Artículo de método

Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

DOI:

10.3791/53851

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16 de marzo de 2016

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1Laboratory of Biomolecular Sequence and Structure Analysis for Health, Fondazione Bruno Kessler, 2Institute of Biophysics, CNR Unit at Trento

En este artículo

Resumen

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Aunque la estructura de los ribosomas ha sido ampliamente caracterizada, la organización de los polisomas aún está poco estudiada. Para superar esta falta de conocimiento, presentamos aquí un protocolo de preparación detallado para obtener imágenes precisas de polisomas de mamíferos mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) en aire y líquido.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maquinaria de traducción, es decir, el polisomas o polyribosome, es uno de los mecanismos citoplásmicos más grandes y más complejos en las células. Polisomas, formadas por los ribosomas, ARNm, varias proteínas y ARN no codificantes, representan plataformas donde los controles se llevan a cabo de traslación integrado. Sin embargo, mientras que el ribosoma se ha estudiado ampliamente, la organización de polisomas todavía falta comprensión global. Por lo tanto se requiere un gran esfuerzo con el fin de dilucidar organización polisomas y cualquier nuevo mecanismo de control de la traducción que puede ser embebido. Microscopía de fuerza atómica (AFM) es un tipo de microscopía de barrido de la sonda que permite la adquisición de imágenes en 3D con una resolución de escala nanométrica. En comparación con técnicas de microscopía electrónica (EM), una de las principales ventajas de AFM es que se puede adquirir miles de imágenes tanto en el aire y en solución, lo que permite que la muestra se mantendrá en condiciones fisiológicas cerca sin necesidad de tinción y la fijación de proprocedimientos. Aquí, se describe un protocolo detallado para la purificación exacta de polisomas de cerebro de ratón y su deposición sobre sustratos de mica. Este protocolo permite obtener imágenes polisomas en el aire y líquido con AFM y su reconstrucción como objetos tridimensionales. Complementario al crio-microscopía electrónica (crio-ME), el método propuesto puede ser utilizado convenientemente para el análisis sistemático de polisomas y el estudio de su organización.

Introducción

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La síntesis de proteínas es el proceso que consume más energía en las células de 1,2. Por lo tanto, no es sorprendente que las abundancias de proteínas son controlados principalmente en la traslación en lugar de 3,4,5 nivel transcripcional. El polisomas es el componente macromolecular fundamental que convierte la información de ARNm en lecturas proteicos funcionales. Polisomas son hasta ahora reconocidos como complejos macromoleculares donde varios controles de traslación convergen 6-13. A pesar de cientos de estudios sobre la estructura del ribosoma 14- 16, los conocimientos moleculares detallados sobre la dinámica de la traducción y la topología de polisomas ha detectado un interés limitado. Como consecuencia de ello, la organización del complejo de ribonucleoproteína polisomico nativo y su efecto potencial sobre la traducción son todavía temas bien oscuros. Polisomas pueden ocultar las organizaciones ordenados y funcionales aún desconocidos, potencialmente reflejando lo nucleosomas y contro epigenéticals han representado para el campo de la transcripción. De hecho, la investigación de este intrigante hipótesis requiere de estudios adicionales y nuevos enfoques técnicos. En esta línea, las técnicas estructurales y microscopía de fuerza atómica pueden colaborar fructíferamente para desentrañar nuevos mecanismos para el control de la expresión génica, de manera similar a lo que se logró para el nucleosoma 17,18.

Desde el descubrimiento del ribosoma 14-16, su estructura se ha caracterizado ampliamente en procariotas, levaduras 19,20 21 y más recientemente en humano 22, proporcionando la descripción molecular de los mecanismos en la base de la síntesis de proteínas. Polisomas se registran inicialmente en la membrana del retículo endoplasmático, formando organizaciones geométricas 2D típicos 14. Como se ha mencionado antes, polisomas asamblea no ha sido objeto de interés constante a medida que la estructura del ribosoma. En el pasado, se han estudiado polisomas esencialmente por trtécnicas ansmission EM-basa. Sólo recientemente, las técnicas de crio-EM permitieron la reconstrucción 3D de polisomas purificados a partir de sistemas de traducción in vitro 23-26, lisados ​​celulares humanos en 27 o 28 células. Estas técnicas ofrecen información más precisa acerca de la organización de ribosomas ribosoma en polisomas 23, 26-28 y una descripción molecular preliminar de las superficies de contacto de los ribosomas adyacentes en polisomas germen de trigo 24. Por lo tanto, la tomografía crio-EM permite la divulgación de las interacciones de ribosomas ribosoma con detalle molecular, pero está cargado por una extensa post-procesamiento y análisis de reconstrucción que requiere recursos computacionales pesadas para el manejo de datos. Por otra parte, para obtener el detalle molecular de las interacciones de ribosomas ribosoma, se requiere un mapa de carreteras de resuelto de los ribosomas, y este tipo de ribosoma de referencia está disponible sólo para unas pocas especies. Es importante destacar que, tomografía crio-EM no es capaz de detectar RNA libre. Therefel mineral, se requieren nuevas técnicas para entender completamente la organización de la maquinaria de traducción.

Al lado de la crio-EM, AFM ha sido también empleado como una herramienta útil para obtener imágenes directas de polisomas en eucariotas inferiores 29-33 y los seres humanos 27. En comparación con EM, AFM no requiere la fijación de la muestra o el etiquetado. Además, las mediciones se pueden llevar a cabo en condiciones fisiológicas cerca de y con la posibilidad única de identificar claramente los dos ribosomas y cadenas de ARN desnudos 27. Obtención de imágenes de polisomas individuales se puede realizar de forma relativamente rápida, obteniendo miles de imágenes en nano-resolución con poco esfuerzo post-procesamiento en comparación con la extensa y pesada de post-procesamiento y análisis de la reconstrucción requerida por microscopía de crio-EM. En consecuencia, AFM manejo y análisis de datos no necesita caras estaciones de trabajo y potencia de computación de alto. Como tal, esta técnica recoge información sobre formas polysomal, características morfológicas (por ejemplo,altura, longitud y anchura), las densidades de ribosomas, la presencia de ARN libre y el número de ribosomas por polisomas 27 con un rendimiento más alto que la crio-EM. De tal manera, AFM representa un enfoque poderoso y complementario a las técnicas de EM para retratar polisomas 27.

Aquí presentamos una tubería completa de purificación para el análisis de datos en la que se aplica a la imagen de AFM y analizar polisomas cerebro de ratón. El protocolo propuesto se centra en cuestiones de purificación y en la deposición precisa de polisomas sobre sustratos de mica que se utilizan para obtener imágenes de AFM. Además del análisis de partícula convencional que puede ser fácilmente realizó con el software común usado por la comunidad AFM, un plugin de ImageJ 34, llamado RiboPick, se presenta para contar el número de ribosomas por polisomas 27, 35.

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Protocolo

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Las prácticas utilizadas para obtener los tejidos de ratón fueron aprobados por el Cuerpo de Protección de los Animales (OPBA) de la Universidad de Trento (Italia), el protocolo no. 04-2015, Decreto Legislativo de acuerdo con el Artículo 31 no. 26/2014. Todos los ratones se mantuvieron en el Centro Organismo modelo del Centro de Biología Integrativa (CIBIO), Universidad de Trento, Italia.

Precaución: Para evitar cualquier degradación del ARN de las muestras, preparar todos los tampones que usan agua tratada con DEPC para reducir al mínimo la contaminación de ARNasa.

1. Preparación de Polisomas de todo el cerebro

  1. La recopilación de los tejidos del cerebro (15 min)
    1. La eutanasia de tipo salvaje cepa de ratón C57BL / 6 con asfixia de CO 2 durante 5 min 36. Diseccionar cuidadosamente el cerebro fuera del cráneo 36, colocar el tejido en un tubo de 1,5 ml e inmediatamente colocarlo en nitrógeno líquido. Almacenar a -80 ° C hasta su uso.
  2. Preparación de lisado (30 min)
    1. Pulverizar todo el tejido cerebral usandoun mortero bajo nitrógeno líquido.
    2. Transferir aproximadamente 25 mg de polvo a un tubo de microcentrífuga de frío e inmediatamente (para evitar la descongelación del tejido pulverizado) añadir 0,8 ml de tampón de lisis (véase la Tabla 1) e interrumpir la célula pipeteando arriba y abajo 25 veces rápidamente.
    3. Centrifugar el tubo a 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C para sedimentar los restos celulares.
    4. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y mantener el tubo en hielo durante 15 min.
    5. Centrifugar el tubo a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar los núcleos y mitocondrias.
    6. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    7. Almacenar el sobrenadante a -80 ° C durante un máximo de 6 meses o utilizarlo inmediatamente.
  3. preparación gradiente de sacarosa y centrifugación (2 horas y 30 minutos)
    1. Lavado de tubos de ultracentrífuga extensamente con RNasa libre de agua (agua tratada diethylpyrocarbonate (DEPC-agua) o comercial) unad 3% de H 2 O 2 / DEPC disolución de H 2 O.
    2. Poner los tubos en hielo y añadir 5,5 ml de solución de sacarosa al 50% frío en la parte inferior de cada tubo (ver Tabla 1 para soluciones de sacarosa). añadir con cuidado la gota solución de sacarosa al 15% a gota, manteniéndose cerca de la interfase con el fin de preservar una interfase nítida, hasta que el tubo esté completamente lleno. Cuando el tubo está completamente lleno, cerrarlo con un tapón de goma para evitar la formación de burbujas de aire.
    3. En una habitación fría suavemente fijar los tubos en posición horizontal y mantenerlo en esta posición durante 2 horas. Después de este tiempo, lentamente enderece los tubos de nuevo en la posición vertical y ponerlos en hielo. Los gradientes son ahora listo para ser utilizado. Alternativamente, preparar el gradiente de sacarosa 15 a 50% usando un gradiente convencional anterior.
    4. En un cuarto frío retirar con cuidado 1,0 ml de la parte superior de la pendiente y la superposición con la caída de sacarosa a gota con el lisado citosólica (es decir, el sobrenadante obtenido en step 1,2).
    5. baje con cuidado los tubos en las cubetas del rotor de cubeta oscilante. Centrifugar los gradientes de 100 min a 180.000 xga 4 ° C utilizando una ultracentrífuga.
    6. Después de la centrifugación, dejar los tubos en sus cubetas durante 20 minutos a 4 ° C para permitir que los gradientes se estabilicen.
  4. fraccionamiento en gradiente de sacarosa (2 hr)
    1. Retirar con cuidado un tubo de ultracentrífuga desde el rotor de ultracentrifugación y montarlo en el dispositivo colector de un gradiente de densidad sistema de fraccionamiento. Recoger fracciones de 1 ml de seguimiento de la absorbancia a 260 nm con un detector de UV / VIS (Ver Figura 1 panel superior). Mantenga las fracciones recogidas en el hielo.
    2. Preparar alícuotas de 30-40 l de las fracciones de interés, mantenerlos en hielo antes de almacenarlas a -80 ° C hasta su uso. No utilice alícuotas o fracciones de sacarosa que se sometieron a más de dos ciclos de congelación-descongelación (véase la figura 1 panel inferior).

2. Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica (3 hr)

  1. El uso de la cinta, retire las láminas de mica.
  2. Lavar las hojas de mica 3-4 veces con DEPC-agua y colocarlo en una pequeña placa de Petri. Después hay que secar la superficie con el aire.
  3. Cubrir la mica con 200 l de 1 mM NiSO4 y se incuba durante 3 minutos a TA.
  4. Retire la solución de níquel y luego secar la superficie con el aire. Llevar a cabo todas las medidas futuras a 4 ° C mediante la colocación de la placa de Petri con la mica en hielo.
  5. Descongelar una alícuota obtenida en 1.4.2 en hielo y suavemente añadir toda la gota a gota de la muestra en la mica. Con una punta de 100 a 200 l, se extendió la muestra sobre toda la superficie de la mica. Incubar la muestra en hielo durante 3 min.
  6. Cubrir la caída de la hoja de mica a gota con 200 l de tampón frío-AFM (véase la Tabla 1) y se incuba durante 1 hora en hielo.
  7. Imaging en líquido
    1. Retirar con cuidado el Buffer-AFM y lavar las hojas de mica 3-4 vezs con 200 l de tampón frío-AFM para eliminar el exceso de sacarosa. A continuación, lavar las hojas de mica 3 veces con solución de lavado en frío (ver Tabla 1), dejando la superficie de mica cubierto por algunos microlitros de solución.
    2. Ir hasta el punto 3 (Adquisición de imágenes).
  8. Formación de imágenes en el aire
    1. Retirar con cuidado el Buffer-AFM y lavar la mica 3-4 veces con 200 l de tampón frío-AFM para eliminar el exceso de sacarosa. A continuación, se lava la mica 3 veces con solución de lavado en frío (véase la Tabla 1) y drenar el exceso de agua con papel.
    2. Deja secar la muestra bajo el capó química con la parte superior de la placa de Petri parcialmente abierta. Después de 2 horas, cierre la placa de Petri y se almacena a temperatura ambiente. Medir la muestra después de 2-3 horas, ya que son estables durante años.

3. Adquisición de imágenes (15 min por la imagen después de la estabilización térmica)

Nota: Polisomas inmovilizados sobre mica se pueden obtener imágenes en el aire o en forma líquida, se utiliza el modo de corriente alterna.

  1. Una la mica para el soporte de muestra usando cinta de doble cara.
  2. Inserte el soporte de la muestra en la etapa de AFM siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuando la imagen en forma líquida, si es posible, trate de mantener la muestra a una temperatura inferior a 25 ° C para aumentar polisomas estabilidad en el tiempo.
  3. Seleccionar un voladizo adecuada para obtener imágenes de CA y montarlo en el soporte de la punta siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, el uso de voladizos con constante entre 2-20 N / m para obtener imágenes de aire y alrededor de 0,1 N / m para la imagen líquido vigor.
  4. Ajuste el punto de láser en el voladizo cero y las señales de los detectores de cuadrante.
  5. Seleccione una frecuencia de accionamiento oportuno y conducir el voladizo con una amplitud de 10 a 20 nm.
  6. Acercarse a la muestra hasta que la punta se acopla a la superficie.
  7. Seleccione un área de barrido de m 2x2, adquirir al menos 512x512 píxeles de las imágenes (ancho de píxel <4 nm), seleccionar un modo de sustracción de fondo en vivo y una escala Z de 20-25 nm.
  8. inspeccionar tque la imagen en busca de la presencia de objetos redondos que se caracterizan por la altura entre 10 y 15 nm al adquirir en el aire y 25 y 30 nm, cuando en líquido y la anchura en el intervalo de 25-30 nm. Ajustar los parámetros de consigna y la realimentación hasta que los objetos afilados se visualizan. El fondo debería aparecer relativamente plana en buenas muestras, con algunos objetos de altura 2-4 nm (véase la Figura 2A y B).
  9. Si la imagen se ve bien (como se indica en el punto 3.8), adquirir varias exploraciones 2x2 micras (al menos diez) en las diferentes áreas de la muestra.
  10. (opcional). Si es necesario, adquirir imágenes de alta resolución de polisomas seleccionados (véase la figura 2C).
  11. Aplicar correcciones de software (la resta de avión y algoritmos de corrección de línea por línea) para corregir las imágenes de AFM eliminación de inclinación arbitraria y efectos a la deriva.

4. Análisis de Datos (30 minutos por imagen)

  1. Exportación de imágenes en ImageJ (opcional: aplicar un factor de escala) preferenteially utilizando un formato de compresión sin pérdidas, por ejemplo, el formato TIFF (véase la Figura 3A).
  2. Utilice la macro RiboPick.ijm conjunto de herramientas ImageJ (a copiar en el subdirectorio macro / conjunto de herramientas ImageJ) para contar los ribosomas en polisomas (véase la Figura 3B) y calcular propiedades estadísticas de la muestra (véase la Figura 3C).
    1. Comenzará a cargar una imagen mediante la herramienta que inicia el programa.
    2. Recoger los centros de ribosomas con la estándar ImageJ herramienta (shift + clic izquierdo permite la selección múltiple de los ribosomas). Marcar los ribosomas seleccionados con el herramienta. ribosoma coordenadas aparecerán en una ventana de texto personalizado.
    3. Añadir más ribosomas a la misma polisomas repitiendo el procedimiento indicado en el punto 4.2.2.
    4. Retire los ribosomas marcados erróneamente utilizando el herramienta (comienza a eliminar de la última ribosoma añadido a la primera212; en el polisomas actual).
    5. Cuando se haya completado la polisomas, utilice el herramienta. A medida que se añade el número de polisomas como una superposición a la imagen, se actualiza la ventana de texto.
    6. Utilice el escribir el ribosoma coordina una imagen PNG que resume los ribosomas y polisomas el archivo elegido (se utilizan las unidades predeterminadas de la imagen) y. La imagen original se cerró sin ser salvado.

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Resultados

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Sacarosa perfiles polisomico gradiente de todo el cerebro de ratón

Es posible purificar polisomas partir de un lisado celular por un perfil de polysomal, que separa macromoléculas de acuerdo a su peso y tamaño. Con perfiles polysomal, lisados ​​citoplásmicos obtenidos a partir de células o tejidos cultivados, como en este ejemplo, se cargan en un gradiente de sacarosa lineal y procesados ​​por ultracentrifugac...

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Discusión

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Como la estructura del ADN fue demostrado ser de suma importancia para describir el proceso de la transcripción y la organización de la cromatina avanzada nuestra comprensión de control transcripcional de la expresión génica, es esencial para analizar la organización y estructura de polisomas para mejorar la comprensión veraz de la traducción y su regulación.

Con el protocolo descrito, una densidad óptima de polisomas suavemente inmovilizados sobre una superficie plana, se obtiene adecuado p...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos en este documento y no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por el proyecto de investigación AXonomIX financiado por la Provincia Autonoma di Trento, Italia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CicloheximidaSigma01810Preparación de ADN lisado
Thermo Scientific89836Preparación de lisado
Inhibidor de ARNasa RiboLock LifetechnologiesEO-0381Preparación de lisado
DEPCSigma40718Preparación de lisado
Triton X100SigmaT8532Preparación de lisado
DTTSigma43815Preparación de lisado
Desoxicolato de SodioSigmaD6750Preparación de
lisado Microcentrífuga Eppendorf5417RPreparación de lisado Sacarosa
SigmaS5016Preparación de gradiente de sacarosa
UltracentrífugaBeckman CoulterOptima LE-80KCentrifugación en gradiente de sacarosa
Rotor ultracentrífugaBeckman CoulterSW 41 TiCentrifugación en gradiente de sacarosa
Tubo de polialómeroBeckman Coulter331372Centrifugación en gradiente de sacarosa
Sistema de fraccionamiento en gradiente de densidad Teledyne Isco67-9000-176Fraccionamiento en gradiente de sacarosa
AFMAsylum ResearchCypherVisualización de polisomas

Referencias

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