Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes

9.9K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/53806

⸱

3 de marzo de 2016

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

En este artículo

Resumen

Este trabajo describe un protocolo de diferenciación in vitro para producir, melanocitos maduros pigmentadas a partir de células madre pluripotentes humanas a través de una cresta neural y melanoblasto etapa intermedia usando un protocolo sin alimentador de 25 días.

Resumen

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) representan una plataforma para estudiar el desarrollo humano in vitro tanto en condiciones normales como en enfermedades. Los investigadores pueden dirigir la diferenciación de las hPSC en el tipo de célula de interés mediante la manipulación de las condiciones de cultivo para recapitular las señales observadas durante el desarrollo. Uno de estos tipos de células es el melanocito, una célula productora de pigmento de origen cresta neural (NC) responsable de proteger la piel contra la radiación UV. Este protocolo presenta una extensión de un protocolo de diferenciación de cresta neural in vitro actualmente disponible de hPSCs para diferenciar aún más las NC en melanocitos completamente pigmentados. Los precursores de melanocitos se pueden enriquecer a partir del protocolo Neural Crest a través de una exposición temporizada a activadores de la señalización WNT, BMP y EDN3 en condiciones de inhibición de SMAD dual. A continuación, los precursores de melanocitos resultantes se purifican y maduran hasta convertirse en melanocitos totalmente pigmentados mediante cultivo en un medio selectivo. Los melanocitos resultantes están completamente pigmentados y se tiñen adecuadamente para las proteínas características de los melanocitos maduros.

Introducción

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) proporcionan una plataforma para imitar diferenciación normal de una manera escalable para el modelado de la enfermedad, la detección de drogas y terapias de reemplazo celular 1-6. De particular interés, hPSCs abren nuevas vías para el estudio difícil de aislar o tipos de células raras / transitorios en los cuales las muestras de pacientes son escasos. Las células madre pluripotentes Además, inducidas (células iPS) permiten a los investigadores para estudiar el desarrollo y modelado de la enfermedad de una manera específica del paciente para desentrañar los mecanismos únicos 1,2,7-11. El protocolo previamente publicado para la diferenciación de melanocitos de hPSCs requiere hasta 6 semanas de diferenciaciones e implica el cultivo de células con medio condicionado de células L-Wnt3a 12. El protocolo presentado primero por Mica et al. Y descrito aquí produce células pigmentadas en tres semanas y elimina la ambigüedad e inconsistencias asociadas con medio condicionado.

ar melanocitose derivado de la cresta neural, una población migratorio de las células únicas de los vertebrados. La cresta neural se define durante la gastrulación y representa una población de células en el borde de la placa neural, en la frontera entre el neural y ectodermo no neural. Durante tubo neural, el tejido nervioso se desarrolla a partir de una placa neural para formar pliegues neurales, que convergen en la línea media dorsal, dando como resultado el 13,14 tubo neural.

Las células de la cresta neural emergen de la placa de techo del tubo neural, frente a la notocorda, y se someten a una transición epitelial a mesenquimal antes de migrar de distancia para dar lugar a una población diversa de células diferenciadas. El destino de las células de la cresta se definen en parte por la localización anatómica de la placa de techo a lo largo del eje del cuerpo del embrión. derivados de células de la cresta neural incluyen linajes característicos tanto de mesodermo (células de músculo liso, osteoblastos, adipocitos, condrocitos) y las células del ectodermo (melanocitos, Schwann cells, neuronas) 14. las células madre de la cresta neural upregulate el factor de transcripción SOX10 y se pueden aislar por fluorescencia de células activadas por la clasificación con anticuerpos frente a p75 y HNK1.

Las células de la cresta neural predestinadas a convertirse en melanocitos pasan por una etapa melanoblasto y regular al alza KIT y MITF (factor de transcripción asociado con microftalmia) 6,21 MITF es un regulador maestro de desarrollo de melanocitos y es un factor de transcripción responsable de controlar gran parte del desarrollo de melanocitos 22- 24. melanoblastos humanos migran a la capa basal de la epidermis donde residen ya sea en el bulto de pelo o rodeado por los queratinocitos en la epidermis (unidades formadoras de pigmentación) para servir como precursores de los melanocitos maduros, pigmentadas. La diferenciación y la maduración de melanoblastos en melanocitos pigmentados se produce concomitante con la colonización del bulbo piloso y la expresión de la vía de la producción de melanina (TYRP1, TYR, OCA2 yPMEL) 25,26.

El aislamiento de melanocitos humanos y melanoblastos de pacientes es caro, difícil y limitando en cantidad. Este protocolo permite a los investigadores para diferenciar hPSCs (inducido o embrionaria) en los melanocitos o precursores de melanocitos en un método bien definido, rápido, reproducible, escalable y de bajo costo y sin la clasificación de células. El protocolo fue utilizado anteriormente para identificar defectos específicos de la enfermedad, cuando la diferenciación de células iPS de pacientes con trastornos de la pigmentación.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

NOTA: El protocolo de melanocitos esbozado aquí se demostró por primera vez por Mica et al.

1. Preparación del medio de cultivo, recubierto Platos y Mantenimiento de hPSCs

  1. Preparación medio
    Nota: tienda de todo medio a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2 semanas. Filtrar todo el medio para la esterilización.
    1. Preparar DMEM / 10% de FBS. Mezclar 885 ml de DMEM, FBS 100 ml, 10 ml de penicilina / estreptomicina y 5 ml de L-Glutamina. Filtro para la esterilización.
    2. Preparar células madre mediano. Mezclar 800 ml de DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml de L-Glutamina, 10 ml de solución de aminoácidos esencial mínimo MEM, 1 ml de ß-mercaptoetanol, y 5 ml Pen / Strep. Después de filtrar añadir 10 ng / ml de FGF-2.
    3. Preparar medio KSR-diferenciación: Mezclar 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamina, 10 ml Pen / Strep, 10 ml mínimo solución MEM aminoácidos esenciales y 1 ml β-mercaptoetanol. Filtro para la esterilización.
    4. Preparar medio N2-diferenciación. Disolver 12 g de DMEM / F12 i en polvon 980 ml ​​dH2O Añadir 1,55 g de glucosa, 2 g de bicarbonato de sodio y 100 mg apo transferrina humana. Mezclar 2 ml dH2O con la insulina humana de 25 mg y 40 l de NaOH 1 N; Una vez disuelto, añadir la mezcla al medio. Añadir 100 l de dihidrocloruro de putrescina, selenito de 60 l, 100 l de progesterona. Llevar el volumen final a 1 l con dH 2 O antes de filtrar.
    5. Para preparar el medio de melanocitos completa. Combinar 50% de medio Neurobasal, 30% de DMEM bajo de glucosa, y 20% MCDB201. Para este complemento: 0,8% ITS +, 250 nM de L-glutamina, 100 mM de ácido ascórbico (L-AA), 50 ng / ml toxina del cólera, 50 ng / ml SCF, 0,05 M de dexametasona, 100 nM EDN3, 4 ng / FGF2 ml . Filtro estéril a continuación, añadir los reactivos restantes: 2% del suplemento B27, 25 ng / ml BMP4, CHIR99021 3 M, 500 M de cAMP.
  2. El recubrimiento de placas de cultivo
    1. Llevar a cabo el recubrimiento utilizando proteína gelatinosa, como Matrigel. Tras la apertura, alicuotar y congelar Matrigel en 1 ml de partes para evitar la congelación descongelación c repetitivoycles. Descongelar y volver a suspender una alícuota de 1 ml congelado con 19 ml de DMEM / F12. Plate 5 ml en una placa de 10 cm. Incubar los platos durante 1 hora a RT. Aspirar la proteína gelatinosa inmediatamente antes en placas de las células y se lavan con DMEM / F12.
    2. Llevar a cabo mediante recubrimiento de poli-L ornitina bromhidrato / ratón laminina-I / fibronectina (PO / Lam / FN). Escudo plato con PBS que contiene 15 mg / ml de poli-L ornitina bromhidrato. Incubar O / N a 37 ° C en una incubadora humidificada. Aspirar la solución y lavar las placas tres veces con PBS antes del revestimiento con PBS que contenía 1 mg / ml de ratón laminina-I y 2 mg / ml de fibronectina. Incubar los platos O / N a 37 ° C en una incubadora humidificada.
      1. Antes de placas células, aspirar la solución y dejar que las placas se sequen completamente y sin la tapa en la campana de cultivo de tejido. Dejar que las placas se sequen durante aproximadamente 10-15 minutos.
        Nota: Los platos son secas y listas para la siembra de células cuando las estructuras de cristal aparecen en la superficie de los ojos. el platES pueden mantenerse con PBS que contenía LAM / FN en la incubadora durante dos semanas, siempre que el líquido no se evapora. Las placas se pueden mantener seca a temperatura ambiente durante unos pocos hr.
  3. Mantenimiento de hPSCs
    Nota: hPSCs se mantienen en el 0,1% de gelatina y fibroblastos embrionarios de ratón mitóticamente inactivadas (MEF) en células madre mediano. Las células se debe dividir cada 6-8 días.
    1. Escudo un plato de 10 cm con 0,1% de gelatina en PBS a temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Descongelar MEFs congelados rápidamente en un baño de agua a 37 ° C.
    3. Aspirar la gelatina y la placa de las células. MEFs placa a una densidad de ~ 50.000 células / cm 2 en DMEM / 10% de FBS. Incubar a 37 ° MEFs CO / N antes de añadir hPSCs.
    4. Aspirar el% de FBS DMEM / 10 de la placa preparada MEF, lavar la placa con PBS y añadir 10 ml de células madre-medio con hPSCs. Passage los hPSCs en una proporción de 1: 5/10 dependiendo de la densidad antes de pases.
      Nota: Si los hPSCs se descongelan o se pasaron como células individuales, supcomplemento con 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 (Rocki) hasta que el primero paso.
    5. Alimentar a las células frescas diariamente con 10 ml de células madre a mediano.
    6. Antes de iniciar una diferenciación eliminar cualquier colonias pluripotentes que parecen contener células diferenciadas, bordes irregulares, o centros transparentes 28. Mecánicamente desalojar y aspirar las colonias irregulares con una pipeta bajo una campana de flujo laminar con un microscopio de disección.

2. Chapado de hPSCs en el diferencial

Nota: Se describen las condiciones de diferenciación para platos de 10 cm.

  1. Preparar 10 cm platos Matrigel antes de iniciar la diferenciación como se describe en el paso 1.3.1.
  2. Cuando chapado hPSCs para una diferenciación comienzan con un plato de hPSCs a una densidad listo para el paso (~ 80% de confluencia) aspirar el hESC-medio, lavar con PBS y añadir 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a las células.
  3. Agitar enérgicamente el plato horizontally durante 2 minutos mientras se visualiza bajo el microscopio hasta los MEFs levante fuera como células individuales. Las colonias HPSC deben permanecer unidos como colonias.
  4. Aspirar el tripsina después de los MEFs han levantado, pero antes de que las colonias hPSCs desprenden.
  5. Añadir 10 ml de células madre-medio que contiene 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 de la placa y separar las células pipeteando arriba y hacia abajo sobre las colonias.
  6. Aspirar la solución de Matrigel de la placa de 10 cm preparada en el paso 2.1 y lavar con DMEM / F12 para eliminar los grumos. La placa de las hPSCs en una proporción de 1: 2 en la placa de Matrigel. Añadir hCME-medio que contiene 10 mM de Y-27632 dihidrocloruro hasta 10 ml. Se incuba a 37 ° CO / N.
    Nota: Este recubrimiento debe dar lugar a aproximadamente 100.000 células / cm 2.

3. Inducción de la diferenciación neuronal

Nota: La diferenciación se debe iniciar (día 0), cuando los hPSCs son 80% de confluencia. Las células pueden ser alimentados diariamente con células madre de medianoque contiene 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 hasta el inicio de la diferenciación.

  1. En el día 0 y día 1, se alimentan las células con 10 ml de medio KSR-diferenciación que contiene 100 nM LDN193189 y 10 M SB431542.
  2. En el día 2, se alimentan las células con 10 ml de medio KSR-diferenciación que contiene 100 nM LDN193189, 10 M SB431542 y 3 CHIR99021 M.
  3. En el día 3, se alimentan las células con 10 ml de medio KSR-diferenciación que contiene 10 mM SB431542 y 3 CHIR99021 M.
  4. En los días 4 y 5 de alimentación de las células con 15 ml de medio de diferenciación KSR-75% y 25% de medio N2-diferenciación que contiene 3 CHIR99021 M.
    Nota: No se alarme al ver una gran cantidad de muerte celular en términos de células flotantes. Esto es normal y de esperarse.
  5. En los días 6 y 7 de alimentación de las células con 15 ml de medio de diferenciación KSR-50% y 50% de medio N2-diferenciación tanto que contiene 3 M CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, y 100 nM EDN3.
  6. En día 8y 9 de alimentación de las células con 20 ml de medio de diferenciación KSR-25% y 75% de medio N2-diferenciación tanto que contiene 3 M CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, y 100 nM EDN3.
  7. En los días 9 y 10 de preparar platos PO / Lam / FN como se indica en 1.2.2 para la re-recubrimiento de las células en el día 11.
  8. En el día 10 las células de alimentación con 20 ml de medio N2-diferenciación que contiene 3 M CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, y 100 nM EDN3.

4. resiembra en las gotas para la especificación NC

  1. En el día 11 Lam aspirado / FN de las placas preparadas LAM / PO / FN y seque completamente.
  2. Retire medio de las 11 celdas de día, lavar con PBS y añadir solución de desprendimiento de las células 4 ml como Accutase por placa de 10 cm. Incubar durante 25 minutos a 37 ° C.
  3. Añadir 5 ml de medio completo de melanocitos al plato y volver a suspender las células pipeteando manualmente arriba y abajo con una pipeta de 10 ml hasta que todas las células se han levantado de la placa. Transferir la suspensión a un tubo de 15 ml.
  4. girar lalas células durante 5 min a 200 xg y resuspender las células en 2 x 10 6 células por ml en medio completo de melanocitos. Contar las células por medio de la exclusión de azul de tripano en un hemocitómetro o una técnica equivalente.
  5. gotitas placa 10 l cerca uno del otro (sin ellos tocar) sobre la vajilla cm PO / Lam / FN 10 secas. Si la placa ha sido suficientemente seca, las gotas deben haber definido bien los bordes y no correr.
    Nota: Esto crea un entorno local de alta densidad para las células, que es importante cuando se resiembra de las células, mientras que el mantenimiento de la habitación dentro del plato para la expansión.
  6. Dejar que las gotas permanezcan a temperatura ambiente durante 10-20 minutos para permitir que las células se adhieran, luego poco a poco (no molestar a las células unidas) añadir 10 ml de medio completo de melanocitos. Mueva plato a la incubadora.

5. La ampliación de melanocitos Progenitores

  1. Seguir alimentando con medio de melanocitos completo cada 2 a 3 días.
    Nota: La pigmentación debería empezar a ser visible wentro de grupos de células por el final de la primera semana y llegar a ser muy claro por la segunda semana. Ver el plato sobre un fondo blanco, como una hoja de papel de discernir estos primeros grupos pequeños, oscuros. Las células se vuelven progresivamente más pigmentadas con el tiempo, hasta que la placa entera es uniformemente pigmentada (Ver Figura 2B).
  2. células de paso una vez a la semana en una proporción de aproximadamente 1: 6 (chapado en forma de gotas ya no es necesario en esta etapa). Utilice Accutase para disociar las células y lavar dos veces con medio Neurobasal normal antes de volver a cultivos en un medio completo de melanocitos. Mantener las células en placas de LAM / PO / FN.
    Nota: Hemos encontrado que el medio completo de melanocitos es el más adecuado para mantener y expandir células madre y los melanocitos derivados de IPSC. Sin embargo, las células pueden ser brevemente cultivadas en medio M254 disponible en el mercado, pero los medios de comunicación simplificada aumenta el riesgo de las células que mueren y que quitan la placa.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Este protocolo proporciona un método para derivar, melanocitos maduros completamente pigmentadas de hPSCs en una manera libre de alimentador, costo eficiente y reproducible in vitro. En contraste con los Fang protocolo previamente establecido et al. Para melanocitos derivados de HPSC, el protocolo descrito no requiere medio acondicionado y reduce el requisito de tiempo. El protocolo de Fang et al. Utilizada medio condicionado de una línea celular murina Wnt3a p...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Para la diferenciación de los melanocitos éxito de hPSCs las siguientes sugerencias deben ser tomados en consideración. Primero y ante todo, es esencial para trabajar en condiciones de cultivo estériles en todo momento. Además, es importante comenzar con pluripotentes, hPSCs totalmente indiferenciadas; si la población de partida contiene células diferenciadas el rendimiento invariablemente dejar que los contaminantes no pueden ser dirigidas hacia los melanocitos e incluso pueden perturbar aún más las células adecuadamen...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses en conflicto para revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación para los investigadores del melanoma de la Fundación Joanna M. Nicolay y por los Institutos Nacionales de Salud en virtud F31 Ruth L. Kirschstein Premio al Servicio Nacional de Investigación. Este trabajo fue apoyado además por subvenciones del NYSTEM y la iniciativa de células madre Tri-institucional (Fundación Starr).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
apo transferencia humanaSigmaT1147
Ácido ascórbico (L-AA)SigmaA4034100 mM
B27 (B27 Suplemento)Invitrogen17504044
β-MercaptoetanolGibco-Life Technologies21985-02310 mg/ml
BMP4R& D Systems314-bp
CHIR99021Tocris-R& D Systems44236 mM
Toxina del cóleraSigmaC805250 mg/ml
AMPc (AMP cíclico)SigmaD0627100 mM
DexametasonaSigmaD2915-100MG50 μ M
DMEM - Medio de águila modificada de DulbeccoGibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - Medio de águila modificada de Dulbecco: Mezcla de nutrientes F-12Gibco-Life Technologies1133--032
DMEM/F12 polvoInvitrogen12500-096
EDN3 (Endotelina-3, humano)Compañía Americana de Péptidos88-5-10B100 μ M
FibronectinaBD Biosciences356008200 μ g/ml
de gelatina (PBS sin Mg/Ca)en casa0,1% en PBS
GlucosaSigmaG7021
Insulina humanaSigmaI2643
ITS+ Premezcla de suplemento de cultivo universal BD Biosciences354352
KSR (Knockout Serum Replacement)Gibco-Life Technologies10828-028
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-GlutaminaGibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 mM
DMEMInvitrogen de baja glucosa11885-084
Matriz MatrigelBD Biosciences354234Disolver 1:20 en DMEM/F12
MCDB201Medio SigmaM6770
MEM solución mínima de aminoácidos esencialesGibco-Life Technologies11140-080
Fibroblastos embrionarios de ratón (7 millones de células/vial)GlobalStemGSC-8105M
Laminina-I de ratónR& D Systems3400-010-011 mg/ml
Medio neurobasalInvitrogen21103049
Penicilina/EstreptomicinaGibco-Life Technologies15140-12210.000 U/ml
Poly-L Omithin hidrobromuroSigmaP365515 mg/ml 
ProgesteronaSigmaP87830,032 g en 100 ml 100% etanol
Cimlorhidrato de putrescinaSigmaP5780
FGF2 (FGF humano recombinante básico)R& D Systems233-FB-001MG/CF10 mg/ml
SB431542Tocris-R& D Systems181410 mM
SelenitaSigmaS5261
Bicarbonato de SodioSigmaS5761
SCF (Factor de Células Madre, Recombinante Humano) Peprotech Inc.300-0750 y mu; g/ml
TYRP1 (G-17) AnticuerpoSanta Cruz104431:200
Anticuerpo TYRP2Abcam740731:200
Tripsina-EDTA (0,05%)Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 diclorhidratoTocris-R& D Sistemas125410 mM

Referencias

  1. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  3. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
  4. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
  5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
  6. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
  7. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  8. Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
  9. Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  10. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
  11. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  12. Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
  13. Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
  14. White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
  15. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  16. Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
  17. Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
  18. Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
  19. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
  20. Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
  21. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
  22. Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
  23. Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
  24. Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064(2011).
  25. Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
  26. Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
  27. Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
  28. Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
  29. Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Diferenciación de melanocitosdiferenciación de la cresta neuralseñalización WNT BMP EDN3inhibición dual de SMADcultivo en medio selectivoenriquecimiento de precursores de melanocitosmelanocitos totalmente pigmentadossolución de desprendimiento celularrecubrimiento de laminina y fibronectina PO
Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.