La producción de norovirus dominios que sobresale en humanos<em&gt; E. coli</em&gt; Para la cristalografía de rayos X

Resumen

A continuación, se describe un método para expresar y purificar el norovirus alta calidad que sobresale dominios (P) en E. coli para su uso en estudios de cristalografía de rayos X. Este método se puede aplicar a otros dominios calicivirus P, así como las proteínas no estructurales, es decir., La proteína viral unida al genoma (VPg), proteasa, y ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp).

Resumen

La cápside norovirus se compone de una sola proteína estructural importante, denominado VP1. VP1 se subdivide en un (S) dominio shell y un dominio sobresaliente (P). El dominio S forma un andamio contigua alrededor del ARN viral, mientras que las formas de dominio P picos virales en el dominio S y contiene determinantes para la antigenicidad y las interacciones de la célula huésped. El dominio P se une estructuras de hidratos de carbono, es decir., Antígenos del grupo histo-sanguíneo, los cuales se cree que son importantes para las infecciones por norovirus. En este protocolo, se describe un método para la producción de alta calidad dominios norovirus P con altos rendimientos. Estas proteínas se pueden utilizar para la cristalografía de rayos X y ELISA con el fin de estudiar la antigenicidad y la de la célula huésped interacciones.

El dominio P se clona en primer lugar en un vector de expresión y luego se expresa en bacterias. La proteína se purificó utilizando tres pasos que implican inmovilizados cromatografía de afinidad de iones metálicos y cromatografía de exclusión por tamaño. Enprincipio, es posible clonar, expresar, purificar y cristalizar proteínas en menos de cuatro semanas, lo que hace este protocolo un sistema rápido para el análisis de las cepas de norovirus de reciente aparición.

Introducción

Norovirus humanos son la principal causa de gastroenteritis aguda en todo el mundo ^1. Estos virus pertenecen a la familia Caliciviridae, de los cuales hay al menos cinco géneros, incluyendo norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, y Nebovirus. A pesar de su alto impacto en el sistema de salud y la distribución amplia, el estudio de los norovirus humanos se ve obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo celular robusto. Hasta la fecha, no existen vacunas aprobadas o estrategias antivirales disponibles.

La principal proteína de la cápside norovirus, denominado VP1, ....

Protocolo

1. P dominio Clonación

1. Determinar la región de dominio de código P por la alineación de secuencias de cepas de norovirus (por ejemplo, la cepa GII.10, GenBank: AF504671, AP-ID: 3ONU) ^6. Además, eliminar la región flexible en el extremo C-terminal del dominio P (Figura 2A). Codon-optimizar el ADN para E. coli expresión e incluyen BamHI (C-terminal) sitios de restricción (N-terminal) y NotI con el fin de sub-clon de la P dominio región codificante en el vector de expresión pMalc2x ^6,7.
   Nota: La región de codificación de dominio P se optimiza y se sintetiza por un servicio comercial. El dominio P....

Resultados

El esquema del protocolo descrito se representa en la Figura 1. El protocolo cubre 6 partes principales que incluyen la clonación del gen diana, expresión, una purificación de tres etapas, y la cristalización. La Figura 2 ilustra el diseño de la construcción de expresión (CE) y características del vector de expresión pMalc2x. La secuencia del sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pMalc2x muestra de restricción y de la proteasa sitios de escisión. .......

Discusión

A continuación, se describe un protocolo para la expresión y purificación de dominios P ​​norovirus en alta calidad y en cantidad. Los norovirus no están bien estudiadas y son continuamente necesitan datos estructurales. A nuestro entender, la producción de dominio P utilizando otros protocolos (por ejemplo, dominios GST-etiquetados P) ha sido problemático, hasta el momento, y suficientes datos estructurales sobre la interacción huésped norovirus se han perdido. Con el método descrito aquí, hemos contribuido re.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dominio P DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	A petición
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Columna de Cromatografía Bio-Rad		7372512	2,5 x 10 cm, posible de usar otros tamaños
Ni-NTA Agarosa	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	varios	corte de 10 kDa, 30 kDa y 50 kDa utilizado
Eficiencia de subclonación DH5 y alfa; Células competentes	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Químicamente competente E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Proteasa	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	Columna SEC
JCSG Core suites	Qiagen	varios	4 cribas con cada 96 pocillos Hidratos de
carbono Dextra	Laboratories, Reino Unido	varios	productos del grupo sanguíneo