Aquí, presentamos un protocolo para utilizar mapas de destino y trazadores de linaje para dirigir inyecciones en blastómeros individuales que dan lugar al riñón de embriones de Xenopus laevis.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo
En este artículo
Resumen
Resumen
El riñón embrionario de Xenopus laevis (rana), el pronefros, consta de una sola nefrona, y se puede utilizar como un modelo para la enfermedad renal. Embriones de Xenopus son grandes, desarrollar externamente, y pueden ser manipulados fácilmente por microinyección o procedimientos quirúrgicos. Además, se han establecido mapas de destino para los primeros embriones de Xenopus. microinyección dirigida en el blastómero individuo que finalmente dará lugar a un órgano o tejido de interés se puede utilizar para sobreexpresar selectivamente o derribar a la expresión de genes dentro de esta región restringida, la disminución de los efectos secundarios en el resto del embrión en desarrollo. En este protocolo, se describe la forma de utilizar los mapas de destino de Xenopus establecidos para apuntar el riñón en desarrollo Xenopus (el pronefros), a través de microinyección en blastómeros de embriones específicos de células y 8 4-. La inyección de trazadores linaje permite la verificación de la orientación específica de la inyección.Después de embriones se han desarrollado hasta la etapa 38 - 40, todo el montaje inmunotinción se utiliza para visualizar el desarrollo pronephric, y la contribución de las células diana a las pronefros se puede evaluar. La misma técnica se puede adaptar a dirigirse a otros tipos de tejidos además de las pronefros.
Introducción
El riñón embrionario de Xenopus, el pronefros, es un buen modelo para estudiar el desarrollo del riñón y la enfermedad. Los embriones se desarrollan externamente, son de tamaño grande, se pueden producir en grandes cantidades, y son fácilmente manipulados mediante microinyección o procedimientos quirúrgicos. Además, se conservan los genes que regulan el desarrollo del riñón en mamíferos y anfibios. Riñón de los mamíferos desarrollará en tres etapas: el pronefros, mesonefros y metanefros 1, mientras que los anfibios embrionarias tienen un pronefros y anfibios adultos tienen un metanefros. La unidad de filtrado básico de estas formas de riñón es la ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El siguiente protocolo ha sido aprobado por la Universidad de Texas Health Science Center en el Centro de Houston para el Laboratorio de Medicina Animal Comité de Bienestar Animal, que sirve de Atención Institucional y el empleo Comisión (protocolo #: HSC-AWC-13-135).
1. Identificación y Selección de blastómeros para inyección de riñón de orientación
- Antes de generar embriones, utilice la Tabla normal de Xenopus Desarrollo 21 para entender la orientación de las divisiones celulares tempranos en el embrión. Como alternativa, los diagramas de acceso de las etapas tempranas del desarrollo de Xenopus en Xenbase 11.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Microinyecciones de 4 y 8 células embriones de Xenopus con MEM-RFP ARNm muestran diferentes niveles de focalización para el pronefros. La figura 4 muestra la etapa 40 embriones con los patrones de expresión de ARNm MEM-RFP correctas. Los embriones fueron inyectados en el blastómero ventral izquierdo (Figura 4A), y clasifican para el patrón de expresión adecuado de MEM-RFP mRNA. Además de expresar MEM-RFP en el proximal, intermedio, distal y la c.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Orientación de los pronefros de desarrollo de embriones de Xenopus se basa en la identificación y la inyección de la blastómeros correcta. La inyección de la V2 de blastómeros de embriones de 8 células se dirige a los pronefros izquierda 18. Esto deja el pronefros derecho contralateral como control interno. Si morfolino desmontables o ARN sobreexpresión se utiliza para modificar el desarrollo del riñón, el pronefros derecho contralateral se pueden utilizar para comparar los efectos del gen desmontabl.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención NIDDK (K01DK092320) y la financiación de inicio del Departamento de Pediatría de la Universidad de la Escuela de Medicina de Texas McGovern.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de sodio | Fisher | S271-3 | |
| Cloruro de potasio | Fisher | P217-500 | |
| Sulfato de magnesio | Fisher | M63-500 | |
| Cloruro de calcio | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Solución de gentamicina, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cisteína, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| Placa de Petri de 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Nevera II | Boekel | 260009 | Incubadora de sobremesa para embriones. |
| Plásmido | Para hacer ARN trazador. Referencia: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextrano, 10.000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Grado de biología molecular, agua purificada estéril USP | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Tubos de repuesto | Drummond Drummond | 3-000-203-G/XL | Agujas de microinyección. |
| Tirador de agujas | Sutter Instruments | P-30 | |
| Pinzas finas | Dumont | 11252-30 | Para romper la punta de la aguja de microinyección. |
| Microinyector | Nanoject II | Drummond | 3-000-204 |
| Aceite mineral, pesado | Fisher | CAS 8042-47-5 | Aceite para agujas. |
| 27 G Aguja hipodérmica monoyecto | Covidien 8881200508 | Para cargar aceite mineral en la aguja de microinyección. | |
| Jeringa Luer-Lok | BD | 309646 | Para cargar aceite mineral en la aguja de microinyección. |
| Placa de Petri de 60 mm x 15 mm | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micras Malla de poliéster | Piezas pequeñas | CMY-0800-C | |
| Pipetas de transferencia | Fisher | 13-711-7M | Para la transferencia de embriones. Corte la punta para que los embriones sean fácilmente absorbidos por la pipeta. |
| Placa de cultivo celular de 6 pocillos | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehído | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Frasco de rosca | Fisher | 03-339-25B | Para fijar, teñir y almacenar embriones. |
| Célula de 24 pocillos Placa de cultivo | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaína | Spectrum | BE130 | |
| Etanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Metanol | Fisher | A412-4 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x polvo | Fisher | BP661-50 | |
| Albúmina de suero bovino | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini balancín, modelo 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Suero de cabra, origen neozelandés | Invitrogen | 16210064 | |
| Azida sódica | Fisher | S227I-25 | |
| Anticuerpo monoclonal 3G8 | Xenopus | Anticuerpo primario para marcar proximal Túbulos. | |
| Anticuerpo monoclonal 4A6 | European Xenopus Resource Centre | Anticuerpo primario para marcar túbulos intermedios, distales y conectantes. | |
| anti-RFP pAb, IgG/conejo purificado | MBL | PM005 | Anticuerpo primario para marcar el trazador Gap43-RFP. |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG | Life Technologies | A11001 | Anticuerpo secundario para marcar túbulos renales. |
| Alexa Fluor 555 cabra anti-conejo IgG | Life Technologies | A21428 | Anticuerpo secundario para marcar el trazador Gap43-RFP. |
| Placa puntual de 9 cavidades | Corning | 7220-85 | |
| Benzoato de bencilo | Fisher | 105862500 | Opcional - para la eliminación de embriones |
| Alcohol bencílico | Fisher | A396-500 | Opcional - para la eliminación de embriones |
Referencias
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
