Esta publicación demuestra métodos para el muestreo y cultivo exitosos de mucosa epitelial nasal de niños, y la reprogramación de estas células a Células Madre Pluripotentes (iPSCs) inducidas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Cultivar las células primarias epiteliales nasales de niños y reprogramar en células madre pluripotentes inducidas
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células epiteliales nasales (NEC) son la parte de las vías respiratorias que responden a los contaminantes del aire y son las primeras células infectadas con virus respiratorios. También están implicados en muchas enfermedades de las vías respiratorias a través de su respuesta inmunitaria innata y su interacción con las células inmunitarias y del estroma de las vías respiratorias. Las ECN son de particular interés para los estudios en niños debido a su accesibilidad durante las visitas clínicas. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) se han generado a partir de múltiples tipos de células y son una poderosa herramienta para modelar el desarrollo humano y las enfermedades, así como para sus posibles aplicaciones en medicina regenerativa. Este es el primer protocolo que establece métodos para la generación exitosa de iPSC a partir de NEC derivadas de participantes pediátricos con fines de investigación. Describe cómo obtener células epiteliales nasales de niños, cómo generar cultivos primarios de NEC a partir de estas muestras y cómo reprogramar NEC primarias en iPSC bien caracterizadas. Las muestras de mucosa nasal son útiles en estudios epidemiológicos relacionados con los efectos de la contaminación del aire en los niños y proporcionan una herramienta importante para el estudio de las enfermedades de las vías respiratorias. Las células nasales primarias y las iPSC derivadas de ellas pueden ser una herramienta para proporcionar material ilimitado para la investigación específica del paciente en diversas áreas de la biología epitelial de las vías respiratorias, incluida la investigación sobre el asma y la EPOC.
Introducción
Células madre pluripotentes inducidas a partir de muestras humanas (hiPSCs) son una tecnología en rápido desarrollo de la investigación de células madre. Ellos ofrecen una alternativa a la investigación con células madre embrionarias (células madre) con muchos menos inconvenientes éticos y morales 1,2. Aunque no son idénticos a epigenetically CMEh 3-5, hiPSCs ofrecen una forma única para modelar desarrollo y la enfermedad fenotipos, y que se pueden derivar de tejidos relevantes para el estado de la enfermedad 5-8. Se están explorando constantemente nuevos métodos de generación de hiPSCs para identificar tipos de células óptimas para e....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El siguiente protocolo sigue las directrices del comité de ética de la investigación humana instituciones.
1. El muestreo de la mucosa nasal
NOTA: Obtener muestras de sujetos que no presentan signos de infección viral respiratoria.
- Preparar una fresca 15 ml cónica antes de la visita de los participantes y añadir 2 ml BEGM (epitelial bronquial medio de crecimiento celular), además de 20 l estéril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
- cepillo de citología abierta justo antes de tomar la muestra, y asegúrese de mantener el cepillo estéril y no lo toque a cualquier superficie además de....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La parte inicial de la nariz, llamado el vestíbulo nasal, es el área rodeada por el cartílago 29. El cepillo tiene que ir sin problemas más allá de esta zona de la nariz, más allá de la válvula nasal (Internum ostium, o el "agujero negro" que se ve en la parte posterior del orificio nasal), y la muestra se obtiene a partir del cornete inferior (Figura 1). Los cornetes nasales son estructuras óseas que aumentan el área de superficie de la nariz 2.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Células epiteliales nasales (CNE) son una plataforma accesible para el estudio de la enfermedad de las vías respiratorias, y NEC-iPSCs ofrecen una buena posibilidad para explorar el desarrollo de la enfermedad, el tratamiento y la terapia 1,31,32. CNE se puede obtener fácilmente sin procedimientos nocivos potencialmente estresantes o 6,23. En nuestra experiencia, la toma de muestras de la mucosa nasal como se describe en este protocolo parece ser menos estresante y sentir mejor, que la extracción d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer la Facilidad de células madre pluripotentes y la Imagen confocal Core en el Hospital de Niños de Cincinnati. Este trabajo fue apoyado por R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) y 2U19AI70235 (GKKH).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 15 ml cónica | Fisher Scientific | 14-959-49D | Protocolo Paso 1.1. |
| Protocolo BEGM | Lonza CC-3170 | Paso 1.1. | |
| Penn/Estreptococos/Fungicidas | Life Technologies | 15240-062 | Paso 1.1 del protocolo. |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Protocolo Paso 4.a. |
| Cepillo de citología cytosoft | Fisher Scientific | 22-263-357 | Protocolo Paso 1.2. |
| Protocolo | Fisher Scientific | MT-25-900-CI | Paso 2.1. |
| hemacitómetro | Fisher Scientific | 02-671-54 | Protocolo Paso 2.1. |
| PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | Protocolo Paso 2.2. |
| Clips de embudo de citología | Protocolo Fisher Scientific | 10-357 | Paso 2.2. |
| embudo cytospin | Fisher Scientific | 23-640-320 | Protocolo Paso 2.2. |
| Cytospin 4 | Protocolo de | A78300003 | Fisher Scientific Paso 2.2. |
| diapositiva en blanco | Fisher Scientific | S95933 | Protocolo Paso 2.2. |
| Kit de tinción HEMA 3 | Fisher Scientific | 22-122-911 | Protocolo Paso 2.2. |
| Cológeno dérmico bovino, tipo 1 | Life Technologies | A1064401 | Protocolo Paso 3.2. |
| Matraz T25 | Fisher Scientific | 08-772-45 | Protocolo Paso 3.3. |
| Protocolo de tripsina | Lonza | CC-5012 | Paso 5.2. |
| Solución neutralizante de tripsina | Lonza | CC-5002 | Protocolo Paso 5.2. |
| Suero fetal bovino (FBS), esterilizado por calor a 65 &° C para 30 min | Sigma-Aldrich | F2442 | Protocolo Paso 5.5. |
| Dimetilsulfóxido Hybri-Max™, filtrado estéril, BioReactivo, apto para hibridomas, ≥ 99.7% | Protocolo Sigma-Aldrich | D2650 | Paso 5.5. |
| lentivirus policisónico*< | em>p. ej. Millipore | SCR511 | Protocol Paso 6.4. Se enumera una fuente comercial de vector de reprogramación. Utilizamos de forma rutinaria el plásmido 4 en 1 reportado por Voelkel et al (PMID: 20385817) para generar internamente lentivirus de reprogramación policistrónico pseudotipado por VSV-G. Este plásmido se puede obtener contactando con |
| polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | Protocolo Paso 6.4. |
| MEFs CF1 irradiados | GlobalStem | Protocolo GSC-6301G | Paso 6.4. |
| Medios hESC | Consulte la receta incluida en el protocolo | Paso 6.11 del protocolo. | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | Paso 6.11 del protocolo. |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Paso 6.11 del protocolo. |
| Tiazovivina | Stemgent | 04-0017 | Paso 6.11 del protocolo. |
| Protocolo de 354277 Matrigel | BD Biosciences | hESC Paso 6.13. | |
| Placa Corning, 6 pocillos | Fisher Scientific | 08-772-1B | Protocolo Paso 6.13. |
| Protocolo mTeSR1 | StemCell | 5850 | Paso 6.13. |
| Matraz filtrante desechable de 250 ml (0,22 y micro; m) | Fisher | SCGP-U02-RE | |
| dispasa | StemCell | 7923 | Protocolo Paso 7.3. |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-033 | Paso 7.3 del protocolo. |
| elevador de células | Fisher Scientific | 08-100-240 | Protocolo Paso 7.4. |
| hESC Media** | deben mezclarse y luego esterilizarse con filtro. Los medios se pueden mantener a 4 & grados; C durante un máximo de dos semanas. Cuando caliente el medio, no lo deje a 37 °C; C más de 15 min | ||
| DMEM-F12 50/50 medios | Invitrogen | 11330-032 | Concentración final Suero |
| de reemplazo KO (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0.2 |
| 200 mM L-glutamina | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoetanol | Invitrogen | 21985-023 | 0.1 mM |
| 100x aminoácidos no esenciales | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 µ g/ml Factor de crecimiento básico de fibroblastos (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 ng/ml |
Referencias
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
