Artículo de método

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje

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DOI:

10.3791/53830

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31 de enero de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, The Wenner-Gren Institute (MBW), Stockholm University

En este artículo

Resumen

Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color.

Resumen

Para analizar genes redes reguladoras activas durante el desarrollo embrionario y la organogénesis es esencial para definir con precisión cómo los diferentes genes se expresan en relación espacial entre sí in situ. Multi-objetivo cromogénico todo el montaje hibridación in situ (MC-DESEO) facilita en gran medida en el instante en comparación de los patrones de expresión de genes, ya que permite la visualización distintiva de las diferentes especies de ARNm en colores contrastantes en el mismo espécimen de muestra. Esto proporciona la posibilidad de relacionar los dominios de expresión génica topográficamente entre sí con gran precisión y definir los sitios de expresión únicos y solapados. En el protocolo presentado, se describe un procedimiento de MC-Wish para comparar los patrones de expresión de mRNA de diferentes genes en embriones de Drosophila. Hasta tres sondas de ARN, cada uno específico para otro gen y etiquetado por un hapteno diferente, son simultáneamente hibridado a las muestras de embrión y posteriormente detectado por medio de álcaline-fosfatasa basa inmunohistoquímica colorimétrico. El procedimiento descrito se detalla aquí para Drosophila, pero funciona igual de bien con embriones de pez cebra.

Introducción

La hibridación in situ (ISH) es el método estándar para la detección y localización de los transcritos de ARN en un contexto morfológico, dentro de las células, tejidos y organismos 1. Las señales producidas por el procedimiento de ISH son comúnmente visualizaron mediante sistemas de detección radiactivas, fluorescentes y cromogénicos. En los últimos años los avances tecnológicos significativos en ISH fluorescente (FISH) 2 como resultado mejorado dramáticamente sensibilidad y resolución, lo que permite la detección y cuantificación de la expresión de ARN en una sola célula y los niveles subcelulares y visualización de ARN hasta moléculas individuales 3,4 .Mientras métodos sofisticados de FISH de una sola molécula se utilizan para aplicaciones más especializadas, ISH cromogénico es generalizada como un RNA de rutina en el método de detección in situ en la investigación y el diagnóstico clínico. Para la detección cromogénico se utilizan reacciones enzima precipitación, que generan productos visibles en colores contrastantes en los sitios5 de la hibridación. Esto tiene la ventaja de que la visualización de ARN se puede combinar con tinciones histológicas de rutina y el contexto morfológico es inmediatamente evidente por microscopía de campo claro estándar. Por otra parte, numerosos de los sustratos de color aplicadas producen precipitados, que son estables en medios de montaje orgánicos y / o acuosos, por lo que las preparaciones permanentes de muestreo se pueden obtener 5.

En Drosophila, los protocolos de ISH iniciales aplicadas sondas marcados con radioisótopos para la detección de la transcripción del material seccionado 6. Si bien es difícil de reconstruir a partir de secciones de tejido patrones de transcripción completos de embriones enteros o sistemas de órganos, la aplicación de procedimientos cromogénicos ISH con sondas no marcadas radiactivamente hace posible detectar distribuciones globalmente el ARN en los montajes enteros-7. Aunque existen muchas variaciones de ISH cromogénico, en el típico todo el montaje hibridación in situ los protocolos (ojalá) hybsondas de hapteno marcado con ridized son detectados por anticuerpos anti-hapteno conjugado a una enzima informadora y transcritos de ARNm se visualizaron mediante un cromógeno precipitante.

La paleta de precipitados de diferentes colores producidos por el reportero enzimas de fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano picante (POD), y beta-galactosidasa (GAL) permite para la detección distintivo de múltiples dianas en una y la misma muestra de 8-14. Sin embargo, la actividad enzimática POD dura sólo durante un período de tiempo limitado y la reacción colorimétrica GAL es algo menos sensible, por lo que sin amplificación adicional (tiramida) de señal 15 la detección de menos abundantes transcripciones puede ser un reto con estas enzimas. En contraste, la actividad permanente de AP permite de larga duración renovación del sustrato y de alta relación señal-ruido. Por lo tanto, la detección secuencial usando AP enzima informadora con sustratos de diferente color ha demostrado ser exitoso en el eficaz ydetección distintivo de hasta tres transcripciones diferentes en embriones individuales 10-12,16.

Por esta multi-objetivo DESEO cromogénico (MC-DESEO) método (Figura 1) 14, sondas de ARN antisentido etiquetadas son generados por la transcripción in vitro y marcados con una de las hapteno-etiquetas disponibles. Los embriones son formaldehído fijos y permeabilized por tratamiento con metanol y proteinasa K digestión. La hibridación de los embriones se lleva a cabo simultáneamente con hasta tres sondas de ARN antisentido marcadas de manera diferente cada específicos para un gen diferente. Después de retirar la sonda no unida por lavados de rigurosidad cada etiqueta hapteno se visualiza en una ronda separada de detección. Una sola ronda de detección consiste en la incubación de embriones con un anticuerpo anti-hapteno acoplado a AP y visualización de ARN mediante la aplicación de un AP-sustrato que produce un precipitado de color estable localizada. Después de la detección de anticuerpos y la tinción, el conju anticuerpo-AP aplicadopuerta se elimina mediante un lavado de pH bajo. En experimentos multicolores, cada ronda de detección emplea un anticuerpo dirigido contra un hapteno-etiqueta diferente y cada patrón de transcripción se visualiza por un sustrato de color diferente (Tabla 1). Los embriones se montan en glicerol y la imagen en el microscopio compuesto de alta resolución usando contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica.

Protocolo

1. Etiquetado de sondas de ARN in vitro de transcripción

  1. Montar reacción de transcripción in vitro en un microtubo de 1,5 ml bajo-RNasa libre de condiciones: 10,5 l tratada con DEPC H 2 O, 4,0 l de 5x tampón de transcripción, 1,0 l (1 g) linealizado, plantilla de ADN purificado en tratada con DEPC H 2 O, 1,3 l de mezcla NTP, 0,7 l UTP marcado con hapteno, 0,5 l inhibidor de RNA RiboLock, 2,0 l ARN polimerasa.
    Nota: El volumen final de reacción es de 20 l.
  2. Dependiendo de secuencia del promotor T7 uso de la plantilla, T3 o SP6 RNA polimerasa para la transcripción in vitro (véase la referencia 17).
  3. Seleccione digoxigenina-11-UTP, biotina-16-UTP o fluoresceína-12-UTP como etiqueta para la sonda de ARN. Para más detalles, véase el análisis de hapteno etiquetas y concentraciones de sonda en la Discusión.
  4. Mezclar reacción de transcripción y de girar en breve.
  5. Deje transcribirdurante 3 horas a 37 ° C.
  6. Añadir 1 l de DNasa libre de RNasa I de la reacción de transcripción para la eliminación de ADN molde, mezclar bien, y se incuba durante 15 min a 37 ° C.
  7. Ajuste con tratada con DEPC H2O el volumen de muestra de 200 l.
  8. Añadir 100 ml (0,5 vol) de acetato de amonio 7,5 M y 600 l (3 vol) de etanol para precipitar la sonda de ARN marcada. Incubar durante 30 min a TA.
    1. No use etanol helado, ya que esto puede conducir a la precipitación no deseada de nucleótidos no incorporados.
  9. Centrifugar el ARN transcrito en una centrífuga de temperatura controlada a velocidad máxima (20.800 xg) durante 30 min a 20 ° C. Aspirar cuidadosamente sobrenadante.
  10. Lavar el sedimento resultante con etanol al 70% a temperatura ambiente y centrifugar a 20.800 xg durante 10 min a 20 ° C.
  11. Eliminar el sobrenadante y tener cuidado de no aspirar accidentalmente el sedimento suelto. Deje secar al aire de pellets en el microtubo con tapa abierta para unos pocos minutos a temperatura ambiente.
  12. Disresolver el sedimento obtenido en 100 l de DEPC tratados con H 2 O.
  13. Añadir 300 l de tampón de pre-hibridación (50% vol / vol de formamida desionizada, 5x SSC, 50 mg / ml de heparina sódica sal, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml de ARN torula) y almacenar a -20 ° C . Las sondas pueden ser a largo plazo se almacena a -20 ° C.
    Nota: Para obtener una primera prueba de la sonda diluida 3 l sonda de ARN hapteno marcado recién transcrito en 100 l de tampón de hibridación para obtener la concentración final para el experimento DESEO.

2. Tramitación de embriones muestras usando insertos

Nota: El uso microtubos o placas de múltiples pocillos para el procesamiento de embriones a través de los diferentes pasos de incubación lleva el riesgo de perder cantidades significativas de embriones mediante la aspiración accidentalmente durante el intercambio de soluciones. Para evitar esta pérdida, puede ser útil usar cestas (tales como inserciones Netwell) para llevar muestras de embrión a través del procedimiento. Estos son poliestireno eninsertos con una malla de poliéster en la parte inferior (Figura 2A), en la que descansan los embriones durante el procesamiento.

  1. Para el procesamiento de los embriones en el procedimiento de DESEO, montar las inserciones en una placa de 12 pocillos (Figura 2B) y añadir 2 ml de la solución adecuada a cada pocillo.
  2. Pipetear los embriones en los insertos utilizando una punta azul. Asegúrese de que todos los embriones se sumergen en un líquido.
  3. Cuando el tiempo de incubación es sobre el lugar que contiene las inserciones de embriones en otra placa de 12 pocillos, que se llena con la solución para el siguiente paso.
    1. Utilice los transportistas y los mangos (Figura 2C) para transferir hasta 12 muestras a la vez de una solución a otra (Figura 2D).
      Nota: Para reducir los volúmenes requeridos, use ml microtubos 2.0 para las etapas de pre-hibridación / hibridación (véase el paso 4.1) y las placas de 24 pocillos para las reacciones de tinción (PASO 6.2). Las reacciones de hibridación y de tinción se llevan a cabo en volúmenes de 1001; l y 400 l, respectivamente.

3. Preparación de embriones para la hibridación

  1. Recoger, dechorionate, corregir y devitellinize embriones utilizando procedimientos estándar 14,18. Los embriones preparados se almacenan habitualmente en metanol a -20 ° C.
  2. Transferencia de embriones que se utilizarán para la hibridación in situ a TA y se distribuyen en los insertos de una placa de 12 pocillos con 2 ml lleno de metanol por pocillo.
  3. Rehidratar embriones a través de una serie de metanol disminuyendo a RT. Incubar los embriones cada vez por 3 min en: (i) 75% de metanol en 1x PBS (ii) 50% de metanol en 1x PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% de metanol en 1x PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% de Tween-20.
  4. Pre-fijar los embriones en paraformaldehído al 4% en PBS 1x durante 20 min a RT.
  5. Retire el fijador por 4 lavados durante 3 min en 1x PBS, 0,1% de Tween-20 a TA. Mientras tanto descongelar y preparar soluciones de trabajo de glicina proteinasa K y.
  6. Embriones permeabilizar en proteinasa K fresco (10 g / ml a 50 mg / ml) en 1X PBS, 0,1% de Tween-20 durante 3 min a RT.
    Nota: El tratamiento de proteinasa K es equilibrada con la fuerza de fijación del embrión. Por ejemplo, si se omite la etapa de pre-fijación (3.4), proteinasa K tratamiento más suave se puede aplicar.
  7. Detener la reacción por dos enjuagues 1 min en 2 mg / ml de glicina en 1x PBS, 0,1% de Tween-20 a TA.
  8. Post-fijar los embriones en paraformaldehído al 4% en PBS 1x durante 20 min a RT.
  9. Posteriormente, retire fijador paraformaldehído por lavado cuatro veces durante 3 min en 1X PBS, 0,1% de Tween-20 a TA.
  10. Embriones después de la fijada Transferencia de pre-hibridación buffer. Embriones de las tiendas en tampón de pre-hibridación a -20 ° C o directamente proceder con la hibridación de las sondas.

4. hibridación de sondas

  1. Transferencia de embriones almacenados a -20 ° C en tampón de pre-hibridación a RT. Distribuir embriones en tampón de pre-hibridación en microtub 2,0 mles.
  2. Durante 30 min a un mínimo, pre-hibridan muestras de embriones a los 65 ° C en tampón de pre-hibridación.
    Nota: Para pre-hibridación y la hibridación pasos se utiliza un baño de agua. Durante la pre-hibridación hay tiempo para preparar la mezcla de la sonda mediante la combinación de hasta tres sondas de ARN antisentido, cada uno específico para un transcrito de gen diferente y marcada con un hapteno diferente.
  3. Para obtener la mezcla de sondas, añadir cantidades juntas apropiadas (por lo general entre 1 l a 6 l) de cada antisentido sonda deseada original de hapteno marcado con RNA en tampón de hibridación 100 l (50% vol / vol de formamida desionizada, 5x SSC, 50 mg / ml sal de sodio de heparina, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml de ARN torula, 5% en peso / vol de dextrano sulfato).
    Nota: La adición de sulfato de dextrano es opcional.
  4. Desnaturalizar la mezcla de sondas de ARN antisentido en un bloque de calor a 80 ° C durante 5 min. Posteriormente transferir la mezcla de sonda desnaturalizada directamente a 65 ° C.
  5. Eliminar la mayor parte de la pre-hibridacióntampón de las muestras de embriones y añadir la mezcla de sonda desnaturalizada.
  6. Deje que las muestras de embriones se hibridan a la sonda mezcla O / N a 65 ° C.
    Nota: Las temperaturas oscilan entre 55 ° C y 65 ° C se utilizan habitualmente para la hibridación, pre y post-hibridación pasos. La hibridación a 65 ° C proporciona condiciones más estrictas y se recomienda en caso de problemas de fondo al utilizar temperaturas más bajas. Si no hay problemas de fondo, hibridación a 55 ° C se recomienda, que proporciona la ventaja de una mayor intensidad de la señal y la mejora de la integridad del embrión.
  7. A la mañana siguiente, primero transferir las soluciones de lavado rigurosidad a 65 ° C, para asegurarse de que se calientan a la temperatura correcta en el tiempo.
  8. Transferencia de la hibridación de la sonda con la mezcla de los embriones de los microtubos de 2,0 ml en insertos de una placa de 12 pocillos que contenía 2 ml de tampón de lavado de hibridación precalentada (50% de formamida en 2 x SSC, 0,1% de Tween-20). Coloque la placa de 12 pocillos que contiene el emmuestras bryo en un horno y se incuban durante 20 minutos a 65 ° C.
  9. Muestras de embriones Transferencia a 2 ml de tampón nuevo lavado de hibridación y se incuban durante 20 minutos a 65 ° C. Repita este paso una vez más.
  10. Eliminar el exceso de sonda por 20 min lavados a 65 ° C, una vez en 2 x SSC, 0,1% de Tween-20 y tres veces en 0,2 x SSC, 0,1% de Tween-20.
  11. Transferir las muestras de embrión a 1x PBS, 0,1% de Tween-20 a TA.
  12. Incubar los embriones en tampón de bloqueo (8% de suero de ovejas en 1x PBS, 0,1% de Tween-20) durante al menos 30 min a TA.

5. Detección de anticuerpos de sondas marcadas con Hapteno

Nota: En contraste con la hibridación simultánea de los tres sondas marcadas de forma diferente, cada sonda se detecta uno tras otro en rondas separadas de incubación de anticuerpos y la tinción. Por lo tanto, en cada ronda de detección sólo se utiliza un anticuerpo (ya sea anti-digoxigenina-AP o anti-fluoresceína-AP o anti-biotina-AP).

  1. Elija entre PASO5.1.1 a 5.1.3 y proceder con la preparación de la dilución de anticuerpo apropiado de acuerdo con la etiqueta hapteno que se va a detectar.
    Nota: Para la detección secuencial de las sondas marcadas de forma diferente, otro anti-hapteno-anticuerpo se aplica en cada ciclo de detección.
    1. Para la detección de una sonda marcada con fluoresceína diluido anti-fluoresceína-AP conjuga 1: 4000 en tampón de bloqueo.
    2. Para la detección de una sonda marcada con digoxigenina diluir anti-digoxigenina-AP conjuga 1: 4000 en tampón de bloqueo.
    3. Para la detección de una sonda marcada con biotina preparar una solución de conjugado anti-biotina-AP en una dilución 1: 4000 en tampón de bloqueo.
  2. Incubar los embriones en la solución anti-hapteno-AP seleccionado durante 3 a 4 horas a RT. Alternativamente, incubar O / N a 4 ° C. No aplique los tres anticuerpos simultáneamente.
  3. Con el fin de eliminar el anticuerpo no unido lavar los embriones con 1x PBS, 0,1% de Tween-20 para 4 veces 15 min a TA.
  4. Para cambiar los sistemas tampón seh dos veces 15 min a TA en TNT (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, NaCl 0,1 M, 0,1% de Tween-20).

6. La tinción de fosfatasa alcalina cromogénico

  1. Con posterioridad a la detección de anticuerpos elegir entre PASO 6.1.1 a 6.1.4 y proceda con uno de los fosfatasa alcalina reacciones de tinción cromogénicos para obtener la señal de color deseado (ver Tabla 1). Para cada ronda de detección se aplica una reacción sustrato cromogénico diferente para resaltar cada patrón de transcripción en otro color.
    1. Fast Red tinción
      1. Lavar los embriones dos veces durante 15 min en TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% de Tween-20).
      2. Mientras que lavar los embriones, preparar la solución de tinción Rojo Rápido Del Fast Red TR / NAMP fosfatasa alcalina sustrato Tablets Set.
      3. Disolver una tableta de tampón desde el comprimido fijado en 1 ml de agua destilada y mezclar mediante agitación para obtener 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
      4. Caída de una tableta Red TR / NAMP rápido en el preparado Tris tampón y se disuelven por agitación para obtener la solución Fast Red tinción.
      5. Claro solución colorante Fast Red de partículas no disueltas a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras.
    2. Fast Blue Staining
      1. Lavar dos veces los embriones durante 15 min en tampón de tinción SB8.2 fresco (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, NaCl 0,1 M, 0,05 M MgCl 2, 0,1% de Tween-20).
      2. Mientras se lava embriones, preparar la solución de tinción con azul de Fast de 50 mg / ml Fast Blue BB (en DMF) y 50 mg / ml de fosfato de naftol (en DMSO) soluciones madre.
      3. Recién preparar una solución azul BB rápida en 0,5 mg / ml en SB8.2.
      4. Recién preparar una solución de fosfato de naftol separada en 0,5 mg / ml en SB8.2.
      5. Añadir gota a gota la solución de fosfato de naftol preparado en la solución de Fast Blue BB bajo mezcla constante con un vórtice. La concentración de trabajo final resultante es 0,25 mg / ml para ambos componentes del sustrato.
        Nota: Diferente Fast naftol phosp Azul /combinaciones de odio resultan en tonos de colores diferentes (ver Tabla 1).
    3. BCIP / NBT tinción
      1. Lavar dos veces los embriones durante 15 min en tampón de tinción SB9.5 fresco (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, NaCl 0,1 M, 0,05 M MgCl 2, 0,1% de Tween-20).
      2. Para una señal cromogénico purpleblue, recién preparar solución de tinción BCIP / NBT añadiendo 1 l levamisol, 3,5 l BCIP y 4,5 l de NBT por ml de tampón de tinción SB9.5 y mezclar bien.
    4. INT tinción
      1. Lavar los embriones dos veces durante 15 min en tampón de tinción SB9.5 fresco.
      2. Para una señal cromogénico yellowbrown, recién preparar solución de tinción INT añadiendo 1 l levamisol, 5 l Magenta-Phos y 5 l INT por ml de tampón de tinción SB9.5 y mezclar bien.
        Nota: Como alternativa, utilice 7,5 l / ml BCIP / INT solución colorante lista para su uso.
  2. Para las muestras de embriones de transferencia de reacción de tincióna una placa de 24 pocillos. Incubar cada muestra en 400 l de la solución de tinción elegido en la oscuridad.
  3. Monitorear ocasionalmente señal desarrollo bajo un microscopio estereoscópico. Detener la reacción de tinción cuando se obtiene la intensidad de la señal deseada y antes de que se observó significativa la señal de fondo.
  4. Para detener la reacción cromogénico, transferir embriones teñidos en insertos de una placa de 12 pocillos que contenía 2 ml por pocillo TNT. Enjuague los embriones teñidos dos veces en TNT.
  5. Lavar los embriones dos veces durante 10 minutos en 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 a temperatura ambiente para eliminar el sustrato residual.

7. Anticuerpo Desmontaje / fosfatasa alcalina inactivación

  1. Eliminar el anticuerpo e inactivar la fosfatasa alcalina por incubación en 2 ml de solución de paro pH bajo (0,1 M glicina-HCl pH 2,2, 0,1% de Tween-20) durante 10 min a RT.
  2. Enjuague durante 1 min con 2 ml de 1 × PBS, 0,1% de Tween-20 a TA.
  3. Lavar 3 veces durante 3 min en 1 × PBS, 0,1% de Tween-20 a TA.

8. Segunda Ronda de Detección

  1. Para detectar el patrón de distribución de un segundo transcrito de proceder con la detección de anticuerpos de sondas de hapteno marcado con (STEP 5.1 a 5.4) usando conjugados anticuerpo-AP dirigidos en contra de la segunda etiqueta hapteno.
  2. Realizar tinción cromogénico de fosfatasa alcalina (PASO 6/1 a 6/5) aplicar una combinación de sustrato que produce un color que contraste con el utilizado en la primera ronda de detección (para los colores disponibles véase la Tabla 1).
  3. Retire segundo conjugado anticuerpo-AP como se describe en el PASO 7.1 a 7.3.

9. Tercera Ronda de Detección

  1. Con el fin de detectar el patrón de distribución de tercera transcripción, proceder a la detección de anticuerpos de sondas de hapteno marcado con (PASO 5.1 a 5.4) usando anticuerpo-AP conjugados específicos para la tercera etiqueta hapteno.
  2. Realizar tinción cromogénico de fosfatasa alcalina (PASO 6/1 a 6/5) aplicar una combinación de sustrato que no era apnavegaban en las rondas anteriores de detección. Elige una reacción cromogénico que produce un color precipitar fáciles de distinguir de los de las dos rondas anteriores de detección (por la elección del color ver Tabla 1).

10. Montaje e Imagen

  1. Transferencia de embriones teñidos correctamente a 30% de glicerol en PBS y se incuba hasta que los embriones están completamente empapadas en la solución de glicerol. Ellos están bien equilibrados cuando se hunden hasta el fondo.
  2. Embriones de traslado hasta el 70% de glicerol en H 2 O y permiten equilibrar a temperatura ambiente. Los embriones teñidos se pueden almacenar en 70% de glicerol a 4 ° C.
  3. Para el montaje, la pipeta manchado embriones en una gota de glicerol 70% sobre un portaobjetos y sin tocar los espaciadores pegados a la corredera (Figura 3). Aplicar la hoja de la cubierta.
  4. Ver embriones montada bajo un microscopio de disección. Mueva la hoja de la cubierta aplicada, de modo que los embriones giran a la orientación deseada.
  5. Observar adecuadamenteembriones orientados en alta resolución (20X, 40X objetivos) bajo un microscopio compuesto con diferenciales óptica Interferencia contraste.
  6. Captura imágenes con una cámara digital en color y ahorrar en el dispositivo de almacenamiento digital.

Resultados

El protocolo descrito permite para la visualización simultánea de múltiples patrones de transcripción en diferentes colores. MC-Wish proporciona la ventaja de comparar directamente los patrones de expresión de genes diferentes en el mismo embrión. A modo de ejemplo, los patrones de expresión de espiráculos vacías (ems) 19, fushi tarazu (Zona Franca) 20 y descuidado emparejado 1 (SLP1) 21 se comparan directamente en Drosophila blastoderm melanogaster embriones de etapa y se visualizan en una variedad de tonos de color (Figura 4) .

Diferentes combinaciones de sustrato de AP están disponibles para obtener un panel de contraste precipitados de color (Tabla 1). El precipitado de color rojo producido por Fast Red y el precipitado de color púrpura producido por BCIP / NBT puede distinguirse fácilmente y por lo tanto se utilizan más comúnmente en los experimentos de dos colores (Figura 4A). Sin embargo, la mancha BCIP / NBT puede convertirse rápidamente en un color bastante oscuro, de modo que el color Fast Red se disfraza en caso de co-distribución parcial de transcripciones. Por lo tanto, la aplicación de Fast Blue puede ser una ventaja, que genera azules, productos verdes y violetas en combinación con NAMP, NAGP y NABP, respectivamente (Tabla 1). La combinación de azul rápido con NAMP da un color azul claro que es fácilmente discernible del producto Fast Red en los dominios de expresión adyacentes o superpuestos como se muestra aquí por ems y sitios de expresión SLP1 visualizados en rojo y azul, respectivamente (Figura 4B). La combinación Fast Blue NAGP proporciona un fuerte contraste similar a la mancha Fast Red, de modo que el dominio ems verde es claramente distintiva desde el sitio de expresión SLP1 rojo (Figura 4C). Sin embargo, si el ccsme y sitios de expresión SLP1 se dèprotegidos por Fast Blue NABP y Fast Red, respectivamente, el violeta resultante y precipitados de color rojo son menos discernible (Figura 4D). Como se mencionó anteriormente, Fast Red y Fast Blue NAGP son fáciles de distinguir como lo demuestra SLP1 y expresión Zona Franca en rojo y verde, respectivamente (Figura 4D).

MagentaPhos en combinación con INT produce un precipitado amarillo, que se utiliza para revelar la expresión segmentaria de FTZ (Figura 4C, E). El precipitado de color amarillo genera buen contraste con los sustratos de color azul como se ejemplifica por la detección de SLP1 y Zona Franca con Fast Blue NAMP y MAG / INT, respectivamente (Figura 4E). Sin embargo, el precipitado de color amarillo es menos fácil discernible a partir del producto Fast Red. El dominio de expresión manchada amarilla de ems puede ser apenas disti nguished de la expresión rostral del SLP1 muestra en rojo (Figura 4F). Por lo tanto, la combinación de sustratos de color tiene que ser cuidadosamente elegido para cada experimento.

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Figura 1. Diagrama de flujo de MC-Wish. Para la visualización multicolor de tres patrones de transcripción únicas, elegir entre diferentes conjugados anticuerpo-AP y combinaciones de sustrato de color en cada ciclo de detección. Abreviaturas: AP, fosfatasa alcalina; BIO, biotina; DIG, digoxigenina; FLUO, fluoresceína. Para otras abreviaturas ver leyendas a la figura 4 y en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Los insertos como portadores embrión. (A) Insertos instalados en la parte inferior con las membranas de poliéster de 15 mm de diámetro y 74 micras tamaño de malla se utilizan como portadores de embrión de Drosophila. (B) Los insertos se montan en placas de 12 pocillos, que funcionan como bandejas de depósito para las diferentes soluciones. (C) los transportistas y las manijas disponibles permiten el procesamiento de (D) 12 inserciones / muestras de embriones a la vez. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Montaje de embriones teñidos. Los embriones se montan en una gota de 70% de glicerol entre dos pilas de cubreobjetos, que funcionan como espaciadores. Movimiento suave de la aplicaciónmentido gran cubreobjetos ayuda a girar los embriones montados en la orientación deseada para la observación y fotografía. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Visualización multicolor de las transcripciones de ARNm en embriones de Drosophila. Ejemplos de experimentos MC-Wish en embriones de Drosophila se muestran de vistas laterales. Los patrones de expresión de ARNm de espiráculos vacías (EMS), fushi tarazu (ZLC) y descuidado emparejado 1 (SLP1) se visualizan por diferentes combinaciones de color de sustrato de AP, que se indican en cada panel. Las transcripciones fueron detectados por (A) Zona Franca FLUO y ems DIG, ( B) SLP1 FLUO, ems BIO y DIG Zona Franca, (C) ems BIO, SLP1 FLUO y DIG Zona Franca, (D) PERFIL Zona Franca, SLP1 FLUO y ems DIG, (E) SLP1 FLUO, ems DIG, y Zona Franca BIO, (F) PERFIL Zona Franca, SLP1 FLUO y ems DIG marcado sondas. Las sondas hapteno marcado fueron immunohistochemically detectado uno tras otro en las órdenes mencionadas. Abreviaturas: FB Azul rápida; FR, tableta Fast Red. Para otras abreviaturas ver leyendas a la figura 1 y en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Combinación de sustrato Añadir a 1 ml de tampón de AP Concentration [g / ml] Tampón AP Color Sensibilidad de la señal
BCIP NBT 3,5 l 4,5 l 175 337.5 SB9.5 morado +++
INT MAG 5 l 5 l 250 250 SB9.5 amarillo +
Solución madre BCIP / INT 7.5 l 250 250 SB9.5 amarillo +
Fast Blue NAMP 5 l 5 l 250 250 SB8.2 azul ++
Fast Blue NABP 20 l 10 l 1000 500 SB8.2 violeta ++
Fast Blue NAGP 10 l 10 l 500 500 TT8.2 verde +
Fast Red NAMP 1 comprimido 1000 400 TT8.2 rojo ++

Tabla 1. combinaciones de sustrato Abreviaturas: +++, fuerte;. ++, Medio; +, Débil NBT, cloruro de 4-nitro-azul de tetrazolio; BCIP, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato; INT, 2- (4-yodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-tetrazolio cloruro; MAG, Magenta-Phos, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-fosfato, NAMP, naftol-AS-MX-fosfato; NABP, naftol-AS-BI-fosfato; NAGP, naftol-AS-GR-fosfato; SB9.5, tampón de tinción a pH 9,5; SB8.2, tampón de tinción a pH 8,2; TT8.2, tampón Tris-Tween a un pH de 8,2.

Discusión

La hibridación in situ (ISH) con sondas de ácido nucleico marcadas radiactivamente se utiliza a menudo para detectar la localización del ARN en secciones de tejido. El método ISH radiactivo, sin embargo, es mucho tiempo, menos sensible, y no permite que la apreciación de los patrones de distribución de la transcripción completa en enteros monturas. En contraste, el método MC-Wish aquí descrita permite la comparación directa de múltiples dominios de expresión génica en colores contrastantes dentro de embriones intactos. MC-DESEO tiene la ventaja de que el contexto histológico es evidente de inmediato y se visualizó simplemente por microscopía de campo claro estándar. Esto proporciona la posibilidad de relacionar los dominios de expresión de genes topográficamente entre sí con gran precisión y definir sitios únicos y solapados de expresión de una manera rápida y fiable. Por otro lado, ISH fluorescente multiplexado (FISH) es más potente con respecto a la sensibilidad y la resolución y se utiliza de preferencia, si celular o incluso re sub-celularSe requiere solución de la detección de mRNA.

El amplio espectro de transcripciones que ha sido asignada por MC-Wish sugiere que virtualmente cualquier transcripción se puede analizar no sólo en embriones, sino también en los tejidos de larvas y adultos y en especies distintas de Drosophila. De hecho, el procedimiento descrito se detalla aquí por Drosophila, funciona de manera similar eficiente con embriones de pez cebra 11,16,22. Por otra parte, el método MC-DESEO puede adaptarse a una amplia variedad de invertebrados y vertebrados embriones y muestra de tejido.

Hapteno etiquetas y concentraciones de sonda

Utilizamos rutinariamente fluoresceína, digoxigenina, y biotina como etiquetas hapteno de sondas de ARN. Por otra parte, las sondas dinitrofenol marcado se pueden aplicar, que se han introducido en los experimentos de WISH de pez cebra 23-25. Sondas marcadas con fluoresceína muestran una menor sensibilidad en comparación con los otros hapteno-etiquetas, de modo que la fluoresceína se utiliza mejor fo la detección de abundantes transcripciones. Cada sonda recién transcrito se prueba primero en un solo experimento de WISH, donde se evalúa su rendimiento, ya sea usando BCIP / NBT o Fast Red como sustrato. Una concentración de la sonda se considera como óptimo cuando una señal fuerte sin desarrollo fondo se consigue en pocos minutos a horas.

Para asegurarse de que los dominios de expresión de interés se han detectado en toda su extensión por MC-Wish, es esencial para visualizar cada patrón de transcripción por una sola etiqueta experimentos desea usando la combinación de sustrato más sensible, BCIP / NBT. Esto asegura que los dominios de expresión débiles no se pasan por alto en el experimento multi-objetivo. Para compensar la menor sensibilidad de las otras combinaciones de sustrato que es esencial para el uso duplicado (a) triplicado concentraciones de sonda en comparación con la tinción estándar de BCIP / NBT.

Inactivación bajo pH

El paso de inactivación pH bajo puede conducir adesintegración parcial de los híbridos RNA sonda / sentido de ARNm de hapteno marcado antisentido resultantes en la detección de señal reducida en la segunda y tercera rondas de tinción. Para minimizar la pérdida de la sensibilidad, los pasos de inactivación son tan cortos como sea posible. Hemos experimentado que un tiempo de incubación de 10 min a pH bajo es suficiente para la eliminación de la AP-actividad. Los lavados rápidos posteriores en grandes volúmenes garantizan una rápida dilución de no consolidados conjugados anticuerpo-AP y prevenir la re-unión de las sondas haptenizadas. Procedimientos alternativos incluyen la fijación de paraformaldehído y la inactivación de calor. Sin embargo, algunos de los precipitados de color no son estables al calor y la fijación de paraformaldehído puede no ser suficiente para la inactivación completa de AP. Inactivación incompleta de la primera aplicada conjugado anticuerpo-AP puede conducir a la re-visualización del patrón de mRNA en la siguiente ronda de detección que lleva a la superposición de falso positivo en la expresión con la segunda especie de ARNm para ser detectado. Por lo tanto, en un experimento de control THe embriones se dividen en dos fracciones después de la inactivación de la primera aplicada conjugado anticuerpo-AP. El segundo conjugado de anticuerpo-AP se omite de la fracción de control y no debe producir una señal en la segunda reacción de color. Sin embargo, si la segunda reacción de color genera un patrón de distribución de señal correspondiente a la primera uno, entonces el procedimiento de inactivación no fue eficiente. En este caso, el tiempo de incubación en solución de bajo pH parada debe prolongarse para el siguiente experimento.

Órdenes de aplicación sustrato AP

Dado que la sensibilidad disminuye con cada ronda subsiguiente de detección, es recomendable para detectar mRNAs menos abundantes antes de la más abundantes transcripciones. Además, las combinaciones de sustrato Fast Blue Fast Red y son significativamente menos sensible que el BCIP purpleblue / NBT mancha, de modo que los colorantes se aplican preferiblemente Fast en la primera ronda de tinción para la detección de la transcripción expresado más fuerte. Esto también hcomo la ventaja de que la tinción BCIP / NBT posterior se puede controlar y se detuvo en el tiempo antes de la señal purpleblue pone demasiado oscura en relación con los colorantes Fast más ligeros. Así, en un experimento de dos de color estándar, primero la más fuerte de ARNm expresado es detectado por Fast Red y segunda la más débil por BCIP / NBT. Como alternativa a los colorantes Fast las combinaciones de sustrato INT amarillas pueden ser aplicadas, que sin embargo producen precipitados que se convierten difunden después de algún tiempo. Por lo tanto BCIP / INT se aplica exclusivamente en la última ronda de la tinción. En consecuencia, en un experimento de tres colores que utilizamos a menudo, una combinación de sustrato INT segundo BCIP / NBT (o Fast Blue) y tercero primera Fast Red. Tenga en cuenta que es recomendable para fotografiar embriones manchadas tan pronto como sea posible al aplicar INT.

Detección fluorescente de colorantes azoicos

Puede ser a veces difícil de reconocer patrones de expresión se superponen cuando un precipitado de color más oscuro está sombreado uno más ligero. Fo ejemplo, un fuerte desarrollo precipitado BCIP / NBT puede enmascarar las señales de colorante Fast más ligeros. Una forma de solucionar este problema es capturar imágenes inmediatamente después de cada mancha y eliminar el precipitado de color aplicada antes de la próxima ronda de detección. En este caso, colorante azoico soluble en alcohol (Fast Red) e INT precipitados se eliminan mediante lavados con etanol después de la primera y segunda rondas de detección, respectivamente, y la tinción de BCIP / NBT se aplica como el último sustrato AP-26. Otra posibilidad es tomar ventaja de las propiedades fluorescentes de los colorantes azoicos. Fast Red se puede visualizar utilizando el filtro de rodamina establece 27, mientras que Fast Blue se puede observar con filtros de rojo lejano 28,29. Comparación o de superposición de imágenes cromogénicos y fluorescentes pueden revelar el lugar de co-distribution.Using este enfoque, el desarrollo señal de BCIP / NBT tiene que ser detenido en el tiempo, de modo que no se haga demasiado densa y apagar la señal fluorescente del colorante azo producto de reacción.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a nuestros colegas por los plásmidos de ADNc para la generación de plantillas. El trabajo de los autores cuenta con el apoyo de la Fundación Sueca contra el Cáncer (CAN 2010/553), la Fundación Sueca para la Cooperación Internacional en Investigación y Educación Superior (IG2011-2042) y la Fundación Knut y Alice Wallenberg (KAW2012.0058).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agua desionizada, tratada con dietilpirocarbonato (DEPC)Thermo ScientificR0603
T7 ARN polimerasa Thermo ScientificEP0111
T3 ARN polimerasa Thermo ScientificEP0101
SP6 ARN polimerasa Thermo ScientificEP0131
Inhibidor de ARNasa RiboLock Thermo ScientificEO0381
DNasa I, libre de RNasa Thermo ScientificEN0521
NTP SetThermo ScientificR0481
Digoxigenina-11-UTPRoche11209256910
Fluoresceína-12-UTPRoche11427857910
Biotina-16-UTPRoche11388908910
Acetato de amonioApplichemA2936
Etanol, Absoluto Merck100983
hidrogenofosfato disódicoScharlauSO0339
Dihidrógeno fosfato sódicoScharlauSO0331
Tween-20SigmaP1379
ParaformaldehídoSigmaP6148
MetanolSigma32213
Proteinasa KThermo ScientificEO0491
GlycineSigmaG7126
Ácido clorhídrico Merck100317
citrato trisódicoScharlauSO0200
formamida desionizadaApplichemA2156
ARN tipo VI de levadura torulaSigmaR6625
Sal sódica de heparinaApplichemA3004
Sulfato de dextrano sal sódicaSigmaD6001
Suero de ovejaSigmaS2263
Fragmentos de Fab anti-biotina-AP para ovejas Roche11426303001
Ovejas anti-digoxigenina-fosfatasa alcalina (AP) Fragmentos Fab Roche11093274910
Ovejas antifluoresceína-AP Fragmentos Fab Roche11426303001
Conejo anticuerpo anti-dinitrofenil-APLaboratorios de vectoresMB-3100
Tris-(hidroximetil)-aminometanoScharlauTR04241000
Cloruro de magnesioScharlauMA0036
Cloruro de sodioScharlauSO0227
LevamisolSigmaL9756
N,N-DimetilformamidaSigmaD4551
DimetilsulfóxidoApplichemA3006
Fast Red set de comprimidosSigmaF4648
Sal BB azul rápidaSigmaF3378
Naftol-AS-MX-fosfatoSigmaN5000
Nafthol-AS-GR-fosfatoSigmaN3625
Naftol-AS-BI-fosfatoSigmaN2250
Magenta-PhosBiosynthB7550
INTSigmaI8377
NBTApliquemA1243
BCIPApplichemA1117
Solución INT/BCIPRoche11681460001
Glicerol 86-88%ScharlauGL0023
Incubadora universalMemmertBE400
Baño de aguaMemmertWB14
Bloque de calorGrantQBT2
Insertos Netwell  15 mmCorning3477
Kit de soporte Netwell 15 mmCorning3520
Placa de cultivo celular de 12 pocillosCorning3513
Placa de 24 pocillosSarstedt83.3922
Microtubo de 1,5 mlSarstedt72.690.001
Microtubo de 2,0 mlSarstedt72.691

Referencias

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