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Artículo de método

La producción de norovirus dominios que sobresale en humanos

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DOI:

10.3791/53845

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19 de abril de 2016

 ,  ,  , 
1Schaller Research Group, University of Heidelberg and the German Cancer Research Center, 2Department of Infectious Diseases, Virology, University of Heidelberg

En este artículo

Resumen

A continuación, se describe un método para expresar y purificar el norovirus alta calidad que sobresale dominios (P) en E. coli para su uso en estudios de cristalografía de rayos X. Este método se puede aplicar a otros dominios calicivirus P, así como las proteínas no estructurales, es decir., La proteína viral unida al genoma (VPg), proteasa, y ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp).

Resumen

La cápside norovirus se compone de una sola proteína estructural importante, denominado VP1. VP1 se subdivide en un (S) dominio shell y un dominio sobresaliente (P). El dominio S forma un andamio contigua alrededor del ARN viral, mientras que las formas de dominio P picos virales en el dominio S y contiene determinantes para la antigenicidad y las interacciones de la célula huésped. El dominio P se une estructuras de hidratos de carbono, es decir., Antígenos del grupo histo-sanguíneo, los cuales se cree que son importantes para las infecciones por norovirus. En este protocolo, se describe un método para la producción de alta calidad dominios norovirus P con altos rendimientos. Estas proteínas se pueden utilizar para la cristalografía de rayos X y ELISA con el fin de estudiar la antigenicidad y la de la célula huésped interacciones.

El dominio P se clona en primer lugar en un vector de expresión y luego se expresa en bacterias. La proteína se purificó utilizando tres pasos que implican inmovilizados cromatografía de afinidad de iones metálicos y cromatografía de exclusión por tamaño. Enprincipio, es posible clonar, expresar, purificar y cristalizar proteínas en menos de cuatro semanas, lo que hace este protocolo un sistema rápido para el análisis de las cepas de norovirus de reciente aparición.

Introducción

Norovirus humanos son la principal causa de gastroenteritis aguda en todo el mundo 1. Estos virus pertenecen a la familia Caliciviridae, de los cuales hay al menos cinco géneros, incluyendo norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, y Nebovirus. A pesar de su alto impacto en el sistema de salud y la distribución amplia, el estudio de los norovirus humanos se ve obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo celular robusto. Hasta la fecha, no existen vacunas aprobadas o estrategias antivirales disponibles.

La principal proteína de la cápside norovirus, denominado VP1, se puede dividir en un (S) dominio shell y un (P) que sobresale de dominio 2. El dominio P está conectado al dominio S por una región bisagra flexible (H). El dominio S forma un andamio alrededor del RNA viral, mientras que el dominio P forma la parte más exterior de la cápside viral. El dominio P se ensambla en dímeros biológicamente relevantes cuando se expresa en bacterias. El Pdimer interactúa con estructuras de hidratos de carbono, denominados antígenos del grupo histo-sangre (HBGAs) que están presentes como antígenos solubles en la saliva y que se encuentra en ciertas células huésped 3. El dominio de interacción-HBGA P se piensa que es importante para la infección 4. De hecho, un informe reciente reveló la importancia de HBGAs sintéticas o HBGA-expresión de bacterias para la infección por norovirus humana in vitro 5.

Los estudios actuales con respecto a la unión de las células huésped de norovirus se realizan principalmente con partículas similares a virus (VLP) que se pueden expresar en células de insectos o con dominios P recombinantes expresados ​​en Escherichia coli (E. coli). Para entender las interacciones de dominio-HBGA P a resolución atómica, estructuras complejas P dominio-HBGA se pueden resolver utilizando cristalografía de rayos X. Aquí, se describe un protocolo para la expresión de dominio P y purificación que permite la producción de dominio P en gran cantidad y de la calidad que se utilizará para crystall de rayos Xgrafía. Por otra parte, este método se puede aplicar para otros dominios calicivirus P y las proteínas no estructurales.

El dominio P está optimizado codón para E. expresión coli y se clonó en un vector de transferencia estándar. El dominio P se vuelve a clonar en un vector de expresión que codifica una polihistidina etiqueta (His) y una proteína de unión a manosa (MBP) que son seguidos por un sitio de escisión de la proteasa. El Su--P MBP proteína de fusión de dominio se expresa en E. coli, seguido por tres etapas de purificación. La proteína de fusión de dominio MBP-His-P se purificó usando cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC). A continuación, la proteína de fusión se escinde con rinovirus humano (HRV) proteasa -3C y el dominio P se separa de la MBP-His por una etapa adicional de purificación IMAC. Por último, el dominio P se purificó usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). El dominio P purificada se puede usar entonces para la cristalografía de rayos X. La selección de las condiciones de cristalización de proteínas es performó con los kits de detección disponibles comercialmente utilizando diferentes concentraciones de proteína de dominio P. El crecimiento de cristales se observa y se optimizan las condiciones más prometedores.

Con los métodos descritos aquí, es posible pasar de gen a la proteína a la estructura en menos de cuatro semanas. Por lo tanto, nuestro método de expresión P dominio, purificación y cristalización es adecuado para estudiar la interacción norovirus huésped a nivel molecular y proporcionar datos importantes para ayudar en la detección de diseño y de drogas hasta a la fecha de la vacuna.

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Protocolo

1. P dominio Clonación

  1. Determinar la región de dominio de código P por la alineación de secuencias de cepas de norovirus (por ejemplo, la cepa GII.10, GenBank: AF504671, AP-ID: 3ONU) 6. Además, eliminar la región flexible en el extremo C-terminal del dominio P (Figura 2A). Codon-optimizar el ADN para E. coli expresión e incluyen BamHI (C-terminal) sitios de restricción (N-terminal) y NotI con el fin de sub-clon de la P dominio región codificante en el vector de expresión pMalc2x 6,7.
    Nota: La región de codificación de dominio P se optimiza y se sintetiza por un servicio comercial. El dominio P región codificante (inserto) es de aproximadamente 1 kb de longitud y entregado en un vector de transferencia estándar.
  2. Digerir 2 g del vector de transferencia con cada 1 BamHI mu l (20.000 U / ml) y NotI (10.000 U / ml) enzimas de restricción durante 1 hora a 37 ° C con el fabricante suministra buffers.
  3. Separar el inserto digerido en un gel de agarosa al 1%durante 20 minutos a 135 V y purificar el ADN de inserto a partir del gel utilizando un kit comercial.
  4. Preparar el vector de expresión pMalc2x por digestión de 2 g de este vector con cada 1 l BamHI (20000 U / ml) y NotI (10.000 U / ml) enzimas de restricción durante 1 hora a 37 ° C. Se purifica el vector de un gel de agarosa como se describe anteriormente (1.3). Nota: Las dos muestras (1.2 y 1.4) se pueden almacenar a -20 ° C.
  5. Ligar el inserto purificado en el vector pMalc2x digerido en los sitios de restricción BamHI y NotI con 1 l de ligasa T4-ADN (400.000 U / ml) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) (Figura 2B y 2C). Utilice al menos 20 ng del vector pMalc2x y un vector: relación de inserción de 1: 3 (peso molecular). La mezcla de ligación es normalmente ~ 20 l.
  6. Transformar 2 l de la mezcla de ligación en E. 50 l químicamente competente coli DH5a células bacterianas utilizando un protocolo de transformación estándar (10 min en hielo, de choque térmico 45 seg a 42 ° C) y crecer en 600medio SOC l durante 1 hora a 37 ° C. Centrifugar las células transformadas durante 3 minutos a 1.000 xg, desechar el sobrenadante, y resuspender el precipitado en 30 l de medio SOC.
    1. Placa de la mezcla de transformación en placas de LB-agar, que contiene 100 mg de ampicilina / ml para la selección, y crecer durante la noche a 37 ° C. Seleccionar al menos cinco colonias.
  7. Para cada una de las cinco colonias, inocular 2-3 ml de cultivo de medio LB suplementado con 50 g / ml de ampicilina (LB-amp) y crecer mediante agitación durante la noche a 160 rpm a 37 ° C.
  8. Extraer los plásmidos de cultivo de una noche usando un kit comercial. Verificar la presencia del dominio P inserto por secuenciación con un cebador directo pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') y cebador inverso (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

Expresión 2. P dominio

  1. Transformar 1 l (150 ng / l - 400 ng / l) de la codificación de vector pMalc2x para la Su MBP--P dominioproteína de fusión en 50 l de E. competente células de E. coli BL21 utilizando un protocolo de transformación estándar (10 min en hielo, choque térmico de 45 segundos a 42 ° C) y crecen en 600 l medio SOC durante 1 hora a 37 ° C. Subcultivo en 120 ml de LB-amp durante la noche a 160 rpm y 37 ° C.
  2. Inocular nueve litros (por ejemplo, 6 x 5 L frascos con 1,5 l de medio de cada uno) de LB-amp con el subcultivo (1: 100). Cultivar las células con agitación a 160 rpm y 37 ° C hasta que la DO 600 alcanza 0,4-0,6. Posteriormente, bajar la temperatura a 22 ° C durante ~ 1 hora y luego inducir la expresión de la proteína con 0,66 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 8. Cultivar las células durante la noche a 22 ° C (~ 18 h).
    Nota: La temperatura puede ser variada, pero se recomienda utilizar 22 ° C o inferior.
  3. Recoger las células por centrifugación (10.543 xg, 15 min, 4 ° C). Descartar el sobrenadante y congelar el sedimento celular a -20 ° C.

3. 1ª Etapa de purificación y de escisión de proteasa

  1. Preparar los tampones que se utilizan durante las etapas de purificación de proteínas a partir de soluciones de reserva para garantizar la reproducibilidad y la estabilidad de los experimentos. Preparar cuatro tampones diferentes para la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC), cada uno que contiene una concentración diferente de imidazol (10 mM, 20 mM, 50 mM y 250 mM). Para la SEC, preparar un tampón de filtración en gel (GFB) con una concentración de sal más alta, pero sin imidazol. Use agua desionizada y filtrar todos los tampones antes de usarlo con un tamaño de poro de 0,45 micras.
    Nota: Para un esquema detallado de preparación búfer, consulte la Tabla 1.
  2. Descongelar el pellet de células a partir del cultivo 9 litros y se disuelven en 150 ml de PBS a 4 ° C. Sonicar la suspensión celular tres veces para 2 min (potencia de 130 W, la amplitud 20%, frecuencia de pulsación 50%) para romper las células. Mantener la suspensión de células en hielo durante la sonicación.
  3. Centrifuge la suspensión celular se sonicó (43.667 xg, 30 min, 4 ° C) para separar los residuos celulares del sobrenadante que contiene proteína expresada. Recoger el sobrenadante y desechar el sedimento.
  4. Lavar y equilibrar 10 ml (= 1 volumen de columna [CV]) suspensión de Níquel (Ni) perlas de agarosa -NTA con tampón de imidazol 10 mM en una columna de cromatografía. Añadir las perlas de Ni equilibradas al sobrenadante de la etapa 3.3 con adición expresa la proteína de fusión de dominio MBP-His-P y se incuba durante 30 min a 4 ° C con rotación lenta.
  5. Después de la incubación, se aplican a toda la mezcla de grano-proteína Ni a una columna de cromatografía. Lavar la columna lentamente con cada 5 CV de 10 mM, 20 mM, y 50 tampones de imidazol mM, empezando con 10 mM, a continuación, 20 mM y último 50 mM (Figura 3A).
  6. Eluir la proteína de fusión de dominio MBP-His-P usando tampón de imidazol 250 mM (Figura 3A). Durante la elución, compruebe el 280 nm OD para verificar la elución de la proteína de fusión (el aumento de OD 280nm). Continuar la elución hasta que la OD 280 nm se reduce a ~ 0,1. Lavar las perlas con cantidades excesivas de tampón de imidazol 250 mM (por lo menos 10 CV), seguidos por al menos 10 CV de 10 mM de tampón de imidazol. Guardar los granos para la segunda etapa de purificación (sección 4).
  7. Verificar la presencia de la proteína de fusión de dominio MBP-His-P con SDS-PAGE usando un gel 12% SDS-poliacrilamida (10 x 8 cm) 9 (Figura 3A). Realizar electroforesis en gel a 45 A y 200 V durante 45 min.
  8. Concentrado (por ejemplo, utilizando un concentrador comercial) la proteína de fusión de dominio MBP-His-P se eluyó a una concentración final de ~ 3 mg / ml. Escindir el dominio de fusión MBP-His-P con proteasa HRV-3C durante la diálisis contra 2 L de 10 mM de tampón de imidazol (~ 1: 100) durante la noche a 4 ° C (Figura 3A). Dependiendo del volumen final de proteína concentrada, lleve a cabo la diálisis en un casete de diálisis o un tubo de diálisis.
    Nota: La cantidad de HRV-proteasa 3C de proteínasescisión se calcula de acuerdo con la actividad de la proteasa específica (2 U / l, 1 U es suficiente para escindir 100 g de proteína) y la cantidad de proteína de fusión eluida que varía en el nivel de expresión y puede ser estimada a partir del resultado de SDS-PAGE (3,7 ).

4. 2ª Etapa de purificación

  1. Equilibrar las cuentas de Ni desde el paso 3.6 en tampón imidazol 10 mM.
  2. Incubar la proteína dializada a partir del paso 3.7 (que contiene el dominio escindido P, proteína MBP, y HRV-proteasa) con los de Ni-cuentas equilibradas (4.1) durante 30 minutos a 4 ° C con rotación lenta.
  3. Aplicar la mezcla de Ni-talón a una columna y se recoge el flujo a través (dominio P escindido) (Figura 3B). Medir la concentración de proteína, ya que viene de la columna hasta que la OD 280 nm alcanza ~ 0,1.
    Nota: La MBP-His deberían mantenerse unida a las perlas de Ni (Figura 3B).
  4. Verificar la presencia del dominio P escindido utilizando SDS-PAGE con un 1Gel 2% como se describió anteriormente (Figura 3B). Se concentra el dominio P eluyó a ~ 3 mg / ml y se dializa durante la noche a 4 ° C contra GFB para la posterior purificación SEC.

5. 3ª Etapa de purificación

  1. Las bombas de lavado y tuberías del sistema de purificación por HPLC y pre-equilibrar la SEC-columna (ver Lista de Materiales) con GFB.
  2. Inyectar el dominio P a la columna a una velocidad de flujo de 1 ml / min utilizando un Superloop (hasta 12 ml) o bucle (hasta 3 ml), dependiendo del volumen de la muestra concentrada. Una vez finalizada la inyección, aumentar la velocidad de flujo a 2,5 ml / min.
  3. A medida que aumenta de DO y el dominio P sale de la columna, recoger fracciones de 1,5 ml. Compruebe fracciones utilizando SDS-PAGE con un gel de 12% (Figura 4A y 4B). Piscina sólo las fracciones más puras y se concentra para ~ 3 mg / ml y ~ 8 mg / ml.
    Nota: Después de ~ 110 ml (volumen vacío) la mayoría de las impurezas se eluyeron de una columna SEC con un volumen de 320 ml cama. losdominio P generalmente se eluye como un dímero. La elución de tiempo / volumen del dominio P dímero depende de la calidad preparativa (pg) de la columna de SEC.

6. La cristalización del P dominio

  1. Utilice el dominio P a ~ 3 mg / ml y 8 mg / ml para el cribado inicial de cristalización. Preparar al menos 100 l de dominio P por concentración, a las pantallas iniciales con 384 condiciones de detección disponibles comercialmente. Efectuar pruebas de detección a 18 ° C en un formato de placa de 96 pocillos, en el que el depósito contiene 100 l de solución madre y una gota se compone de 0,2 l solución madre y 0,2 l de proteína.
  2. Repetir y optimizar las condiciones de cristalización de éxito. Por lo tanto, utilizar placas de 15 pocillos que contienen 3 filas. Establecer la primera fila con una solución madre 100%, la segunda fila con solución al 90% la madre y el 10% de agua, y la tercera fila con una solución madre de 80% y 20% de agua. Utilice un tamaño de gota de 2 l (solución madre de proteína + 1 l 1 l) y 50081; l de solución madre como un volumen del depósito.
  3. Utilice condiciones de cristal optimizados para co-cristalizar el dominio P con ligandos. Preparar placas como se describe en el apartado 6.2. En lugar de 2 l tamaño de gota, configurar gotas que contienen 1 l solución madre, 1 l de proteína, y 1 l de ligando a una concentración de 1 mg / ml.
  4. Reunir conjuntos de datos de monocristales utilizando radiación sincrotrón. Realizar la sustitución molecular utilizando estructuras de dominio P publicados con una alta similitud de secuencia inicial como modelo de búsqueda 6,10-13.
    Nota: La presencia de un ligando se muestra como blob no-modelado de la densidad electrónica.

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Resultados

El esquema del protocolo descrito se representa en la Figura 1. El protocolo cubre 6 partes principales que incluyen la clonación del gen diana, expresión, una purificación de tres etapas, y la cristalización. La Figura 2 ilustra el diseño de la construcción de expresión (CE) y características del vector de expresión pMalc2x. La secuencia del sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pMalc2x muestra de restricción y de la proteasa sitios de escisión. ...

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Discusión

A continuación, se describe un protocolo para la expresión y purificación de dominios P ​​norovirus en alta calidad y en cantidad. Los norovirus no están bien estudiadas y son continuamente necesitan datos estructurales. A nuestro entender, la producción de dominio P utilizando otros protocolos (por ejemplo, dominios GST-etiquetados P) ha sido problemático, hasta el momento, y suficientes datos estructurales sobre la interacción huésped norovirus se han perdido. Con el método descrito aquí, hemos contribuido re...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La financiación de este estudio fue proporcionada por la fundación CHS. Reconocemos la plataforma de cristalización de proteínas dentro del clúster de excelencia CellNetworks de la Universidad de Heidelberg para el cribado de cristales y la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón para la provisión de instalaciones de radiación sincrotrón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dominio P DNALife TechnologiesGeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vectorA petición
BamHINew England BiolabsR0136L
NotINew England BiolabsR0189L
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
S.O.C. MediumLife Technologies15544-034
Econo-Columna de Cromatografía Bio-Rad73725122,5 x 10 cm, posible de usar otros tamaños
Ni-NTA AgarosaQiagen30210
Vivaspin 20GE Healthcarevarioscorte de 10 kDa, 30 kDa y 50 kDa utilizado
Eficiencia de subclonación DH5 y alfa; Células competentesLife Technologies18265-017
One Shot BL21(DE3) Químicamente competente E. coliLife TechnologiesC6000-03
HRV 3C ProteasaMerck Millipore71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PGGE Healthcare28-9893-34Columna SEC
JCSG Core suitesQiagenvarios4 cribas con cada 96 pocillos Hidratos de
carbono DextraLaboratories, Reino Unidovariosproductos del grupo sanguíneo

Referencias

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