien, como lo demuestra su sólida expresión deverde-fluorescencia.
  3. Filtrar la suspensión esporozoito a través de un tapón de filtro de células 35 micras adaptado a una adherencia 1,5 tubo bajo ml de microcentrífuga a fin de eliminar grumos y residuos mosquito.
  4. Contar el número total de esporozoitos aislados como se describió anteriormente 21 y ajustar la concentración de la suspensión de parásitos de frío 1x DPBS para obtener 83.000 esporozoitos / l. Almacenar los parásitos en hielo mientras continúan los pasos a seguir.
  5. Recoger el número equivalente de las glándulas salivales de mosquitos no infectados que se utilizarán como control negativo y procesar la muestra como se describe en los pasos 2.2 y 2.3. Diluir la muestra como se indica anteriormente para obtener concentración similar de extractos de glándulas salivales en la suspensión.
    NOTA: Los esporozoítos se pueden almacenar en hielo durante un máximo de 2 horas. Sin embargo, lo ideal sería que se inyectan dentro de una hora después de aplastar las glándulas salivales.

3. La inyección de esporozoitos en el dérmica Layer de la Oreja

  1. Anestesiar los animales mediante inyección intraperitoneal de ketamina (50 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) mezcla. Espere 5-8 minutos para el ratón para estar en un estado de inconsciencia y aplicar pomada oftálmica para los ojos para evitar el secado de la córnea. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie suave en ambos pies traseros.
    NOTA: La dosis de anestesia dura menos de 20 minutos, por lo que los próximos pasos debe hacerse rápidamente.
  2. Estabilizar el pabellón de la oreja del ratón mediante la fijación de la parte ventral con cinta transparente colocado previamente bajo un microscopio estereoscópico (Figura 1A). Presione suavemente el oído para evitar el daño de la vasculatura.
  3. Cargar un / aguja biselada de calibre 35 10 l jeringa con 0,6 l de parásitos se volvieron a suspender 10.
  4. Entregar la suspensión de esporozoitos en 4 puntos de inyección (0,15 l por sitio) mediante la inserción de la aguja con cuidado en el lado dorsal de la oreja (Figura 1A), debajo de la epidermis, conel bisel hacia arriba, teniendo cuidado de evitar cualquier vaso sanguíneo. Permita que la aguja permanezca en la dermis para unos pocos segundos para evitar el reflujo de la inyectante antes de retirarlo. Observar una pápula característica en cada punto de inyección al final del procedimiento (Figura 1B y 1C).
  5. Después de la inyección, retire con cuidado la oreja de la cinta.
  6. Inyectar el oído contralateral con la misma dosis de parásitos siguiendo el 3/2 a 3/4 pasos.
  7. Inyectar 2 ratones adicional, ya sea con 0,6 l de 1x DPBS o 0,6 l de 1x DPBS + extracto de glándula salival de los mosquitos infectados con el fin de evaluar la respuesta inflamatoria mediada por la inyección solo y la deposición de material de mosquito en la dermis.
  8. Seguimiento de la recuperación de ratón de la anestesia antes de colocarlo de nuevo en la jaula.
    NOTA: La deposición de esporozoitos adecuada en la piel se puede monitorizar mediante microscopía de fluorescencia (Figura 2A y 2B), El ratón se preparó como se describe previsously 23.

4. La piel y disección del ganglio linfático drenante

  1. Preparar medio estándar (SM) como sigue: de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 25 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) suplementado con 400 U / ml de colagenasa y 50 mg / ml de desoxirribonucleasa (DNasa) .
  2. Se preparan dos placas de cultivo tisular de 6 pocillos de fondo plano sobre hielo con 4,5 ml de SM + 70 micras colador de células por pocillo para muestras DLN (Placa A) y 4,5 ml de SM por pocillo de muestras de piel (Placa B).
  3. En el punto de tiempo deseado después de la inoculación de esporozoitos, profundamente anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de ketamina (125 mg / kg) / xilazina (12,5 mg / kg) mezcla antes de la dislocación cervical. Asegúrese de que el ratón demuestra signos de muerte clínica y comenzar la disección inmediatamente.
    NOTA: La cinética de reclutamiento de células mieloides pueden ser examinados en diferentes momentos después de injección (es decir, 2 horas, 4 horas y 24 horas como se ha descrito previamente 14).
  4. Desinfectar el oído inoculado y la región del cuello correspondiente con 70% de etanol para reducir la posibilidad de contaminación.
  5. El uso de tijeras y pinzas estériles, asépticamente diseccionar los extremos proximal DLN auricular sin recoger la grasa circundante. Realizar una primera incisión en el surco yúgulo-carotidian y quitar los pelos del campo operativo. Estirar la incisión con 2 pinzas para exponer el DLN que aparece grisáceo en comparación con el tejido circundante.
  6. Pellizcar los tejidos conectivos cuidadosamente sobre la parte superior de la DLN con una pinza para facilitar su eliminación. Extraer el DLN mediante la colocación de una pinza debajo del tejido linfoide (Figura 3A y 3B). Coloque el DLN en un pozo que contiene filtro de células de 4,5 ml de SM + 70 micras (placa A).
  7. Efectuar toda la oreja inoculado con unas tijeras afiladas estériles y pinzas (Figura 4A). Separcomieron los aspectos dorsal y ventral de la oreja por pellizcos y espaciado aparte del corte termina con dos pinzas (Figura 4B - 4E). Colocarlos en un pozo que contiene 4,5 ml de SM (Placa B) asegurándose de que ambos tejidos se sumergen completamente en el medio.
    NOTA: Con el fin de mejorar la fiabilidad del experimento y aumentar el número de células de interés, piscina 2 inyecta oídos o 2 dLNs desde el mismo ratón por muestra.
  8. La cosecha y el proceso en paralelo de las orejas y dLNs de ratones inoculados con cualquiera 1x DPBS o extractos de glándulas salivales. Incluya 2 muestras para los oídos y los ganglios linfáticos adicionales cosechadas a partir de un ratón ingenuo para los controles de compensación tinción negativa e individuales.

5. aislamiento de células de los ganglios linfáticos

  1. Incubar los ganglios linfáticos (figura A) a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 15 minutos con agitación suave. Añadir ácido etilendiaminotetraacético 10 mM final (EDTA) por pocillo para neutralizar la colagenasa y ADNasa actividades. Realice los siguientes pasos en el hielo.
  2. Disociar ganglios linfáticos utilizando el extremo superior de un émbolo de la jeringa 5 ml. Presione con movimientos circulares contra el colador hasta que todo lo que queda es el tejido conectivo blanco.
  3. Enjuague el filtro de células dos veces con DPBS 500 l 1x + 2% de suero bovino fetal (FBS) + EDTA 2 mM. Transferir la totalidad del volumen del pozo en un tubo de 15 ml.
  4. Enjuague el bien dos veces con 500 l DPBS 1x + 2% de FBS + 2 mM de EDTA y transferir el volumen en el tubo de 15 ml. Mantenga los tubos en hielo.

6. Aislamiento de la célula de piel de la oreja

  1. Incubar los folletos del oído (Placa B) a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 1 hora con agitación suave.
    NOTA: Después de 20 minutos de incubación, cortar los folletos para los oídos con las tijeras en trozos pequeños para facilitar la digestión del tejido y se coloca la muestra de nuevo en la incubadora durante los 40 minutos restantes. Las células individuales pueden ser observadas en el medio al final del tiempo de incubación.
  2. Añadir final de 10 mM EDTA por pocillo para neutralizar las actividades de la colagenasa y ADNasa. Realice los siguientes pasos en el hielo.
  3. La transferencia de los fragmentos de tejido del oído y todo el volumen de medio en un nuevo pocillo que contenía un filtro de células de 70 micras utilizando una pipeta de 1 ml. Cortar 2 a 3 mm desde el extremo de la punta para recoger los fragmentos de tejido del oído con más facilidad.
  4. Disociar fragmentos de tejido del oído utilizando el extremo superior de un émbolo de la jeringa 5 ml. Presione con movimientos circulares contra el colador hasta que todo lo que queda es el tejido conectivo blanco.
  5. Enjuagar los filtros de células dos veces con DPBS 500 l 1x + 2% de FBS + EDTA 2 mM.
  6. Transferir todo el volumen del pozo en un 50 ml de tubo a través de un filtro de células de 70 micras.
  7. Enjuague el pozo con 500 l 1x DPBS + 2% de FBS + EDTA 2 mM y transferir el volumen en el tubo de 50 ml. Mantenga el tubo en hielo.
    NOTA: Las diferentes medidas para aislar células totales de la piel y los tejidos DLN se resumen en la Figura 5.
título "> 7. Contar y viabilidad de las células recogidas

  1. Centrifugar la piel y las muestras DLN durante 5 min a 450 xga 4 ° C y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 300 l DPBS 1x + FBS al 2% + EDTA 2 mM.
  2. Recoger un pequeño volumen de cada muestra para contar el número total de células aisladas de la piel y DLN utilizando un hemocitómetro. Añadir 0,04% de azul de tripano para determinar la viabilidad celular.

8. El bloqueo de la no-unión específica de antígeno

  1. Añadir 10 g / ml de anticuerpo no marcado CD16 / CD32-Fc bloque. Incubar 20 min a 4 ° C (se puede ir más tiempo).
  2. Añadir 2 ml de DPBS frío 1x + FBS al 2% + EDTA 2 mM. Centrifugar la muestra durante 5 min a 450 xg a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 300 l DPBS 1x + FBS al 2% + 2 mM EDTA y mantener las muestras en hielo.

9. manchas en la piel y las células de ganglios linfáticos mieloides

  1. Incubar de esquí que estuvo bloqueadon y DLN aislado células con rastreador Live / Dead (es decir, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol o DAPI), anti-CD45 y anti-CD11b anticuerpos específicos.
    NOTAS: Con el fin de enriquecer las subpoblaciones de células mieloides de interés, especialmente los raros, las células CD45 + y los linfocitos se pueden purificar, respectivamente, de la piel o agotados de la DLN por perla magnética clasificación de células facilitador. Dado que la mayoría de las células aisladas de la DLN son CD45 +, el uso de anti-CD45 no es obligatorio. Otros marcadores pueden ser incluidos para identificar subpoblaciones de células mieloides de interés por la estrategia positivo o negativo gating. En este protocolo, las células mieloides reclutados en el DLN se enriquecieron mediante la exclusión de las células CD8a + (todo el compartimento de células T puede ser dirigido mediante el uso de anti-CD3 anticuerpo específico).
  2. Incubar 30 min a 4 ° C en la oscuridad. Añadir 500 DPBS l 1x + FBS al 2% + EDTA 2 mM, centrifugar la muestra de 5 min a 450 xga 4 ° C y descartar el supernatant. Repita el paso de lavado dos veces.
  3. Resuspender las muestras con 300 l DPBS 1x + 2% de FBS + EDTA 2 mM. Transferir la totalidad del volumen en un tubo de FACS a través de un filtro de células de 35 micras. Enjuague el filtro con 100 l de DPBS 1x + FBS al 2% + EDTA 2 mM.
  4. Ejecutar las células teñidas en un citómetro de flujo. Puerta viven las células individuales (DAPI -, FSC-W) para excluir las células muertas y dobletes. Parcela CD45 + CD11b + eventos para la piel (Figura 6A) y (CD45 +) CD8a - CD11b + eventos para el DLN (Figura 6B).

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Resultados

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Recientemente hemos demostrado que la inyección de agujas y jeringas de dosis inmunizantes de P. berghei esporozoitos en la piel del ratón induce una contratación sucesiva de neutrófilos polimorfonucleares seguidos por monocitos inflamatorios en la piel y DLN 19. La Sección protocolo descrito anteriormente detalla el procedimiento usado para aislar con éxito las células mieloides en vivo de ambos tejidos siguientes inyecciones múltiples de gran número de esporozoitos ...

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Discusión

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En la perspectiva de la vacunación a gran escala de los seres humanos con una vacuna entera malaria esporozoitos, uno de los principales retos a superar es el desarrollo de rutas y métodos de administración parásito optimizadas para asegurar la inmunización y protección 24,25 exitosa. En los seres humanos, la evaluación de la eficacia protectora mediada por parásitos vivos atenuados (LAP) ha llevado a cabo siguiendo natural de mosquitos muerde 2, así como intradérmica, subcutánea 25,26 y...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a Patricia Baldacci, Vanessa lagal y Sabine Thiberge para la lectura crítica, Irina Dobrescu y Sabine Thiberge en busca de ayuda en la toma de fotografías y Pauline Formaglio para la enseñanza de imágenes in vivo de la motilidad esporozoito en la piel del ratón. También nos gustaría dar las gracias a Marek Szatanik y el Centro de Producción e infección de Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) para la cría de mosquitos. Este estudio fue apoyado por el Fondo de Investigación AXA y fondos del Laboratoire d'Excellence "Biología Integrativa de Emerging Infectious Diseases" (concesión no. ANR-10-LabX-62-IBEID).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ketamina: Imalgene® 1.000Merial-50mg/kg: inyección previa de esporozoíto 125 mg/kg: sacrificio previo
Xilacina: Rompun® 2%Bayer-5mg/kg: inyección previa de esporozoíto 12,5 mg/kg: sacrificio previo
jeringa NanoFil + aguja calibre 35World Precision Instruments --
Omnican® 50 Jeringa de insulina 0.5 ml/50 I.U.B. Braun Medical Placade 6 pocillos 9151125-MultiwellTM
– Fondo planoBD Falcon 353046-70
y micro; Filtro de células M BD Halcón 352350-2
ml jeringaTerumoSS-02S-BLUE
MAXTM 15 ml Tubo cónico de polipropilenoBD Falcon 352097-BLUE
MAXTM 50 ml Tubo cónico de polipropilenoBD Falcon 352098-5
ml Tubo de poliestireno de fondo redondo con 35 µ m Tapa de filtro de celdasBD Falcon 
1x CaCl2- y MgCl2-Life Technologies14190-094-DMEM
1x + GlutaMAXTMLife Technologies31966-021-Colagenasa
de Clostridium histolyticum, Tipo IV 0,5-5,0 unidades de FALGPA/mg sólido Sigma-Aldrich C5138400 U/ml 
Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino, tipo IV Sigma-Aldrich D502550 y micro; g/ml
de sal disódica EDTASigma-Aldrich E-513410 mM o 2,5 mM
FBSBiowestS1810-500-HEPES
solución tampón (1M)Gibco15630-05625 mM
Tinción azul de tripán (0,4%)Life Technologies15250-061Dilución 1:10 
Anti-ratón CD16/CD32 (clon 2.4G2)BD Biosciences55314210 y micro; g/ml final (1:50)
DAPI FluoroPureTM gradoLife TechnologiesD214901 µ g/ml final
Anti-ratón CD45 (clon 30-F11)BD Biosciences559864  Dilución 1:200
Anti-ratón CD11b (clon M1/70)BD Biosciences557657  Dilución 1:400
Anti-ratón CD8 y alfa; (clon 5H10)Tecnologías de la VidaMCD0830  Dilución 1:100
ratones hembra C57BL/6JRj (7 semanas de edad) Laboratorios Janvier--
de cultivo de tejidos 352235-DPBS

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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