El glaucoma se caracteriza por daño a las células ganglionares de la retina. La inducción de glaucoma en modelos animales puede proporcionar información sobre el estudio de esta enfermedad. Aquí, describimos un procedimiento que induce la pérdida de RGCs en un modelo de rata in vivo y demostramos la preparación de retinas de montaje completo para el análisis.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Glaucoma de inducir en un Procedimiento
En este artículo
Resumen
Resumen
El glaucoma es una enfermedad del sistema nervioso central que afecta a las células ganglionares de la retina (CGR). RGC axones que forman el nervio óptico llevan la información visual al cerebro para su percepción visual. El daño a la CGR y sus axones conduce a la pérdida de la visión y / o ceguera. Aunque la causa específica del glaucoma es desconocido, el principal factor de riesgo para la enfermedad es una presión intraocular elevada. procedimientos de inducción de glaucoma en modelos animales son una herramienta valiosa para los investigadores que estudian el mecanismo de la muerte de CGR. Dicha información puede conducir al desarrollo de tratamientos neuroprotectores eficaces que podrían ayudar en la prevención de la pérdida de la visión. El protocolo en este documento se describe un método para inducir el glaucoma - al igual que las condiciones en un modelo de rata in vivo en 50 l de 2 M de solución salina hipertónica se inyecta en el plexo venoso epiescleral. El blanqueo de los vasos indica inyección con éxito. Este procedimiento provoca la pérdida de la CGR para simular el glaucoma. Un mes siguienteinyección, los animales son sacrificados y los ojos son removidos. A continuación, la córnea, el cristalino y vítreo se retiran para hacer una ojera. La retina se desprende entonces de la parte posterior del ojo y inmovilizó en placas de Sylgard con agujas de cactus. En este punto, las neuronas de la retina se pueden teñir para su análisis. Los resultados de esta práctica de laboratorio muestran que aproximadamente el 25% de la CGR se pierden dentro de un mes del procedimiento en comparación con los controles internos. Este procedimiento permite el análisis cuantitativo de la muerte de células ganglionares de la retina en un modelo de rata in vivo glaucoma.
Introducción
El glaucoma es un grupo de enfermedades oculares que afectan a las neuronas de la retina, en concreto, las células ganglionares de la retina 1-2. Los axones de estas células convergen para convertirse en el nervio óptico lleva la información visual al cerebro donde se percibe la visión. El daño a la CGR y sus axones, por tanto, causa defectos visuales.
Las características principales asociados con trastornos de glaucoma son RGC degeneración y la muerte, aumento de la presión intraocular (IOP), y cupping disco óptico y atrofia. Estas características conducen a la pérdida del campo visual o completa, la ceguera irreversible. En l....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos que utilizan los sujetos animales han estado de acuerdo con las normas del Instituto de Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Western Michigan.
1. Los animales
- Usar ratas macho y hembra de 3 meses de edad en este estudio.
- Mantener a los animales en un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad, con acceso libre a comida y agua.
2. Preparación de KAX Cocktail para anestesia animales
- Disolver 50 mg de xilazina (20 mg / ml) en 5 ml de ketamina (100 mg / ml) con 1 ml de acepromazina (10 mg / ml) y 3 ml de agua destilada. Mezcl....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Esta sección ilustra los componentes del aparato y el procedimiento utilizado para inducir condiciones glaucoma-como en una rata modelo de glaucoma in vivo. Mostramos las herramientas individuales y el equipo utilizado para realizar una inyección de solución salina hipertónica que provoca un aumento en la presión intraocular. Mostramos la inyección en el plexo venoso epiescleral con su característico efecto de blanqueo y el aspecto turbio de la cámara anterior que resulta. Tambi.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo describe un método para inducir condiciones de glaucoma-como en un modelo de rata in vivo. Este procedimiento utiliza una inyección de solución salina hipertónica para inducir la formación de cicatrices en la malla trabecular 29, 32. El desarrollo de tejido de cicatriz ocluye el flujo de salida de humor acuoso que aumenta la presión en la cámara anterior. Con una disminución de flujo y la presión se acumulan, la lente está suspendido por ligamentos elásticos empuja de nuevo en la cámar.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen intereses contradictorios o contrapuestos que divulgar.
Agradecimientos
C. Linn cuenta con el apoyo de una subvención de los NIH (NIH NEI EY022795).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Clorhidrato de xilacina, mínimo 99% | Sigma, Life Science | X1251-1G | |
| Inyección de clorhidrato de ketamina, USP, 100 mg / ml y nbsp; | Putney, Inc | NDC 26637-411-01 | Frasco de 10 ml |
| Maleato de acepromazina, 10 mg/ml | Phoenix Pharmaceutical, Inc | NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 | Frasco de 50 ml |
| Frasco de suero, 10 ml | VWR | 16171319 | vidrio de borosilicato |
| jeringa de insulina de 1 ml | Aguja VWR | BD329410 | 28 G |
| Cloruro de sodio | Sigma | S7653 | Solución de 2 m |
| Extractor de microelectrodos | Narishige Group | PP-830 | |
| Tubo de borosilicato estándar pulido pesado y de pared delgada | Sutter Instruments | B150-86-10HP | sin filamento, 0,86 mm |
| Aguja de jeringa Microfil para el llenado de micropipetas | World Precision Instruments, Inc | MF28G | |
| Aguja Luer-Lock de calibre 18 | Fisher Scientific | 1130421 | Aguja de jeringa |
| Tubo de polietileno flexible | Fisher Scientific | 22046941 | 0,034 pulgadas de diámetro, aproximadamente 10 pulgadas |
| Solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína, USP, 0.5% | Akorn, Inc | NDC 17478-263-12 | 15 ml frasco estéril |
| Tijeras curvas | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Microscopio | Leica | StereoZoom 4 | |
| Fine Science Tools | 1310912 ungüento | borde curvo | |
| Mango | Fisher Scientific NC0664481 | ||
| Fine Science Tools | 10004-13 | ||
| Hoja de bisturí #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Placa de Petri Desechable de 60 mm x 15 mm | VWR | ||
| Solución salina tamponada con fosfato 10x Concentrado | Sigma, Ciencias de la Vida | P7059-1L | 1x dilución |
| Tijeras de resorte | Herramientas de ciencia fina | 15009-08 | |
| Pinzas (2), Dumont # 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Pipetas de transferencia de 3 ml, polietileno, no estériles | BD Biosciences | 357524 o 52947-948 | graduaciones de 1 y 2 ml |
| 35 mm x 10 mm Placa de Petri de fácil agarre | BD Biosciences | 351008 | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Agujas | |||
| Paraformaldehído | EMD Millipore | PX0055-3 o 818715.0100 | Hecho en una solución al 4% |
| Tritón X-100 | Sigma | T9284-100 ml | Hecho en una solución al 1% y al 0,1% |
| Suero fetal bovino | Atlanta Biological | S11150 | 500 ml |
| Ratón Purificado Anti-Rata CD90/ratón CD90.1 | BD Pharmingen | Cat 554892 | dilución 1:300 |
| Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón | Tecnologías de la Vida | A11005 | dilución 1:300 |
| Portaobjetos de microscopio | Corning | 2948-75x25 | |
| Glicerol | Sigma | G5516-100 ml | 50% glicerol a 50% PBS, en peso |
| Cubreobjetos | Corning | 2975-225 | Espesor 1 22 x 50 mm |
| Microscopio confocal | Nikon | C2 Eclipse Ti |
Referencias
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
- Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
