Artículo de método

Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos En Vivo registros intracelulares

DOI:

10.3791/53829

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26 de febrero de 2016

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1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2School of Life Sciences, University of Sussex

En este artículo

Resumen

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La técnica electrofisiológica de registro intracelular se demuestra y se utiliza para determinar las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales en el ojo compuesto de una mariposa.

Resumen

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registro intracelular es una técnica poderosa utilizada para determinar cómo una sola célula puede responder a un estímulo dado. En la investigación de la visión, el registro intracelular ha sido históricamente una técnica común utilizada para estudiar la sensibilidad de las células fotorreceptoras individuales a diferentes estímulos luminosos que se sigue utilizando hoy en día. Sin embargo, sigue habiendo una escasez de metodología detallada en la literatura para los investigadores que desean replicar experimentos registro intracelular en el ojo. Aquí se presentan los insectos como modelo para examinar la fisiología del ojo de manera más general. células fotorreceptoras de insectos se encuentran cerca de la superficie del ojo y por lo tanto son fáciles de alcanzar, y muchos de los mecanismos implicados en la visión se conservan a través de filos animal. Se describe el procedimiento básico para la grabación intracelular in vivo de las células fotorreceptoras en el ojo de una mariposa, con el objetivo de hacer que esta técnica sea más accesible a los investigadores con poca experiencia previa en el correolectrophysiology. Introducimos el equipo básico necesario, cómo preparar una mariposa en vivo para la grabación, la forma de insertar un microelectrodo de vidrio en una sola celda, y, finalmente, el procedimiento de grabación en sí. También se explica el análisis básico de datos de respuesta primas para la determinación de la sensibilidad espectral de distintos tipos de células. Aunque nuestro protocolo se centra en la determinación de la sensibilidad espectral, otros estímulos (por ejemplo, luz polarizada) y variaciones del método son aplicables a esta configuración.

Introducción

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Las propiedades eléctricas de las células tales como neuronas se observan mediante la medición de flujo de iones a través de las membranas celulares como un cambio en el voltaje o la corriente. Una variedad de técnicas electrofisiológicas han sido desarrollados para medir eventos bioeléctricos en las células. Las neuronas que se encuentran en los ojos de animales son accesibles y sus circuitos a menudo es menos compleja que en el cerebro, por lo que estas células buenos candidatos para el estudio electrofisiológico. Las aplicaciones más comunes de electrofisiología en el ojo incluyen el electrorretinograma (ERG) 1,2 y el registro intracelular de microelectrodos. ERG consiste en colocar un electrodo en o sobre el ojo de un animal, la aplicación de un estímulo de luz, y midiendo el cambio en la tensión como una suma de las respuestas de todas las células cercanas 3-6. Si uno está interesado específicamente en la caracterización de las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales, a menudo múltiples tipos de células responden de forma simultánea en diferentes puntos fuertes a un estímulo determinado; Por lo tanto,puede ser difícil de determinar las sensibilidades de los tipos celulares específicos a partir de datos ERG especialmente si hay varios tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente similares en el ojo. Una posible solución es crear transgénico con el gen de Drosophila fotorreceptor (opsina) de interés se expresa en las células mayoría R1-6 en el ojo y después realizar ERGs 7. Las posibles desventajas de este método son que no a baja expresión de la proteína fotorreceptor 8, y el período de tiempo largo para la generación y detección de animales transgénicos. Para los ojos con un menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintas, la adaptación del ojo con filtros de color puede ayudar con la reducción de la contribución de algunos tipos de células a la ERG, permitiendo de ese modo la estimación de máximos sensibilidad espectral 9.

registro intracelular es otra técnica en la que una multa electrodo empala una célula y se aplica un estímulo. Los registros de electrodos sólo eso IndivLa respuesta de las células idual de manera que a grabar y analizar varias celdas individuales puede producir sensibilidades específicas de los diferentes tipos de células fisiológicamente 10-14. Aunque nuestro protocolo se centra en el análisis de sensibilidad espectral, los principios básicos de intracelular de grabación con electrodos afilados son modificables para otras aplicaciones. El uso de una preparación diferente de una muestra, por ejemplo, y el uso de electrodos de cuarzo afilados, se puede grabar de más profundo en el lóbulo óptico o de otras regiones en el cerebro, dependiendo de la pregunta que se hace. Por ejemplo, los tiempos de respuesta de las células fotorreceptoras individuales 15, la actividad de células en la óptica lóbulos 16 (lámina, médula o lobula 17), cerebro 18 o otros ganglios 19 también se pueden grabar con técnicas similares, o estímulos de color podría sustituirse con polarización 20 -22 o moción estímulos 23,24.

Fototransducción, el proceso por el cual la luzla energía es absorbida y convertida en una señal electroquímica, es un antiguo rasgo común a casi todos los presentes el día 25 filos animales. El pigmento visual que se encuentra en las células fotorreceptoras y responsable de iniciar la fototransducción visual es la rodopsina. Rhodopsins en todos los animales se componen de una proteína opsina, un miembro de la familia 7 transmembrana G receptor acoplado a la proteína, y un cromóforo asociado que se deriva de la retina o una molécula similar 26,27. Opsin secuencia de aminoácidos y la estructura de cromóforo afectar la absorbancia de la rodopsina a diferentes longitudes de onda de luz. Cuando un fotón es absorbida por el cromóforo de la rodopsina se activa, iniciando una cascada de proteína G en la célula que en última instancia conduce a la apertura de los canales iónicos de membrana 28. A diferencia de la mayoría de las neuronas, las células fotorreceptoras se someten a posibles cambios graduales que se pueden medir como un cambio relativo en la amplitud de la respuesta con el cambio de estímulo luminoso. Normalmente, un dadotipo de fotorreceptor expresa sólo un gen de la opsina (aunque existen excepciones 8,10,29-31). la visión del color sofisticado, de la que se encuentra en muchos vertebrados y artrópodos, se consigue con un ojo complejo de cientos o miles de células fotorreceptoras cada que expresan uno o más tipos de vez en cuando rodopsina. La información visual se captura mediante la comparación de las respuestas sobre el mosaico fotorreceptor través de la señalización neural aguas abajo complejo en el ojo y el cerebro, dando como resultado la percepción de una imagen completa con el color y el movimiento.

Después de medir las respuestas primas de una célula fotorreceptora a diferentes longitudes de onda de luz a través de registro intracelular, es posible calcular su sensibilidad espectral. Este cálculo se basa en el principio de univariante, que establece que la respuesta de una de las células fotorreceptoras depende del número de fotones que absorbe, pero no en las propiedades particulares de los fotones que absorbe 32. Cualquier fotón que es absorbed por rodopsina inducirá el mismo tipo de respuesta. En la práctica, esto significa que la amplitud de la respuesta en bruto de una célula aumentará ya sea debido a un aumento en la intensidad de la luz (más fotones para absorber), o a un cambio en la longitud de onda hacia su sensibilidad pico (mayor probabilidad de rodopsina de absorción de esa longitud de onda). Hacemos uso de este principio en relacionar las respuestas celulares a una intensidad conocida y la misma longitud de onda de respuestas a diferentes longitudes de onda y la misma intensidad pero la sensibilidad relativa desconocida. Los tipos de células a menudo se identifican por la longitud de onda a la que sus picos de sensibilidad.

Aquí se muestra un método para el registro y análisis de sensibilidad espectral de los fotorreceptores en el ojo de una mariposa intracelular, con un enfoque en lo que este método sea más accesible para la comunidad científica en general. Aunque registro intracelular sigue siendo común en la literatura, particularmente con respecto a la visión de color en los insectos, hemos encontrado that descripciones de materiales y métodos son por lo general demasiado breve para permitir la reproducción de la técnica. Presentamos este método en el formato de vídeo con el fin de permitir su replicación más fácil. También describimos la técnica utilizando un equipo fácil de obtener y asequible. Nos dirigimos advertencias comunes que a menudo no son reportados, que ralentizan la investigación la hora de optimizar una nueva y compleja técnica.

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Protocolo

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Todos los animales fueron tratados lo más humanamente posible. Los insectos fueron enviados como pupas de Costa Rica entomológica de alimentación, Costa Rica.

1. Cuidado de Heliconius pupas

  1. Colgar todas las pupas espaciados 2-3 cm de distancia en una cámara húmeda usando pasadores de insectos.
  2. Después de la eclosión, permiten que las alas se sequen y luego mantener viva mariposas durante al menos 1 día en una cámara húmeda y se alimentan de una solución diluida de miel todos los días antes de la grabación.
    1. Diluir la miel con agua a alrededor de una solución de miel 20% en volumen, y se vierte en un plato poco profundo Petri.
    2. Llevar mariposas individuales a la placa de Petri, uno por uno. Al tocar la solución con sus tarsos frontal, las mariposas se extenderá automáticamente sus probóscides y beber de la placa de Petri. Si su trompa no se extiende de forma automática, el uso de fórceps para tirar de la trompa hacia fuera e introducirlo a la solución de miel.

2. Seguir óptica, calibración, y Measurement de luz Condiciones Experimentales

  1. Coloque una lámpara de arco de xenón de 150 W con la vivienda y la fuente de alimentación universal y un conjunto de lente condensador conectado en un extremo de una mesa de al menos un metro de largo para entregar luz blanca y brillante.
    PRECAUCIÓN: lámparas de arco de xenón producen una luz extremadamente brillante con fuertes intensidades UV. gafas de protección deben ser usados ​​en todo momento y la lámpara debe ser utilizado según las indicaciones del fabricante para evitar la acumulación de ozono causada por la interacción de la luz UV con el oxígeno atmosférico.
  2. Configurar una pista óptica de un metro de longitud para la luz que sale del conjunto de alojamiento para pasar a través (Figura 1).
    1. Lugar en el siguiente orden en la vía óptica con distancias aproximadas de diferencia: 1) una sílice convexa o lente de cuarzo de 40 cm de la construcción del condensador, 2) una rueda de filtros de densidad neutra (sin filtros disponible en la trayectoria de la luz) 22 cm más largo la pista, 3) un obturador con unidad de accionamiento 14 cm desde el filtro NDs, 4) una sílice o cuarzo cóncava de la lente inmediatamente adyacente después de la obturación, y 5) una colimación del haz de la sonda 6 cm más a lo largo el extremo más alejado de la pista.
    2. Colocar un cable de fibra óptica 600 m de diámetro a la sonda de haz de colimación.
      Nota: Dependiendo de la intensidad de luz, un cable de fibra óptica de diámetro 5-10 mm puede ser necesaria para suministrar suficiente luz para otras preparaciones y puede ser sustituido por esto.
    3. Ajustar la distancia, altura y ángulo de cada elemento óptico de modo que el haz de luz que sale del conjunto está en la intensidad más alta posible.
    4. Como elementos de vía ópticas pueden variar ligeramente con diferentes aplicaciones, asegúrese de que todos los elementos transmiten la luz en el rango visible y UVA (315-700 nm).
  3. Una vez que la pista óptica está montado, medir la luz que pasa a través de la configuración usando un espectrómetro. Calibrar el espectrómetro primero usando una lámpara de calibración con un espectro conocido y el software del fabricante.
    Nota: Se describe la siguiente configuración utilizando productos de Ocean Optics por claridad, pero otros fabricantes (por ejemplo, Avantes) vender productos comparables.
    1. Encender la lámpara de tungsteno de calibración por lo menos 45 minutos antes de tomar mediciones.
    2. Para calibrar, conectar el espectrómetro a través de USB a un ordenador con el software asociado instalado. A continuación, conecte el espectrómetro a la lámpara de tungsteno de calibración a través de un corrector del coseno de transmisión UV-visible.
    3. Seleccione "Nuevo Absoluto irradiancia Medición" de la ficha "Archivo" y seleccione el espectrómetro como la "Fuente".
    4. Siga las instrucciones para crear un nuevo archivo de calibración "CAL". Cuando se le solicite, cargue el archivo de datos que establezca el espectro conocido de la lámpara de tungsteno de calibración en el rango de la luz visible (300-800 nm) en el software, que calcula automáticamente el espectro corregido de la salida del espectrómetro.
    5. Guarde el archivo de calibración. Cargar este archivo cuando inializing el software para todas las mediciones futuras de los espectros de luz utilizando el espectrómetro.
  4. Una vez que se calibra el espectrómetro, se utiliza para registrar los espectros de luz de la instalación experimental. De aquí en adelante cuando se abre el software, seleccione "Nuevo Absoluto irradiancia medición" y cargar el archivo de calibración previamente guardado. A continuación, tomar un espectro oscuro bloqueando toda la luz al espectrómetro.
    1. Actualmente con el espectrómetro que mide las condiciones de luz experimentales deseados, ajustar el tiempo de integración (4 ms), las exploraciones de la media (5), y el ancho vagón de carga (5), por lo que el espectro es adecuadamente escalar y suavizan. Mantenga la configuración de la misma para todas las mediciones espectrales, de modo que las intensidades de luz de diferentes mediciones se pueden comparar.
  5. Medir los espectros para la luz blanca no atenuada, para todos los filtros de densidad neutra para ser utilizados durante los experimentos, y para cada filtro de interferencia de paso de banda (Figura 2).
    1. METROEDIDA el espectro de luz blanca sin ningún tipo de filtros de la trayectoria de la luz, fijando el extremo libre del cable de fibra óptica desde el paso 2.2.2 al espectrómetro. Con el archivo de calibración cargado desde el paso 2.3, guardar el espectro de luz blanca utilizando el software del espectrómetro como un archivo de texto.
      Nota: Spectra guarda como lista de archivos de texto la longitud de onda (coordenadas x) en una columna y la intensidad de la luz (y coordenadas) en la segunda columna, por lo que los datos pueden ser cargados en una hoja de cálculo para el paso 2.6.
    2. Utilizando la misma configuración que en el paso 2.5.1, registrar el espectro de cada densidad óptica (DO) (0-3,5 OD) utilizado durante los experimentos mediante la rotación de la densidad neutra (ND) en la pista óptica, y guarde el archivo de texto para cada OD.
    3. Usando la misma configuración que en la etapa 2.5.1, colocar filtra la interferencia nm de ancho de banda media 10 uno por uno en la trayectoria de la luz y registrar el espectro observado para cada filtro. Repita este procedimiento para cada uno de los 41 filtros de interferencia diferentes wtransmitancias máximas ITH espaciadas cada 10 millas náuticas de 300 a 700 nm. Filtros más espaciadas (20 nm) son aceptables para la mayoría de aplicaciones (por espectros, véase la figura 2).
  6. Corregir las diferencias en la intensidad de la luz cuando los filtros de interferencia se colocan en la trayectoria de la luz. Cada filtro de interferencia permite que un número total de fotones diferente a pasar, y la baja transmisión de algunos filtros hace que sea difícil para atenuar aún más la intensidad de manera que todos los filtros permiten que el mismo número de fotones.
    1. Para calcular la intensidad relativa (I) para cada filtro de interferencia de ancho de banda de 10 nm, para resolver I en la expresión, I = T / seg, donde T es el área bajo la curva espectral de cada filtro de interferencia 10 nm (de 2.5.3) y s es la irradiancia absoluto (valor y del archivo de texto guardado desde 2.5.1) máxima de la luz blanca en la longitud de onda máxima de cada filtro (Ver Figura 2 para un ejemplo a 520 nm).
    2. Dividir todo intensit calculadaIES por el valor de intensidad máximo calculado de 2.6.1 para normalizar a uno, y toman el recíproco de los valores normalizados relativos para uso como un factor de corrección aplicada a la sensibilidad en bruto en cada longitud de onda (véase el paso 6.4).
  7. Realice los pasos 2.1 a 2.6 sólo una vez antes de una serie de experimentos. En el transcurso de un experimento registrar periódicamente la irradiancia absoluto de la lámpara de arco de xenón con luz brillante y filtros de densidad neutra, para asegurarse de que la intensidad del estímulo de luz no cambia.
  8. Durante el transcurso de un experimento, si cualquier respuesta celular a la luz transmitida a través de los filtros de interferencia se aproxima a la amplitud de la respuesta máxima, utilizar los filtros ND para atenuar la señal. Si se utilizan filtros ND durante un experimento, dar cuenta de la correspondiente disminución en la intensidad durante el cálculo de la sensibilidad espectral.
  9. Fijar la pista óptica, calibración y filtros días o semanas antes de que empiece el experimento. Mantenga los filtrostapados para evitar la acumulación de polvo.

Configuración 3. Equipo de grabación

  1. Alimentar el mismo cable de fibra óptica utilizada para la calibración a través de una jaula de Faraday y montar en un dispositivo goniométrica como un perímetro de brazo de transmisión (véase la Figura 3 para el diagrama). El cable será de unos 10 cm de distancia del ojo de la muestra.
  2. Coloque una etapa de metal en una mesa aislada vibratoriamente con un soporte de electrodo montado directamente sobre el escenario bajo el control de un micromanipulador (Figura 4). Coloque el brazo Cardan de modo que la cabeza de la muestra está en el centro de la esfera creado por el movimiento de rotación del brazo.
  3. El uso de un sistema de pre-amplificador intracelular, que incluye un amplificador (fuera de la jaula de Faraday) y preamplificador (cabezal de la platina, cerca de la preparación dentro de la jaula de Faraday) montar el cabezal de la platina sobre el escenario de metal donde se colocarán las muestras.
    1. Conectar un cable coaxial a la cabezal de la platina a través de unaconexión BNC. Dividir abierta sólo la punta en el otro extremo del cable coaxial, y separar la vaina metálica exterior del cable del cable interior.
    2. Soldar la funda exterior (mantenido a potencial de tierra) a un extremo de un cable de cobre aislado con una pinza de conexión en el otro extremo. Esta pinza se unirá al electrodo de referencia de metal en la plataforma de la muestra (Paso 5.1.4).
    3. Suelda el cable interior del cable coaxial a un cable de plata fina, para servir como el electrodo de registro. Este cable debe ser lo suficientemente delgado para ser alimentado en el electrodo de vidrio lleno de solución en el paso 5.2.3.
  4. Colocar un estereomicroscopio unido a un brazo oscilante y la base en el banco de madera fuera de la jaula de Faraday, de modo que puede ser girado en bajar el electrodo en el ojo, y volvió de nuevo hacia fuera de nuevo una vez que el electrodo está en el ojo.
  5. Asegúrese de que todo el metal dentro de la jaula de Faraday está correctamente conectado a tierra.
  6. Fuera de la jaula de Faraday, una el preamplifer a la entrada de un reductor de ruido de 50-60 Hz (opcional), y conectar la salida de un canal de un osciloscopio BNC utilizando un adaptador en T.
  7. Usando el otro extremo del adaptador en T, conecte la señal que pasa por el osciloscopio para un canal del hardware. Coloque este dispositivo a un ordenador mediante un cable USB, lo que permitirá a las respuestas grabadas con el preamplificador para ser leído por el software en el ordenador.
  8. Una el controlador del obturador de la pista óptica al segundo canal del osciloscopio utilizando otro T-adaptador y conectar a un generador de impulsos que controlará la frecuencia y duración de destellos de luz entregados a la vista (paso 5.5).
    Nota: La configuración de la propia plataforma sólo debería ser necesario hacer una vez. Romper aquí hasta que esté listo para comenzar las grabaciones.

4. Preparación para el día de la grabación

  1. Encienda la lámpara de xenón, al menos, 45 minutos antes del experimento y encienda el extractor de microelectrodos de vidrio al menos 30 minutos antes de Pulelectrodos de vidrio ling.
  2. Encienda todos los equipos de grabación (obturador, amplificador, eliminador de ruido, generador de impulsos, osciloscopio, y la adquisición de datos de hardware) y asegúrese de que el obturador está cerrado de forma predeterminada para la luz no pasa a través del cable de fibra óptica.
  3. Tire de borosilicato fina (o aluminosilicato) microelectrodos de vidrio (100-250 resistencia mO es ideal) utilizando un extractor de microelectrodos de vidrio. Utilizar electrodos de vidrio dentro de sólo unos pocos horas de ser empujado.
  4. Rellene los electrodos con cloruro de 3 M de potasio (KCl). Tenga en cuenta que esta solución puede ser modificado de acuerdo con las necesidades del investigador, por ejemplo colorante de inyección.

5. Procedimiento de muestras y preparación de grabación

  1. Preparar el espécimen
    1. Fijar una mariposa individuales dentro de un pequeño tubo de plástico con cera caliente por lo que la cabeza es inmóvil y que sobresale de un extremo del tubo. Cera abajo trompa, antenas y las alas (Figura 5).
    2. Mantenga pulsada la tecla tél abdomen con un trozo seco de cera y mantener el tubo humidificado mediante la colocación de un tejido húmedo en el interior del tubo detrás del abdomen. Asegúrese de que la muestra está completamente inmóvil.
    3. Montar el tubo usando un pequeño trozo de cera sobre una pequeña plataforma con una junta de bola y cavidad que se une a una base magnética.
    4. Bajo un microscopio de disección, insertar un alambre de plata de 0.125 mm de diámetro en el cabezal a través de las piezas bucales para ser utilizado como el electrodo de referencia. Antes del experimento, fijar permanentemente el cable a la plataforma de tal manera que el alambre de cobre en el paso 3.3.2 puede enganchar en que una vez que la plataforma se coloca en el escenario para la grabación.
    5. Una vez que el electrodo de referencia se encuentra en una posición adecuada puede ser mantenido en su lugar por la fusión rápidamente y luego la cera de refrigeración alrededor del alambre.
    6. El uso de una cuchilla de afeitar de acero al carbono rompible, parte de agarre de la hoja con un soporte de la cuchilla y romper un pedazo pequeño de usar para el corte de la córnea.
    7. Corte un agujero pequeño (~ 10 ommatidiun de diámetro) en la córnea izquierda utilizando la hoja de afeitar y sellar el agujero con vaselina para evitar la desecación.
  2. Una vez que se corta la córnea, insertar el electrodo de registro en el ojo tan rápidamente como sea posible porque hemolinfa en el ojo se endurece rápidamente y hacen que sea imposible para insertar un electrodo. Si es posible realizar la disección de la plataforma donde se llevará a cabo la grabación.
    Nota: La vaselina no debe unta en el resto del ojo ya que esto desenfocar la óptica.
    1. Si no está ya en el escenario, colocar la muestra montada y la plataforma en el escenario en el equipo de grabación. Conectar el cable de tierra cabezal de la platina de la etapa 3.3.2 al electrodo de referencia en la plataforma espécimen utilizando pinzas de cocodrilo.
      Nota: Si es posible utilizar un filtro rojo para iluminar el animal.
    2. Utilice una fuente de luz con los accesorios de cuello de cisne a la luz brevemente el espécimen en un estereoscopio al tiempo que reduce el electrodo de registro en el ojo.
    3. EnSERT el alambre de plata conectado al cabezal de la platina de la etapa 3.3.3 en la solución de KCl en la parte posterior de un microelectrodo de vidrio. Montar el electrodo de vidrio en el soporte del electrodo.
    4. Ajuste el soporte del electrodo de modo que el microelectrodo es directamente sobre el orificio previamente cortado en la córnea, aproximadamente un milímetro por encima de la córnea. Bajar el microelectrodo en el ojo utilizando el micromanipulador hasta que se completa un circuito, como se muestra por un gran cambio en el potencial (mV) en el osciloscopio.
  3. Una vez en el ojo, el estereoscopio pivotar fuera de la jaula de Faraday, y apague la fuente de luz que ilumina la muestra. El cuarto se mantendrá oscuro por lo que el ojo se vuelve adaptado a la oscuridad.
  4. Comprobar la resistencia del electrodo mediante la aplicación de una corriente de 1 nA desde el amplificador y observando el cambio en el voltaje. Resistencia normalmente debe estar en el rango entre 100 a 250 mO. resistencias más altas son indicativas de bloqueo o de flexión del electrodo, y bajas resistencias de electroda la rotura.
  5. Activar el generador de impulsos de modo que el obturador se abre permitiendo que un destello de luz con una duración de 50 ms cada 0,5 seg, y que le permita seguir parpadea para la duración del experimento.
    1. Ajuste el generador de impulsos por lo que permite destellos de hasta 50 mseg de duración. Esta duración y pausa de 0,5 segundos entre destellos mantiene el espécimen tan cerca como sea posible adaptación a la oscuridad durante el experimento. El cincuenta milisegundos está cerca de la duración del flash más corto que provocará la misma amplitud de la respuesta duración de flash más largos.
    2. respuestas re-medida, tanto en el inicio y al final del experimento (Paso 5.16). En el transcurso de alrededor de un experimento de 20 minuto, estos ajustes de flash no se degradan la respuesta en el tiempo. Diferentes preparaciones pueden requerir ajustes en estos ajustes del flash.
  6. Coloque el brazo Cardan de modo que el cable de fibra óptica se dirige hacia el ojo.
  7. Compruebe el osciloscopio para el cambio de tensión con cada destello de luz.Un cambio negativo en tensión significa que el electrodo aún no ha entrado en una célula.
  8. Mueva el brazo Cardan alrededor de la muestra hasta que se coloca en un ángulo con el ojo en el que hay una respuesta de tensión máxima.
  9. Girar el micromanipulador de ida y vuelta, haciendo muy pequeños movimientos verticales de la electrodo en ambas direcciones mientras que golpeando ligeramente la base del soporte del electrodo o mediante la función de zumbido en el preamplificador. Seguir haciendo pequeños ajustes hasta que aparezca una respuesta a la luz de despolarización en el osciloscopio (Figura 6).
  10. Ajuste el brazo del cardan de nuevo para encontrar el ángulo de incidencia en un destello de luz produce la mayor señal de despolarización. Hacer pequeños ajustes con el micromanipulador y utilizar la función del zumbido en el amplificador como sea necesario para asegurarse de que el electrodo está grabando de forma estable en la célula y que permanecerá en la celda para todo el experimento (Consulte el paso 5.11).
  11. Una vez que la configuración es estable, comenzará recording. Una grabación estable debe tener poco o ningún cambio en el potencial, bajo nivel de ruido de fondo, y una gran respuesta de despolarización constantemente en reposo (al menos un 10: 1 señal a ruido).
    1. Ejecutar el software en el ordenador, y comenzar una "nueva experiencia", que se abrirá una ventana emergente con cuatro canales.
    2. Ajustar la escala de tensión en la esquina superior derecha de la ventana del software a 500 mV. El primer canal se mostrará las respuestas grabadas desde el electrodo en tiempo real, mientras que el segundo canal registrará la onda cuadrada producida por el generador de funciones, si la señal se alimenta al hardware de adquisición de datos a través del osciloscopio, que muestra cuando el obturador está abierto . Los otros dos canales son innecesarios.
    3. Haga clic en "Inicio" en la esquina inferior derecha para iniciar la grabación, y permitir que el software se ejecute durante la duración del experimento. Ajuste el zoom de la x (tiempo) e Y (tensión) de los ejes de modo que las respuestas son claras.
  12. En primer lugar, con la luz blanca, grabar hasta 10 respuestas individuales con la rueda de filtros ND en el 3,5 OD (5-10 seg).
  13. Registro siguiente el mismo número de respuestas a 3,3 OD, a continuación, 3,1, 3,0, 2,5, 2,3, 2,1, etc., en todas las combinaciones hasta 0,0 OD. Estas amplitudes de respuesta a la serie de filtro ND proporcionarán la curva de intensidad de respuesta-log en la Sección 6. Si se produce decoloración, utilizar menos destellos de estímulos luminosos durante el curso del experimento.
  14. Registrar la respuesta de la célula a todos los longitudes de onda, utilizando los filtros de interferencia.
    1. En primer lugar encontrar la longitud de onda máxima. Sin filtros ND en la trayectoria de luz (0.0 OD), colocar un filtro UV de transmisión en el trayecto de la luz y brevemente observar la amplitud de la respuesta. Repita con un filtro azul de transmisión, un filtro de transmisión verde, y un filtro de emisión de color rojo, que debe dar una idea de dónde estará la respuesta del pico.
    2. Utilizar filtros en alrededor de 350, 450, 550, 650 nm para encontrar la región general de la sensibilidad pico en5.14.1 paso. La longitud de onda exacta no importa en esta fase inicial de búsqueda porque todas las longitudes de onda se grabarán en la siguiente etapa. Si existen estimaciones de las sensibilidades de pico, o que han sido registrados previamente, el uso de longitudes de onda conocida para identificar rápidamente la respuesta del pico.
    3. Una vez que la respuesta del pico o cerca de ella se identifica, récord en esta longitud de onda de 10 respuestas (aproximadamente 5 segundos).
    4. Después de la grabación en la longitud de onda del pico de respuesta, registro con los otros filtros de interferencia, a partir de 300-700 nm a 10 nm pasos. Comience desde el pico y salir hacia ambas longitudes de onda más cortas y más largas mediante el canje de los filtros hacia fuera de la trayectoria de la luz de uno en uno (por ejemplo, si la respuesta del pico es a 520 nm, las respuestas de registro en esta longitud de onda en primer lugar, a continuación, 510 nm, seguido por 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, y así sucesivamente hasta que no hay ninguna respuesta).
    5. Permitir hasta 10 respuestas por filtro (5 seg cada uno). Cuando el canje de filtros de interferencia, permitir a la célula respond a 1-2 destellos de luz blanca sin ningún tipo de filtro en la trayectoria de la luz, lo cual es útil para monitorear si la respuesta del pico está degradando con el tiempo. Reducir el número de respuestas o aumentar el diámetro exterior si se produce la decoloración.
  15. Si la respuesta en virtud de cualquier filtro de interferencia está demasiado cerca de la respuesta máxima con luz blanca a 0 OD, a continuación, atenuar con filtros ND. Los filtros y tamaño del cable de fibra óptica utilizado en este experimento de interferencia se atenúan en gran medida la intensidad de la luz y por lo general no se necesitan filtros ND.
  16. Si la grabación se mantiene volver a grabar longitudes de onda estables, alrededor de la respuesta del pico, que sirve como un pseudoreplicate para confirmar amplitudes de respuesta anteriores y ayuda a garantizar la respuesta no ha degradado con el tiempo. Una vez que todas las longitudes de onda se registran, volver a grabar las reacciones de la serie ND, como en el paso 5.12.
  17. Una vez que la grabación está completa haga clic en "Stop" en el software, y guardar la grabación para su análisis.
  18. Después de un experimento, sacrificar al individuo mediante la congelación o refrigeración durante varios minutos, seguido por la ruptura con rapidez la cabeza y el aplastamiento del tórax.
  19. Apagar todo el equipo. Romper aquí si es necesario antes de realizar el análisis.

6. Análisis de sensibilidad espectral

  1. Con el software utilizado para registrar las respuestas primas, calcular la amplitud de la respuesta media de 10 respuestas individuales para cada filtro de la serie ND y para cada filtro de interferencia.
  2. Crear una función de respuesta-log de ​​intensidad (VlogI) de la serie de filtro ND registrado en los Pasos 05.12 a 05.13 (Figura 7). Para ello, el trazado de las unidades de registro de intensidad (OD) en el eje X, y la respuesta a cada intensidad en el eje y.
    1. Para derivar la sensibilidad espectral de la célula en diferentes longitudes de onda, típicamente ajustarse a la ecuación Naka-Rushton a los datos de la etapa 6.2, y utilizar esta ecuación para relacionar respuestas espectrales obtenidos experimentalmente de diferentes longitudes de onda to fotones relativa requerida para provocar que la respuesta en virtud de una longitud de onda constante (en este caso la luz blanca).
      Nota: La ecuación Naka-Rushton es: V / V max = I n / (I n + K n), donde I es la intensidad del estímulo, V es la amplitud de la respuesta, V max es la amplitud de la respuesta máxima, K es el estímulo intensidad dando ½ V max, y n es la pendiente exponencial. Varios métodos se pueden utilizar para adaptarse a esta ecuación a los datos VlogI, incluyendo el software de ajuste de curvas, o paquetes estadísticos basados ​​en códigos.
    2. Para adaptarse a la ecuación de Naka-Rushton utilizando cálculos sencillos y un programa de hoja de cálculo, transformar los datos de respuesta para cada VlogI intensidad del estímulo: log [(V max / V) - 1]. A continuación, realizar la regresión lineal de los datos transformados para obtener la ecuación de la recta de mejor ajuste.
      Nota: V max debe ser mayor que cualquier respuesta medidos; para mantener esta constante, este método calcula V max 1% greater que la respuesta medida más alta.
    3. A partir de la ecuación de la recta de regresión, estimar el exponente (n) tomando la pendiente negativa, y log (K) = ordenada en el origen / n.
  3. Una vez que los parámetros de V max, n, y K se han estimado, determinar el número relativo de fotones necesarios para provocar la respuesta espectral de la célula en cada longitud de onda mediante la conexión de la respuesta espectral se mide a una longitud de onda dada como (V) y la solución de por I.
  4. Multiplicar la intensidad del estímulo calculado (I) de la etapa 6.3 por el factor de corrección para cada filtro de interferencia (de la etapa 2.4.3) en cada longitud de onda.
  5. Para obtener la sensibilidad, todas las intensidades deben estar relacionados con la curva V-me registro para que puedan ser comparados. Hacer esto, relacionando cada intensidad de longitud de onda a ½ V max o K, calculada en el paso 6.2.3.
    1. Restar cada intensidad de longitud de onda corregida (etapa 6.4) de K.
    2. Luego, para cada longitud de onda de intensidad, añadir este "distancia del valor de K "de K, y se multiplica por (-1).
    3. Siguiente llevar a todos los puntos de datos positivos sumando el valor absoluto del punto de datos más bajo de la serie para cada longitud de onda.
  6. Encuentra la sensibilidad en cada longitud de onda tomando el recíproco de todas las intensidades recién calculados a partir del paso 6.5.1. Transformar los datos de forma que el espectro de sensibilidad cae entre 0 y 1.
  7. Después de la grabación de más de una célula del mismo tipo promedio de las respuestas finales y la trama con barras de error estándar o intervalos de confianza del 95% (Figura 8).

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Resultados

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Para muchos elementos de la configuración de la grabación, una descripción escrita no proporciona suficiente detalle. La Figura 1 es un esquema de los componentes involucrados en el sistema de grabación completa. En la Figura 2, los espectros se trazan para la luz blanca y cada filtro de interferencia para dar una idea de por qué se necesita un factor de corrección y lo que se necesita para calcular esta corrección. La figura 3 muestra fotos y un diagrama del b...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

registro intracelular puede ser una técnica difícil de dominar debido a los muchos pasos técnicos involucrados. Para los experimentos con éxito varios puntos importantes deben ser considerados. En primer lugar, es importante tener una mesa adecuadamente aislado vibratoriamente-en el que se realiza el experimento. Muchos investigadores utilizan mesas de aire, que separan completamente de la mesa de la base, dando el aislamiento de vibración superior. Nuestra configuración consiste en una mesa de mármol de espesor con una...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a finales Rudy Limburg para fabricar el perímetro del brazo de cardán, Kimberly Jamison, Mateo McHenry, y Raju Metherate por prestarnos el equipo, y Almut Kelber y Kentaro Arikawa, para el estímulo. Este trabajo fue apoyado por una Fundación Nacional de Ciencia (NSF) Licenciado beca de investigación para KJM y NSF IOS-1.257.627 a ADB

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pupasde mariposa Varias especies locales disponibles, necesitan permisos del USDA para su envío. Carolina Bio Supply tiene varias especies de insectos que se pueden pedir dentro de los EE. UU. sin necesidad de permisos adicionales Cilindro
de plástico grandeCualquier cámara que permanezca humidificada funcionará
Alfileres para insectos, tamaño 2BioQuip1208B2
Miel de mezquite del desierto 100% TraderJoe'smiel o sacarosa funcionará
Lámpara de arco de xenónOriel Instruments66003Oriel ahora es parte de Newport Corporation Fuente de
alimentación universalOrielInstruments 68805Oriel ahora es parte de Newport Corporation
Optical TrackOriel Instruments11190Oriel ahora es parte de Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel ahora es parte de Newport Corporation
Portador de riel, pequeño (4x)Oriel Instruments11647Oriel ahora es parte de Newport Corporation
Adaptador de rosca, 8-32 macho a 1/4-20 macho, paquete de 10Newport CorporationTA-8Q20-10
montaje óptico, 1.0 pulg., 0.5 pulg. Diámetro Inoxidable, 8-32 y 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
Soporte de poste óptico antideslizante, 2 pulg., 0.5 pulg. Diámetro de los postes, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Montura de lente fija, 50,8 mmNewport CorporationLH-2
Montura de lente fija, 25,4 mmNewport CorporationLH-1
Conjunto de lente de condensadorNewport Corporation60006
Lente de sílice convexa, 50,8 mmNewport CorporationSPX055
Rueda de filtro de seis posiciones, x2Newport CorporationFW1X6
Cubo de montaje de rueda de filtroNewport CorporationFWM
Lente de sílice cóncava, 25,4 mmNewport CorporationSPC034
Soporte de colimadorNewport Corporation77612
Sonda de haz de colimaciónNewport Corporation77644
Convertidor de férula, terminación SMA a férula estándar de 11 mmNewport Corporation77670Este adaptador permite que la fibra óptica encaje en el soporte del colimador 
600 μ m diámetro cable obstico de fibra UV-visOriel Instruments78367Oriel ahora es parte de Newport Corporation
Obturador con unidad motrizUniblitz100-2B
Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 0.1 ODNewportFRQ-ND01
Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 0.3 ODNewportFRQ-ND03
Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 0.5 ODNewportFRQ-ND05
Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 1.0 ODNewportFRQ-ND10
Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 2.0 ODNewportFRQ-ND30
Filtro ND metálico de sílice fundida UV, 3.0 ODLámpara NewportFRQ-ND50
LS-1-CalOpticsLS-1-Cal
EspectrómetroOcean Optics Ocean OpticsUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
Filtro de paso de banda de interferencia, 300 nm Edmund Optics67749
Filtro de paso de banda de interferencia, 310 nm Edmund Optics67752
Filtro de paso de banda de interferencia, 320 nm Edmund Optics67754
Filtro de paso de banda de interferencia, 330 nm Edmund Optics67756
Filtro de paso de banda de interferencia, 340 nm Edmund Optics65614
Filtro de paso de banda de interferencia, 350 nm Edmund Optics67757
Filtro de paso de banda de interferencia, 360 nm Edmund Optics67760
Filtro de paso de banda de interferencia, 370 nm Edmund Optics67761
Filtro de paso de banda de interferencia, 380 nm Edmund Optics67762
Filtro de paso de banda de interferencia, 390 nm Edmund Optics67763
Filtro de paso de banda de interferencia, 400 nm Edmund Optics65732
Filtro de paso de banda de interferencia, 410 nm Edmund Optics65619
Filtro de paso de banda de interferencia, 420 nm Edmund Optics65621
Filtro de paso de banda de interferencia, 430 nm Edmund Optics65622
Filtro de paso de banda de interferencia, 440 nm Edmund Optics67764
Filtro de paso de banda de interferencia, 450 nm Edmund Optics65625
Filtro de paso de banda de interferencia, 460 nm Edmund Optics67765
Filtro de paso de banda de interferencia, 470 nm Edmund Optics65629
Filtro de paso de banda de interferencia, 480 nm Edmund Optics65630
Filtro de paso de banda de interferencia, 492 nm Edmund Optics65633
Filtro de paso de banda de interferencia, 500 nm Edmund Optics65634
Filtro de paso de banda de interferencia, 510 nm Edmund Optics65637
Filtro de paso de banda de interferencia, 520 nm Edmund Optics65639
Filtro de paso de banda de interferencia, 532 nm Edmund Optics65640
Filtro de paso de banda de interferencia, 540 nm Edmund Optics65642
Filtro de paso de banda de interferencia, 550 nm Edmund Optics65644
Filtro de paso de banda de interferencia, 560 nm Edmund Optics67766
Filtro de paso de banda de interferencia, 570 nm Edmund Optics67767
Filtro de paso de banda de interferencia, 580 nm Edmund Optics65646
Filtro de paso de banda de interferencia, 589 nm Edmund Optics65647
Filtro de paso de banda de interferencia, 600 nm Edmund Optics65648
Filtro de paso de banda de interferencia, 610 nm Edmund Optics65649
Filtro de paso de banda de interferencia, 620 nm Edmund Optics65650
Filtro de paso de banda de interferencia, 632 nm Edmund Optics65651
Filtro de paso de banda de interferencia, 640 nm Edmund Optics65653
Filtro de paso de banda de interferencia, 650 nm Edmund Optics65655
Filtro de paso de banda de interferencia, 660 nm Edmund Optics67769
Filtro de paso de banda de interferencia, 671 nm Edmund Optics65657
Filtro de paso de banda de interferencia, 680 nm Edmund Optics67770
Filtro de paso de banda de interferencia, 690 nm Edmund Optics65659
Filtro de paso de banda de interferencia, 700 nm Edmund Optics67771
de FaradayFuncionará cualquier estructura metálica que pueda conectarse a tierra y que se adapte a la configuración experimental.
Microscopio estereoscópico, 6X, 12X, 25X, aumento de 50XWild HeerbruggWild M5Cualquier microscopio estereoscópico servirá
Soporte de microscopio con brazo oscilante y base pesadaMcBain InstrumentsCualquier base pesada con brazo servirá
BrazoHecho a medida, ver Figura 4
>Fiber-lite iluminador de alta intensidadDolan-JennerMI-150Para la muestra
de iluminación Guía de luz de cuello de cisne de fibraDolan-JennerEEG 2823Cualquier guía de luz de cuello de cisne servirá
Mesa
MesaSe debe cortar un agujero a través de esta mesa para que la caja de arena pueda descansar sobre la mesa de mármol debajo
Caja de madera llena de arenahecha a medida, cualquier caja con arena
ManipuladorCarl Zeiss - Jena
Portaelectrodos Etapa
muestra
Alambres de pinza de cocodrilo para conexión a
Alambre
Alambre de plata, 0,125 mm de diámetroCables
AGW0510 BNC de World Precision Instruments
Preamplificador con cabeceraDagan CorporationIX2-700
Humbug Reductor de ruidoQuest ScientificOsciloscopio Humbug
30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, sin sondaEZ Digitalos-5030
BNC Adaptador
Hardware Powerlab 2/20ADI instrumentsML820
Software Labchart ADIinstrumentsChart 5
impulsos de 10 MHzBK Precision4030
Extractor de pipetas de vidrioSutter InstrumentsP-87
Capilares de vidrio de borosilicato con filamentoWorld Precision Instruments1B120F-4
Cloruro de potasio, 3 M
plástico ranurado
Cera
SoldadorWeller
Plataforma con base magnética de bola y casquilloHama foto y vídeo
Hoja de afeitar de acero al carbono de doble filo, rompibleMicroscopía Electrónica Sciences72004
Vaselina
Microsoft ExcelMicrosoft
Cualquier solución de Poste de Ocean Jaula cardán ligera de mármol de madera elevada detierrade cobre aislado, en TGenerador de Tubo de de baja temperatura de fusión

Referencias

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