La recolección selectiva de leucocitos marginando-pulmonar

Resumen

Los leucocitos pulmonares marginadores exhiben características únicas y funciones inmunológicas distintas en comparación con otras poblaciones de leucocitos. En este trabajo describimos la recolección selectiva de esta subpoblación de leucocitos pulmonares, mediante perfusión forzada de los pulmones en ratas y ratones. Los leucocitos pulmonares marginadores parecen ser fundamentales para determinar la susceptibilidad a las enfermedades transmitidas por la sangre y relacionadas con los pulmones.

Resumen

Los leucocitos pulmonares marginadores (MP) son leucocitos que se adhieren al endotelio interno de los capilares pulmonares. Se demostró que los leucocitos MP exhiben una composición y características únicas en comparación con los leucocitos de otros compartimentos inmunitarios. La evidencia sugiere una mayor citotoxicidad de las células asesinas naturales y un perfil proinflamatorio y antiinflamatorio distinto de la población de leucocitos MP en comparación con los inmunocitos circulantes o esplénicos. El método presentado en este trabajo permite la recolección selectiva de leucocitos MP por perfusión forzada de los pulmones en ratones o ratas. A diferencia de otros métodos utilizados para extraer leucocitos pulmonares, como la molienda de tejidos y la degradación biológica, este método produce exclusivamente leucocitos de los capilares pulmonares, no contaminados con células parenquimatosas, intersticiales y broncoalveolares. Además, la técnica de perfusión preserva mejor la integridad y el entorno fisiológico de los leucocitos MP, sin inducir respuestas fisiológicas debidas al procesamiento de los tejidos. Esta población única de leucocitos MP está estratégicamente ubicada para identificar y reaccionar ante las células circulantes anormales, ya que todas las células malignas circulantes y las células infectadas se detienen mientras pasan a través de los capilares pulmonares, interactuando físicamente con las células endoteliales y los leucocitos residentes. Por lo tanto, la recolección selectiva de leucocitos MP y su estudio en diversas condiciones pueden avanzar en nuestra comprensión de su importancia biológica y clínica, específicamente con respecto al control de las células aberrantes circulantes y las enfermedades relacionadas con los pulmones.

Introducción

Los leucocitos se adhieren a los capilares de los pulmones (es decir, marginando-pulmonar (MP) leucocitos) ¹ se mostraron para exhibir composición de leucocitos distinto y actividad única en comparación con los leucocitos de otros compartimentos inmunes (por ejemplo, la circulación, el bazo, la médula ósea) ^{2- 4.} Por ejemplo, exhiben MP-leucocitos superior natural killer (NK) citotoxicidad frente a varias células tumorales, en comparación con circulantes y esplénicas células NK, así como los niveles diferenciados de ARN mensajero (ARNm) y aumento de la secreción de citoquinas pro- y anti-inflamatorias. La composición de células también se diferencia de leucocitos circulantes como MP-leucocitos tienen una relación más alta de la inmunidad innata / adaptativa en comparación con los leucocitos circulantes (50% vs. 30%, respectivamente). El objetivo del método presentado en este documento es para permitir la recolección selectiva de MP-leucocitos, con el fin de estudiar este compartimiento inmune importante y única (población de células), y para elucidate el impacto de las diversas manipulaciones (por ejemplo, la activación inmune) en estas células específicas.

Para comprender el significado de esta población única, es importante tener en cuenta que el sistema inmune puede controlar las células tumorales, las micrometástasis, y la enfermedad residual circula a través de las funciones in vivo de la inmunidad mediada por células (CMI). Esta capacidad es evidente a pesar del fracaso precedente del sistema inmunológico para controlar el tumor primario, y apoyado por amplia en pruebas in vivo en pacientes con cáncer y en modelos animales ^5. Es importante destacar que estos resultados son a menudo incompatibles con los estudios in vitro y ex vivo, que informan que la mayoría de las células tumorales autólogas son resistentes a la citotoxicidad mediante la circulación de leucocitos en muestras de sangre de seres humanos y animales (medido por ensayos de citotoxicidad) ^6,7. Esta discrepancia puede ser atribuida a la existencia in vivo de poblaciones de leucocitos distintos, tales como los antesmencionada población de leucocitos MP, y concretamente su subpoblación de células NK activadas ^3. De hecho, las células tumorales (singénicos MADB106), que se encontraron ser resistente a la circulación y leucocitos esplénicos, se demostró que la lisis por las células NK ^MP-3,8. Por lo tanto, las células supuestamente 'NK-resistentes' MADB106 que hacen metástasis a los pulmones de fischer344 ratas (F344) están controlados por las células MP-NK, pero no por las células NK esplénicas, que comúnmente se estudian dada su facilidad de acceso o circulante.

Purificado y activos MP-leucocitos son inaccesibles a través de los métodos de cosecha estándar de leucocitos de los pulmones, que se basan en la molienda tejido pulmonar o la degradación biológica ^9. Nuestro enfoque tiene dos ventajas importantes en comparación con los enfoques de procesamiento de tejidos. En primer lugar, el enfoque de perfusión cosecha selectivamente MP-leucocitos, separándolas de otras células que se originan en el parénquima pulmonar, intersticial, y compar bronco-alveolartments. En segundo lugar, la técnica de perfusión mejor conserva la integridad y el medio fisiológico de MP-leucocitos, a diferencia de la molienda y el procesamiento biológico se acerca que dañan las células, alterar su morfología, e inducen la producción y liberación de diversos factores que modulan la actividad inmune y específicamente suprimen NK ¹⁰ citotoxicidad.

Los pulmones son un órgano principal objetivo para la metástasis del cáncer y para diversas enfermedades infecciosas. Todas las células malignas circulantes y células infectadas pasan a través de los capilares pulmonares, donde tienen que deformarse e interactuar con las células endoteliales de los capilares y leucocitos residentes. En estas condiciones, las células circulantes pueden ser fácilmente dirigidos por residentes MP-leucocitos. Por tanto, parece biológicamente ventajoso tener leucocitos activados en este compartimiento inmune, y es importante para estudiar este MP-población única en diferentes entornos biológicos, experimentales y clínicos. Es digno de notar que syactivación stemic inmune por varias-respuesta modificadores biológicos (por ejemplo, ácido poliinosínico-policitidílico (poli I: C) o oligodesoxinucleótidos tipo-C CpG (CpG-C ODN)) han demostrado para activar MP-leucocitos más de leucocitos circulantes ^{3, 8,11.}

Protocolo

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Tel-Aviv.

1. Protocolo de rata

1. Preparativos
   1. Organizar 2 mariposa 21 G agujas. Opcionalmente, se preparan 2 mariposa 21 G-agujas romas filo presentando el borde afilado de la aguja.
   2. Esterilizar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de tijeras, pinzas afiladas embotado, pinzas hemostáticas, pinzas de dientes de tejidos esterilizados en autoclave a 121 ° C durante al menos 30 minutos en el establecimiento de la gravedad (en seco).
   3. Preparar heparinizada PBS (30 unidades / ml) mediante la adición de 30 unidades de heparina por ml de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS). Utilizar a temperatura ambiente. 35 ml es el volumen mínimo necesario por animal.
   4. Transmitir heparinizada PBS en las líneas de bombas peristálticas y las agujas de mariposa para evitar burbujas de aire.
2. La perfusión de los pulmones y la recolección de MP-leucocitos
   1. La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Confirmar la eutanasia por el cese de monitoreo de respiración.
   2. Tras el cese de la respiración, de inmediato abrir las cavidades peritoneales y el pecho con las tijeras y pinzas estériles diente-tejido. Realizar una incisión abdominal en la línea media a lo largo del abdomen hasta el proceso xifoides.
   3. Levantar el esternón utilizando los fórceps, el corte con cautela la caja torácica en ambos lados, sin perforar cualquier órgano interno o grandes vasos sanguíneos. Sujetar una pinza hemostática en el esternón, y rostral plegar la caja torácica para exponer el complejo cardiopulmonar.
   4. Insertar una aguja de mariposa en el ventrículo derecho del corazón, y dentro de aproximadamente un minuto recoger el máximo volumen de sangre en una jeringa (~ 6 ml de un animal de 250 g).
   5. Abrazadera de la vena cava con una pinza hemostática para evitar la perfusión hacia atrás del hígado (véase la discusión).
   6. Mantenga la aguja mariposa dentro del ventrículo derecho, mientras que la sustitución de la jeringa que contiene la sangre con el tubo de salida de la peristaltic bomba.
   7. Inserte una segunda aguja de mariposa conectada a una jeringa de recolección 5 ml en el ventrículo izquierdo, evitando la penetración del septo interventricular.
   8. Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente 5 ml / min y recoger suavemente en la jeringa los primeros mililitros de líquido de perfusión que están contaminadas con sangre. Continuar hasta que el color se vuelve líquido de perfusión de oscuro a rojo pálido. (Descartar el perfuste contaminada con sangre).
   9. Sin cese de la bomba peristáltica, sustituir rápidamente la jeringa de recolección 5 ml con una jeringa de 20 ml cosecha y recoger 20 ml de líquido de perfusión pulmonar que emplea una mayor velocidad de perfusión (hasta 7 ml / min). Monitorear continuamente el flujo de perfundido en la jeringa de recogida, evitando al mismo tiempo la formación de vacío.
   10. Cese el flujo de la bomba peristáltica.
3. Extracción leucocitos
   1. Centrifugar el perfundido durante 10 minutos a 400 x g.
   2. Aspirar el líquido.
   3. Añadir 10 ml de PBS o medio, de centrifugación a 400 xg durante 10 min, y aspirar el líquido. Repita este paso dos veces. El uso de PBS o medio depende de la consiguiente uso de la muestra.
   4. Añadir 20 ml de PBS o medio, de centrifugación a 400 xg durante 10 min, y aspirar el líquido.
   5. Reconstituir las células a la concentración deseada, con base en el uso de la muestra (FACS, PCR, etc.).

2. Protocolo de ratón

1. Preparativos
   1. Organizar 2 mariposa 25 G agujas. Opcionalmente, se preparan 2 mariposa 25 G-agujas romas filo presentando el borde afilado de la aguja.
   2. Esterilizar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de tijeras, pinzas afiladas embotado, pinzas hemostáticas, pinzas de dientes de tejidos esterilizados en autoclave a 121 ° C durante al menos 30 minutos en el establecimiento de la gravedad (en seco).
   3. Preparar heparinizada PBS (30 unidades / ml) mediante la adición de 30 unidades de heparina por ml de solución de 1x PBS. Utilizar a temperatura ambiente. 25 ml es el volumen mínimo necesario por animal.
   4. Stream heparinizada PBS en las líneas de bombas peristálticas y las agujas de mariposa para evitar burbujas de aire.
2. La perfusión de los pulmones y la recolección de MP-leucocitos
   1. La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Confirmar la eutanasia por el cese de monitoreo de respiración.
   2. Tras el cese de la respiración, de inmediato abrir las cavidades peritoneales y el pecho con las tijeras y pinzas estériles diente-tejido. Realizar una incisión abdominal en la línea media a lo largo del abdomen hasta el proceso xifoides.
   3. Levantar el esternón utilizando los fórceps, el corte con cautela la caja torácica en ambos lados, sin perforar cualquier órgano interno o grandes vasos sanguíneos. Sujetar una pinza hemostática en el esternón, y rostral plegar la caja torácica para exponer el complejo cardiopulmonar.
   4. Abrazadera de la vena cava con una pinza hemostática para evitar la perfusión hacia atrás del hígado (véase la discusión).
   5. Insertar una aguja de mariposa conectada a la tubería de salida de la bomba peristáltica a la derecha ventricle del corazón, y una segunda aguja de mariposa conectada a una jeringa de recolección 2 ml en el ventrículo izquierdo del corazón, avoidingpenetration del tabique interventricular.
   6. Encienda la bomba a una velocidad de aproximadamente 2 ml / min y recoger los primeros ml de líquido de perfusión contaminada con sangre en la jeringa de recolección hasta que el líquido de perfusión se convierte de oscuro a rojo pálido (Descartar el perfuste contaminada con sangre).
   7. Sin cese de la bomba peristáltica, sustituir rápidamente la jeringa de recolección 2 ml con una jeringa de 10 ml de cosecha y recoger 10 ml de líquido de perfusión pulmonar que emplea una mayor velocidad de perfusión (hasta 4 ml / min). Monitorear continuamente el flujo de perfundido en la jeringa de recogida, evitando al mismo tiempo la formación de vacío.
   8. Cese el flujo de la bomba peristáltica.
3. Extracción leucocitos
   1. Centrifugar el perfundido durante 10 minutos a 400 x g.
   2. Aspirar el líquido.
   3. Añadir 10 ml de PBS o medio de centrifugación a 400,xg durante 10 min, y aspirar el líquido. Repita este paso tres veces. El uso de PBS o medio depende de la consiguiente uso de la muestra.
   4. Añadir 10 ml de PBS o medio, de centrifugación a 400 xg durante 10 min, y aspirar el líquido.
   5. Reconstituir las células a la concentración deseada, con base en el uso de la muestra (FACS, PCR, etc.).

Resultados

La exposición MP-compartimiento de una composición de leucocitos subconjunto diferente en comparación con los leucocitos circulantes. Utilizando el análisis de citometría de flujo, se identificaron y se cuantificaron las subpoblaciones de leucocitos para caracterizar la composición de ambos leucocitos circulantes y MP. Granulocitos y linfocitos fueron identificados en base a primero y la cara dispersa. Dentro de los linfocitos, se identificaron NKRP-1 células ^brillantes como l...

Discusión

El método presentado en este documento permite la recogida selectiva y el estudio de la población única de MP-leucocitos. En comparación con los leucocitos esplénicos o circulante, la población MP se caracteriza por una composición distinta de subpoblaciones de leucocitos, los niveles de activación más altos, mayor liberación de varias citoquinas, y más altos niveles de ARNm de pro- y citocinas antiinflamatorias ^2,3. Específicamente, hemos demostrado que las células MP-NK son más citotóxicos que las células N...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Autoclud Bomba
Aguja de mariposa	OMG		26G
Aguja de mariposa	OMG		21G*3/4"
Jeringa	Pic solución		1 ml
Jeringa	Pic solución		2,5 ml
Jeringa	Pic solución		5 ml
Jeringa	Pic solución		10 ml
Jeringa	Pic solución		25 ml
Pinzas
			Tijeras
hemostático
(sin conservantes)	Sigma Aldrich

peristálticade borde romo Pinza de tejido Heparina sódica mucosa porcina