Este trabajo describe un protocolo de diferenciación in vitro para producir, melanocitos maduros pigmentadas a partir de células madre pluripotentes humanas a través de una cresta neural y melanoblasto etapa intermedia usando un protocolo sin alimentador de 25 días.
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Artículo de método
Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) representan una plataforma para estudiar el desarrollo humano in vitro tanto en condiciones normales como en enfermedades. Los investigadores pueden dirigir la diferenciación de las hPSC en el tipo de célula de interés mediante la manipulación de las condiciones de cultivo para recapitular las señales observadas durante el desarrollo. Uno de estos tipos de células es el melanocito, una célula productora de pigmento de origen cresta neural (NC) responsable de proteger la piel contra la radiación UV. Este protocolo presenta una extensión de un protocolo de diferenciación de cresta neural in vitro actualmente disponible de hPSCs para diferenciar aún más las NC en melanocitos completamente pigmentados. Los precursores de melanocitos se pueden enriquecer a partir del protocolo Neural Crest a través de una exposición temporizada a activadores de la señalización WNT, BMP y EDN3 en condiciones de inhibición de SMAD dual. A continuación, los precursores de melanocitos resultantes se purifican y maduran hasta convertirse en melanocitos totalmente pigmentados mediante cultivo en un medio selectivo. Los melanocitos resultantes están completamente pigmentados y se tiñen adecuadamente para las proteínas características de los melanocitos maduros.
Introducción
Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) proporcionan una plataforma para imitar diferenciación normal de una manera escalable para el modelado de la enfermedad, la detección de drogas y terapias de reemplazo celular 1-6. De particular interés, hPSCs abren nuevas vías para el estudio difícil de aislar o tipos de células raras / transitorios en los cuales las muestras de pacientes son escasos. Las células madre pluripotentes Además, inducidas (células iPS) permiten a los investigadores para estudiar el desarrollo y modelado de la enfermedad de una manera específica del paciente para desentrañar los mecanismos únicos 1,2,7-11. El protocolo ....
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Protocolo
NOTA: El protocolo de melanocitos esbozado aquí se demostró por primera vez por Mica et al.
1. Preparación del medio de cultivo, recubierto Platos y Mantenimiento de hPSCs
- Preparación medio
Nota: tienda de todo medio a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2 semanas. Filtrar todo el medio para la esterilización.- Preparar DMEM / 10% de FBS. Mezclar 885 ml de DMEM, FBS 100 ml, 10 ml de penicilina / estreptomicina y 5 ml de L-Glutamina. Filtro para la esterilización.
- Preparar células madre mediano. Mezclar 800 ml de DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml de L-Glutamina, 10 ml de solución de aminoácidos esencia....
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Resultados
Este protocolo proporciona un método para derivar, melanocitos maduros completamente pigmentadas de hPSCs en una manera libre de alimentador, costo eficiente y reproducible in vitro. En contraste con los Fang protocolo previamente establecido et al. Para melanocitos derivados de HPSC, el protocolo descrito no requiere medio acondicionado y reduce el requisito de tiempo. El protocolo de Fang et al. Utilizada medio condicionado de una línea celular murina Wnt3a p.......
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Discusión
Para la diferenciación de los melanocitos éxito de hPSCs las siguientes sugerencias deben ser tomados en consideración. Primero y ante todo, es esencial para trabajar en condiciones de cultivo estériles en todo momento. Además, es importante comenzar con pluripotentes, hPSCs totalmente indiferenciadas; si la población de partida contiene células diferenciadas el rendimiento invariablemente dejar que los contaminantes no pueden ser dirigidas hacia los melanocitos e incluso pueden perturbar aún más las células adecuadamen.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses en conflicto para revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación para los investigadores del melanoma de la Fundación Joanna M. Nicolay y por los Institutos Nacionales de Salud en virtud F31 Ruth L. Kirschstein Premio al Servicio Nacional de Investigación. Este trabajo fue apoyado además por subvenciones del NYSTEM y la iniciativa de células madre Tri-institucional (Fundación Starr).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo transferencia humana | Sigma | T1147 | |
| Ácido ascórbico (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Suplemento) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoetanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R& D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R& D Systems | 4423 | 6 mM |
| Toxina del cólera | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| AMPc (AMP cíclico) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexametasona | Sigma | D2915-100MG | 50 μ M |
| DMEM - Medio de águila modificada de Dulbecco | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Medio de águila modificada de Dulbecco: Mezcla de nutrientes F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 polvo | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endotelina-3, humano) | Compañía Americana de Péptidos | 88-5-10B | 100 μ M |
| Fibronectina | BD Biosciences | 356008 | 200 μ g/ml |
| de gelatina (PBS sin Mg/Ca) | en casa | 0,1% en PBS | |
| Glucosa | Sigma | G7021 | |
| Insulina humana | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Premezcla de suplemento de cultivo universal | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamina | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| DMEM | Invitrogen de baja glucosa | 11885-084 | |
| Matriz Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Disolver 1:20 en DMEM/F12 |
| MCDB201 | Medio Sigma | M6770 | |
| MEM solución mínima de aminoácidos esenciales | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Fibroblastos embrionarios de ratón (7 millones de células/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Laminina-I de ratón | R& D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Medio neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10.000 U/ml |
| Poly-L Omithin hidrobromuro | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterona | Sigma | P8783 | 0,032 g en 100 ml 100% etanol |
| Cimlorhidrato de putrescina | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (FGF humano recombinante básico) | R& D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenita | Sigma | S5261 | |
| Bicarbonato de Sodio | Sigma | S5761 | |
| SCF (Factor de Células Madre, Recombinante Humano) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 y mu; g/ml |
| TYRP1 (G-17) Anticuerpo | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| Anticuerpo TYRP2 | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 diclorhidrato | Tocris-R& D Sistemas | 1254 | 10 mM |
Referencias
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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