Una regulación de puesta a punto de la transcripción génica subyace en la decisión del destino celular embrionaria. En este documento, se describen ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina utilizados para investigar la regulación epigenética de tanto la diferenciación cardiaca de células madre y el desarrollo cardiaco de embriones de ratón.
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Artículo de método
La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos
En este artículo
Resumen
Resumen
la transcripción del gen específico es un proceso biológico fundamental que subyace en la decisión del destino celular durante el desarrollo embrionario. El proceso biológico está mediada por factores de transcripción que se unen regiones reguladoras genómicas que incluyen potenciadores y promotores de los genes constitutivos cardíacas. ADN se envuelve alrededor de las histonas que se someten a modificaciones químicas. Las modificaciones de las histonas conducen a más reprimida, que se activa la transcripción de genes o aplomado, con lo que otro nivel de regulación de puesta a punto de la transcripción génica. Las células madre embrionarias (células ES) recapitulan dentro de cuerpos embrionarios (es decir, los agregados de células) o en cultivo 2D los primeros pasos del desarrollo cardíaco. Proporcionan, en principio, suficiente material para la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), una tecnología ampliamente utilizada para identificar las regiones reguladoras de genes. Además, las células madre embrionarias humanas representan un modelo celular humano de cardiogénesis. En etapas posteriores del desarrollo, los tejidos de embriones de ratón permiteninvestigar paisajes epigenéticos específicos necesarios para la determinación de la identidad de la célula. Aquí se describe protocolos de microprocesador, microprocesador secuencial seguida de PCR o chip-secuenciación utilizando células madre embrionarias, cuerpos embrionarios y regiones embrionarias específicas cardiacas. Estos protocolos permiten a la investigación de la regulación epigenética de la transcripción de genes cardiacos.
Introducción
El corazón es el primer órgano en formarse y llegar a ser funcional en el embrión. El corazón está construido a partir de muchos linajes de células que surgen de la primera y segunda campos corazón embrionario 1. Desde el blastocisto después de la fertilización etapa de seguimiento a la forma de corazón, las células embrionarias tienen por tanto que tomar muchas decisiones del destino celular. La transcripción de genes está regulada de una manera en tiempo y espacio-dependiente y es un proceso biológico fundamental que subyace en la decisión del destino celular durante el desarrollo embrionario. Tal proceso está mediado por factores de transcripción ....
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Protocolo
1. DNA-proteína entrecruzamiento
- Fijar en tubos de 15 ml de células cosechadas-ES (2 x 10 6 células para regular de chip, 2 x 10 5 células de microchip), los cuerpos embrioides (EBS) generadas a partir de células madre embrionarias y tejidos del corazón de embriones disecados de embriones E9.5 ratón (auriculoventricular canal, tracto de salida del ventrículo y) usando formaldehído al 1% en PBS durante o células en tampón de permeabilización PB2 de tejidos embrionarios. Colocar los tubos en un agitador orbital a una velocidad de 60 rpm a temperatura ambiente durante exactamente 10 min.
- Detener la reacción de reticulación medi....
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Resultados
La Figura 1A ilustra la primera preparación de perlas de unión al ADN y el control de calidad utilizando ADN de diferentes tamaños (escalera de 1 kb). 0NE, se añadieron 2 y 2,5 volúmenes (1 a 3) de los granos a un volumen de la muestra para purificar fragmentos de ADN de alto y bajo tamaño molecular.
Las figuras 1 B, C, D son ejemplos típicos de geles de ADN de ADN agitado cuando todo extraído.......
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Discusión
La epigenética se ha convertido en un importante campo de investigación en biología del desarrollo. ¿Cómo un programa genético se activa en las células embrionarias para permitir que las células de la adquisición de una identidad específica dentro de un linaje embrionario ha sido durante mucho tiempo una cuestión clave para los biólogos del desarrollo.
ChIP se ha usado ampliamente en los últimos años y combinado para la secuenciación del ADN después de la mejora en la resolución de la secuen.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a las agencias de financiación, al programa comunitario europeo IMI StemBANCC, a la Fundación Leducq (SHAPEHEART) y a la Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Formaldehído | Sigma | F8775 | Fijación de células |
| Glicina | Sigma | G8898 | Parada de reticulación |
| Aprotinina | Fluka | 10820 | Inhibidor de proteasas |
| Hemisulfato de leupeptina | Sigma | L2882 | Inhibidor de proteasas |
| PMSF | Sigma | P7626 | Inhibidor de proteasas |
| Proteína A perlas magnéticas | Life technologies | 10001D | Inmunoprecipitación |
| SPRI perlas magnéticas | Thermo Scientific | 15002-01 | Purificación de ADN |
| Proteinasa K | Life technologies | 25530-015 | Digestión de proteínas |
| Estándar de ADN BR | Life technologies | Q32850 | Rango de calibración |
| Sondas moleculares | Syber verde | S-11484 | cuantificación de ADN |
| Invitrogen | P7589 | Cuantificación de ADN | |
| PBX 1x | Life technologies | 14190-094 | |
| Lavado de DNasa Agua libre de RNasa | Life technologies | 10977-035 | Dilución |
| Tubo Axygen | Axygen | MCT-175-C | ChIP purificción |
| Anticuerpo | Empresa | Referencia | concentración de ChIP |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µ g para ESC y EBs, 1 µ g para tejidos |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 y micro; g para ESC y EBs, 1 µ g para tejidos |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 y micro; g para ESC y EBs, 1 µ g para tejidos |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 y micro; g para ESC y EBs, 1 µ g para tejidos |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 y micro; g para ESC y EBs, 1 µ g para tejidos |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 y micro; g para ESC y EBs, 1 µ g para pañuelos |
Referencias
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet.
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Reimpresiones y permisos
