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Artículo de método

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

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DOI:

10.3791/53877

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12 de marzo de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Resumen

El pez cebra (Danio rerio) es un poderoso organismo modelo para estudiar el desarrollo de los vertebrados. Aunque muchos aspectos del desarrollo embrionario del pez cebra se han descrito a nivel morfológico, se sabe poco sobre las bases moleculares de los cambios celulares que ocurren a medida que el organismo se desarrolla. Con los recientes avances en microfluídica y tecnologías de multiplexación, ahora es posible caracterizar la expresión génica en células individuales. Esto permite investigar la heterogeneidad entre células individuales de poblaciones celulares específicas para identificar y clasificar subtipos de células, caracterizar estados intermedios que ocurren durante la diferenciación celular y explorar respuestas celulares diferenciales a estímulos. Este estudio describe un protocolo para aislar células individuales viables de embriones de pez cebra para ensayos de multiplexación de alto rendimiento. Este método se puede aplicar rápidamente a cualquier tipo de célula embrionaria de pez cebra con marcadores fluorescentes. Una extensión de este método también se puede utilizar en combinación con tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para caracterizar completamente el transcriptoma de células individuales. Como prueba de principio, se evaluó la abundancia relativa de marcadores de diferenciación cardíaca en células individuales aisladas derivadas de progenitores cardíacos nkx2.5 positivos. Mediante la evaluación de la expresión génica a nivel de una sola célula y en un solo punto de tiempo, los datos respaldan un modelo en el que los progenitores cardíacos coexisten con la progenie en diferenciación. El método y el flujo de trabajo descritos aquí son ampliamente aplicables a la comunidad de investigación del pez cebra, ya que solo requieren una línea de peces transgénicos etiquetados y acceso a tecnologías de microfluídica.

Introducción

La mayoría de los estudios actuales de la biología celular y molecular se basan en promedios de la población. Sin embargo, importantes eventos biológicos pueden estar enmascarados por estos análisis tradicionales basados ​​en la población ya que las poblaciones de menor importancia pueden desempeñar un papel importante en los procesos biológicos y evolución de la enfermedad. La comprensión de la expresión de genes en poblaciones heterogéneas a nivel de una sola célula puede (y tiene) conducir a conocimientos biológicos y clínicos 1,2. De interés para los estudios de desarrollo embrionario, en una población mayor de células, las células progenitoras son a menudo poco representados, por lo que es difícil de detectar cambios sutiles en la expresión de genes que inician en última instancia, las decisiones del destino celular 3. Del mismo modo, un solo tipo de células puede tener diferentes perfiles de expresión en respuesta a la microambiente 4. Por ejemplo, las células endoteliales residentes en el mismo órgano o en diferentes órganos (por ejemplo., Aorta o riñón) presentan una heterogeneidad significativa a pesar de compartir morp comúncaracterísticas hological y funcionales 5. Además, las células cancerosas que pueblan el mismo tumor también pueden tener diversos perfiles moleculares o mutaciones en el nivel de células individuales 6.

En los sistemas modelo, transcriptómica en células individuales ha identificado con éxito nuevas poblaciones de células, que se caracteriza estados intermedios que se producen durante la diferenciación celular, y puso de manifiesto las respuestas celulares a los estímulos diferenciales 7.8.9. Estas ideas se han enmascarado en los estudios convencionales basados ​​en la población. embriones de pez cebra son una fuente tremendamente infrautilizados del tallo, células progenitoras, y diferenciación de las células para explorar cuestiones de la heterogeneidad de células individuales y la regulación molecular de identidades celulares durante el desarrollo. Su altamente estereotipada, ex vivo el desarrollo y la facilidad de manipulación genética ellas un excelente sistema modelo para este enfoque 10,11 hacen. En concreto, una limitación importante a la interpretación de un solo gen celulardatos de correo expresión es que la identificación fiable de los nuevos estados intermedios de células durante el desarrollo requiere mucho cuidado el momento de la recogida de tejidos 9. Esto es necesario para asegurar que la heterogeneidad entre las células capturadas representa heterogeneidad dentro de un tejido en un solo punto de tiempo en lugar de la heterogeneidad en la expresión génica presentado por la diferenciación de células dependiente de la edad. En comparación con los ratones, el desarrollo del embrión de pez cebra se puede sincronizar con precisión a través de un gran número de embriones 12. Además, con tamaños grandes de embrague, embriones de pez cebra se pueden utilizar como una fuente abundante de células madre y progenitoras.

Este protocolo describe un método para aislar células de embriones de pez cebra y la captura de células individuales utilizando un chip y Autoprep sistema disponible comercialmente circuito microfluídica integrado (IFC) para el análisis de la expresión génica QRT-PCR. Este protocolo puede ser rápidamente transferible a ningún ensayos de alto rendimiento, incluyendo toda la multiplexaciónsecuenciación del transcriptoma que permite un análisis más exhaustivo de la heterogeneidad celular 13. También ofrece varias ventajas a los ensayos de expresión génica tradicionales. El protocolo de aislamiento de células individuales se obtiene una alta viabilidad después de FACS, lo que disminuye la proporción de células comprometidas que se incluyen en las aplicaciones posteriores. Mediante el uso de un CFI, células capturadas pueden ser observados directamente para evaluar las tasas de captura y evaluar la salud de células morfológicamente. Además, este protocolo es ampliamente aplicable a la comunidad de investigación pez cebra, que sólo requiere una línea de peces transgénicos etiquetados y el acceso a las tecnologías de captura de células de microfluidos.

Como prueba de principio, se aislaron células individuales derivadas de progenitores cardíacos y capturados en un chip IFC, y luego la abundancia relativa de marcadores de diferenciación cardíaco se midió mediante qRT-PCR. análisis de la expresión génica a nivel de células individuales demuestra que los progenitores cardíacos coexisten con su differeprogenie ntiating. El conocimiento que se obtiene a partir de perfiles de una sola célula de células progenitoras cardíacas puede arrojar luz sobre la heterogeneidad en los patrones de expresión génica entre células progenitoras cardiacas durante el desarrollo de vertebrados, que puede haber sido enmascarado en los análisis tradicionales basados ​​en la población.

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Protocolo

Este protocolo requiere el uso de vivo, el pez cebra adultos para producir embriones. Los embriones se cosechan para la recogida de tejidos. Es esencial para obtener la aprobación de ética apropiadas juntas de revisión para llevar a cabo este experimento.

1. obtener embriones por etapas

  1. El día antes del experimento, preparar sana pez cebra, adulto para la cría. Coloque un macho y una hembra en lados opuestos de una clara divisoria en un tanque de cría.
  2. Repita 1,1 para tantos tanques de cría como necesarios para la producción de embriones suficiente para la aplicación de aguas abajo. Obtener embriones de peces, tanto de tipo salvaje y peces transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en el tipo de célula de interés.
    NOTA: El número de embriones necesarios para las aplicaciones posteriores en los Pasos 2-8 depende de la abundancia relativa de las células de interés en el lugar de interés tiempo. Aunque esto puede variar según el tipo de células, 200 embriones producen 2.000-5.000 células clasificadas cuando el cells de interés representan <1,0% del total de células en 24 HPF (horas después de la fecundación).
  3. A la mañana siguiente, cambie el agua en el depósito de empanado por la transferencia de los peces a un tanque de cría fresco y eliminar el divisor. Incline el tanque en un ángulo para fomentar la cría.
  4. Recoger los embriones por etapas.
    1. Cada 15 minutos, recoger embriones mediante la transferencia de los adultos a un tanque de cría fresco y pasar los huevos que se quedan atrás a través de un colador de té.
      NOTA: los embriones de pez cebra se desarrollan de forma sincrónica cuando se mantienen a densidades y temperaturas comparables.
    2. Lavar los huevos con el huevo de agua (sales Instant Ocean 0,21 g / L en 1 l de agua doblemente destilada) y transferir a una placa de Petri. La transferencia de la placa Petri hasta una incubadora húmeda a 28,5 ° C con circulación de aire.
  5. Dos horas después de la última recogida, tipo fertilizado, los embriones multicelulares en 10 cm placas de Petri y reducir la densidad a 50 embriones por placa. Seleccione los embriones procedentes de una sola, 15ventana de tiempo min de la recolección para la aplicación de aguas abajo. Incubar los embriones a 28,5 ° C.
    NOTA: Por ejemplo, recoger los embriones a las 8:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 y 10:15 AM. Hacer comparaciones entre los puntos de tiempo, si el mayor número de embriones fecundados son de las garras recogidos a las 9:00, a continuación, utilizar sólo estos embriones para aplicaciones posteriores.

2. Configuración para las disociación de los organismos unicelulares

  1. Aproximadamente 30 minutos antes del punto de interés (18 HPF) Retire los embriones de su corion manualmente con unas pinzas finas.
  2. Recoger y etiquetar lo siguiente para cada condición: dos tubos de microcentrífuga de 2 ml, un colador de 40 micras de células, una placa de cultivo celular de 35 mm, y dos tubos de FACS rematados con un filtro de células de 35 micras.
  3. Enfriar los siguientes reactivos sobre hielo: contiene huevo Agua sales Instant Ocean 0,21 g / L en 1 l de agua doblemente destilada; De-yolking tampón que contiene NaCl 55 mM, KCl 1,8 mM, y mM NaHCO 3 1,25; y FACS tampón que contiene de Leibovitz L-15 medio suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 5%.
  4. Llevar 1 ml por muestra de célula reactiva Disociación 1 a RT. Descongelar 1 ml de Disociación Celular reactivo 2 por muestra en hielo. Llevar a TA inmediatamente antes de su uso.

3. La disociación de los organismos unicelulares

  1. Usando una pipeta de vidrio de ancho diámetro interior, transferir 100-300 embriones a un tubo de 2 ml de microcentrífuga en un volumen mínimo de agua del huevo.
  2. La eutanasia a los embriones mediante la sustitución de agua con 1 ml de hielo-agua fría huevo y sumergiendo el tubo en hielo durante 20 min.
    PRECAUCIÓN! Es fundamental para obtener la aprobación del comité de supervisión del cuidado animal institucional adecuado para este método de eutanasia (que se enfría en hielo seguido de disociación celular como la eutanasia secundaria). la eutanasia norma general requiere que los embriones <3 días después de la fertilización se blanqueada después que se enfríen, lo que no es apropiado para la obtención de células viables.
  3. Lavar los embriones dos veces con 1 ml enfriado en hielo de agua del huevo. Para lavar, usar una amplia pipeta de vidrio para eliminar el orificio del huevo de agua y un P1000 añadir huevo agua.
  4. Retire la yema mediante la sustitución del agua de embriones con 1 ml de tampón deyolking y triturando 8-12 veces con una punta P1000, o hasta que la yema se disuelve y sólo los cuerpos de los embriones son visibles.
  5. Recoger el tejido por centrifugación a 300 xg durante 1 min. Utilizar una pipeta para eliminar suavemente el sobrenadante sin perturbar el sedimento de tejido. Vuelva a suspender en 1 ml de agua del huevo.
  6. Repita el paso 3.5 para un total de tres lavados, pero en el lavado final, re-suspender en 1 ml RT Cell disociación Reactivo 1.
  7. Incubar en la célula reactivo de disociación 1 durante 10 min a RT con los tubos en posición horizontal. Cada 2-3 minutos, se tritura suavemente con una pipeta P1000 para evitar la formación de grumos.
    Nota: Maneje con cuidado las muestras durante las etapas de trituración. En algún momento un único grupo grande se formará en el tubo de una maraña de cuerpos embrionarios. Esta voluntaddispersar con la digestión adicional con la ayuda de trituración suave. NO HACER vórtice.
  8. Recoger el tejido por centrifugación a 300 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de Disociación Celular reactivo 2.
  9. Incubar durante 5-15 minutos a temperatura ambiente. Colocar los tubos en posición horizontal. Cada 2-3 minutos, triturar con cuidado para evitar la formación de grumos. Cada 5 minutos, evaluar el progreso digestión.
    1. Para evaluar el progreso de la digestión, se diluye el sobrenadante 2 l en 18 l de tampón FACS y la pipeta como una gota sobre una placa de cultivo celular.
    2. Colocar un cubreobjetos sobre la muestra y observar bajo un microscopio de cultivo de tejidos a 10X y 20X aumentos.
      NOTA: La preparación debe aparecer como una mezcla de células individuales, pequeños grupos, grandes grupos, y de vez en cuando el cuerpo del embrión en su mayoría intacta.
    3. evaluar visualmente la proporción de la preparación que es células individuales y pequeños grupos.
      NOTA: Durante la digestión reducirá la viabilidad; bajo-digestión reducirá el rendimiento de una sola célula.
  10. Recoger la preparación de células por centrifugación a 300 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón FACS frío.
  11. Humedecer un filtro de células de 40 m con tampón FACS. Pasar la suspensión de células a través del filtro celular 40 micras sobre una placa de cultivo celular 35 mm. Lavar el filtro de células una vez con 1 ml de tampón FACS clasificación.
  12. Transferir el flujo a través de un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Recoger las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min y volver a suspender en 100 l de tampón FACS.
  13. Contar el rendimiento de células usando un hemocitómetro. Diluir las muestras de 5x10 6 células por ml, o la concentración óptima recomendada para la máquina de FACS de elección. Opcional-Al contar rendimiento celular en el hemocitómetro, las células muertas de colorante de contraste con azul de tripano para confirmar la viabilidad de la preparación celular antes de la separación FACS.
    NOTA: Las preparaciones que se diluyen también se llevará a cantidad excesiva de tiempo para ordenar. Las preparaciones que son demasiado concentrated tienden a agruparse en multímeros, y no son óptimas para clasificar una población pura.
  14. Reserva un 10-20% de cada muestra para usar como controles sin teñir. Para las muestras restantes, las células muertas de la mancha mediante la adición de un / muerto (L / D) la discriminación en vivo tinte fluorescente en cada muestra. No lavar.
    NOTA: Cualquier colorante fluorescente que penetra en las células con las membranas celulares comprometidas y manchas ácidos nucleicos se pueden utilizar como el colorante L / D, a condición de que los espectros de fluorescencia es compatible con la máquina de FACS de elección y de etiquetado fluoróforo células de interés.
    1. No lave la preparación después de añadir el colorante ya que algunas células mueren durante el transporte a la purificación FACS y deben ser excluidos de la población clasificada.
  15. Humedecer el filtro de 35 micras de opérculo tubo de FACS con 20 l de tampón FACS. Añadir células para el colador y recoger por gravedad. Almacenar en hielo.

4. FACS Enriquecimiento

  1. Utilice FACS para enriquecer sola, Células vivas que expresan el marcador fluorescente.
    1. Establecer una puerta para distinguir las células de los escombros en un gráfico de dispersión de dispersión frontal (FSC-A) de amplitud vs amplitud de dispersión lateral (SSC-A), ambos con la escala lineal.
      ¡Precaución! Células de pez cebra son más pequeños que las células de ratón o humanos. Esto se refleja en una separación basal inferior entre las células y los desechos.
    2. Desde la puerta fijado en el punto 4.1.1, establezca una puerta para enriquecer en células individuales y no incluyen multímeros utilizando un gráfico de dispersión de la altura de dispersión hacia adelante (FSC-H) y baja altura de dispersión lateral (SSC-H), tanto con la escala lineal.
      NOTA: Las células con desproporcionadamente alto FSC-H y bajo SSC-H son probables multímeros y se excluyen de la clasificación.
    3. A partir del conjunto de puerta en 4.1.2, utilizando los controles de un solo color, establecer una puerta para incluir sólo las células vivas utilizando un gráfico de dispersión de la FSA-A con la escala lineal y la amplitud del canal utilizado para la detección de manchas L / D con el escalamiento de registro. Incluir células negativas L / D.
    4. Dela puerta situado en 4.1.3, utilizando los controles de un solo color, establece una puerta para incluir sólo las células vivas con fluorescencia positiva utilizando un gráfico de dispersión de la FSA-A con la escala lineal y la amplitud del canal utilizado para detectar células marcador proteína fluorescente con el escalamiento de registro . Incluyen células positivas.
    5. Establecer los controles de compensación, si es necesario, para tener en cuenta la interferencia entre la L D mancha / y los espectros de la proteína fluorescente.
  2. Juego de lógica tipo de células que se dividen en todas las puertas establecidas en el paso 4.1.
    1. El uso de células doblemente marcadas, verificar la compuerta de clasificación de células.
      NOTA: Las células para la ordenación será células en lugar de los desechos, las células individuales en vez de multímeros, L / D células positivas y negativas de fluorescencia.
  3. Ordenar 2.000-4.000 células de la población de interés en 5 l de tampón FACS frío en un tubo de microcentrífuga en hielo. Para minimizar cizallamiento y la tensión en las células durante la clasificación, utilice las presiones más bajas posible que la célulaclasificador.
    NOTA: La gota de 5 l de tampón FACS sirve como un amortiguador para las células que salen de la máquina de FACS. El cobro de 2.000-4.000 células directamente en tampón FACS elimina la necesidad de centrifugación antes de cargarlo en los chips de la IFC. Esta estrategia se recomienda porque la centrifugación se puede llevar a la formación de multímeros de si las células se adhieren el uno al otro en el sedimento.
  4. Evaluar el análisis de viabilidad posterior a la especie.
    1. Transferencia de 1 l ordenados células a un tubo de FACS fresco con 100 l de tampón FACS y 1 de clasificación: 1000 dilución de L / D mancha. Pasar las células a través del clasificador FACS con la estrategia de compuerta en el paso 4.1. Utilice la proporción de L / D negativo a positivo para estimar la viabilidad de las células clasificadas.

5. Las células se cargan en microfluídica viruta

  1. El uso de un hemocitómetro, medir tanto la concentración y el tamaño de células clasificadas.
    1. Diluir las células ordenadas en al menos 10 l. Diluir una alícuota de 5 μ; L células con 5 l de azul de tripano. Cargar en hemocitómetro y aplicar cubreobjetos.
    2. Recoger las imágenes de campo claro de todas las células en 4 x 4 rejillas de hemocitómetro. Contar el número de células vivas y calcular vivo células / ml. Las células vivas no ocupan azul de tripano.
      NOTA: Utilice cualquier software de análisis de imagen estándar para medir el diámetro de todas las células vivas. Se calcula la media y la desviación estándar del tamaño de la celda y seleccione una placa CFI adecuado para el rango de tamaño de célula de interés. Si el rango de tamaño de celda a caballo entre un rango de tamaño de celda placa de IFC, utilizar múltiples placas para capturar toda la gama de células de interés.
  2. Las celdas de carga en la placa de la CFI según las instrucciones del fabricante (ver Materiales).
    1. Diluir las células a 1x10 6 células / ml y llevar a cabo la optimización de la flotabilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: optimización de la flotabilidad asegura que las células no se hunden hasta el fondo ni flotan en la parte superior de la carga well para la carga óptima en chip de la CFI. La relación de tampón a las células puede variar según el tipo de célula, pero típicamente oscila 6: tampón: 4-7: 3 de las células.
    2. Añadir las células a la placa-CFI cebado. Carga de placa en la máquina de fluidos compatibles, y ejecutar un script de carga de las células para empujar las células a través del circuito de microfluidos y en carriles de captura.
  3. Confirman que las células sean alojados en los sitios de captura en la placa de la CFI.
    1. Retire la placa de la CFI de la máquina de fluidos. Montar la placa del CFI en un microscopio equipado con un adaptador de la placa.
    2. Recoge instantáneas de campo claro y fluorescencia para cada sitio de captura en un aumento de 10X.
      NOTA: Campo claro tiempos de captura pueden variar de 10-50 ms, dependiendo de la intensidad de la lámpara. los tiempos de captura de fluorescencia pueden oscilar entre 250-750 ms, dependiendo de la luminosidad fluoróforo. Evitar la sobreexposición de las células para prevenir el daño solar.

6. Síntesis de ADNc

  1. Realizar la lisis celular in situ de acuerdo con Ilas instrucciones del fabricante FC placa.
    1. Añadir tampones de lisis a los pocillos en la placa de la CFI. Carga de placa en la máquina de fluidos compatibles y escritura de la lisis celular de ejecución según las instrucciones del fabricante.
  2. Realizar la transcripción inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante CFI plato.
    1. Añadir los reactivos de transcripción inversa a la placa de la CFI. Carga de placa en la máquina de fluidos compatibles. Ejecutar script de la transcripción inversa. condiciones de los ciclos de la muestra: 1 ciclo a 25 ° C durante 10 min, 1 ciclo a 42 ° C durante 1 hora, a continuación, 1 ciclo a 85 ° C durante 5 min.
  3. Realizar pre-amplificación con sondas de genes específicos de acuerdo con las instrucciones del fabricante IFC placa.
    NOTA: Debido a su mayor especificidad con los números de bajo número de copias, utilizar sondas-fluorogénicos marcado en lugar de sondas optimizadas para su uso con tintes intercalantes.
    1. cebadores de la piscina y se diluye hasta final de 180 nM cada uno. Añadir cebadores agrupados a la placa de la CFI. Carga de placa en FLUIDI compatiblescs máquina. escritura de preamplificación ejecutar.
  4. Realizar pre-amplificación con las siguientes condiciones de ciclo: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, luego 18 ciclos con desnaturalización a 95 ° C durante 15 s después de recocido y extensión a 60 ° C durante 4 min. Tienda de pre-amplificación de cDNA a 4 ° C hasta el momento de la cosecha. Cosecha de cDNA a partir de la placa de microfluidos acuerdo con las instrucciones del fabricante y almacenar a -20ºC hasta su uso.

7. Selección de ADNc a partir de células individuales para un solo objetivo QRT-PCR

  1. Diluir cDNA en 25 reactivo de dilución l de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: rendimiento final aproximado es de 28 l de cDNA pre-amplificado por célula. Reserva una alícuota de diluyente para su uso como un control sin plantilla en QRT-PCR.
    1. Refiriéndose a campo brillante y las imágenes fluorescentes registrados en el paso 5.3.2, la puntuación de cada sitio de captura. contar y registrar manualmente el número de células. Evaluar y registrar si cada célula es la gripeorescent.
      NOTA: Cada sitio individual puede contener 0, 1, o> 1 célula, donde> 1 célula incluye sitios de captura que contienen múltiples células y / o restos no identificables. Si las imágenes son suficientes calidad, un valor de píxel también puede ser asignado para cuantificar la intensidad de la señal de fluorescencia.
  2. Seleccionar muestras para el análisis de QRT-PCR.
    1. Seleccionar muestras de cDNA a partir de los lugares de captura identificadas en el paso 7.2 que contienen exactamente 1 célula con fluorescencia positiva. 1 piscina alícuotas de cDNA de cada muestra.
      NOTA: Este es el control positivo "piscina" que se utiliza para determinar si los genes de interés se expresan en cualquiera de las celdas seleccionadas.
    2. Seleccionar ADNc a partir de al menos un sitio de captura que contiene exactamente 0 células como un control negativo. Use diluyente de la etapa 7.1.2 como control sin molde.
  3. Ejecutar QRT-PCR ensayo.
    1. Utilice sólo las sondas utilizadas para la pre-amplificación en el paso 6.4.1. Cargar todas las muestras en triplicatmi. Las condiciones de ciclación para una reacción de 10 l en una placa de 384: 1 ciclo de 50 ° C 2 min, 1 ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos con desnaturalización a 95 ° C 15 seg a continuación, recocido y extensión a 60 ° C durante 1 min.

Análisis de datos 8.

  1. Validar productos QRT-PCR por electroforesis en gel estándar. Confirmar producto es una sola banda a peso molecular esperado (varía para cada sonda).
    NOTA: Si una sonda produce múltiples bandas o una sola banda a un tamaño apropiado, a continuación, la especificidad es cuestionable, y esto excluye el gen del análisis.
  2. Examinar todas las curvas de amplificación y dar cuenta de cualquier anomalía 14. Calcular el valor medio de CT para cada combinación de muestra / gen 15.
    NOTA: Los valores de CT para los controles positivos se extienden típicamente a partir de 10-30. CT valores para los controles negativos suelen oscilar entre un 35-40 (sin amplificación). valores CT 30-35 se consideran muy baja expresióny deben interpretarse con precaución 14.
  3. informe de datos
    1. Si las muestras caen en el CT = 10-30, los datos pueden ser también registradas como factor de cambio en la abundancia de transcripción en relación con una muestra de control.
      NOTA: doble cambio es igual a 2 ^ (- ΔΔCT) donde Ct es relativa a un gen de mantenimiento restando el CT promedio de la muestra de la limpieza de genes y ΔΔCT son las diferencias en Ct entre la muestra y un control positivo 15.

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Resultados

Como prueba de principio, la expresión génica se evaluó para explorar la dinámica de diferenciación durante el desarrollo cardíaco. En el pez cebra, surgen progenitores cardíacos de una población mesodérmico de células que migran a la anterior mesodermo de la placa lateral donde se fusionan para formar el tubo lineal corazón. Antes de la fusión, progenitores cardíacos comienzan a expresar el factor de transcripción nkx2.5 (NK2 homeobox 5), que se cree que es el primer marcador e...

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Discusión

El método descrito en este documento utiliza la expresión de una proteína fluorescente bajo el control de un promotor específico de tipo celular para enriquecer una población de células progenitoras cardíacas a partir de embriones de pez cebra para su uso en sistema de captura única célula asistida de microfluidos para evaluar la expresión de un subconjunto de genes cardiacos en solo Células. A condición de que las capacidades de FACS de excitación láser y emisión son compatibles con el fluoróforo (s) de elección, este ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. C. Geoffrey Burns por el caldo de peces. Los autores agradecen a la UNC Flow Cytometry Core Facility, a la UNC-CGIBD AAC core por los recursos que permiten este proyecto y a la instalación ZAC para el cuidado de animales. L.S. cuenta con el apoyo de la subvención T32 de los NIH HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. cuenta con el apoyo de la beca de investigación de posgrado de NSF NSF-DGE-1144081. Este estudio contó con el apoyo de la subvención P30DK034987 de los NIH (al UNC Advanced Analytics Core), la subvención de desarrollo científico de la American Heart Association 13SDG17060010 y la subvención New Scholar de la Fundación Médica Ellison AG-NS-1064-13 (al Dr. Qian), y la subvención R00 HL109079 de los NIH (al Dr. Liu).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Supplies
pinzas Dumont #5Fine Science Tools11254-20Para extraer el corion de los embriones
Tubo de microcentrífuga 2 mlGeneMateC-3261-1
40 mmm colador de célulasBiobasicSP104151
placa de cultivo de 35 mmFalcon351008
Tubos FACS rematados con un filtro de celdas de 35 mmmFalcon352235
P1000 y puntasRainin17005089
P20 y puntasRainin17005091
Protocolo del fabricante de chips IFCFluidigm100-6117La versión 100-6117 E1 se utilizó en un experimento representativo
Pastuer de diámetro ancho pipeta de vidrioVWR14673-010para transferencia de embriones
Pez cebra adulto de tipo salvajeN/AUtilizamos la línea AB
Pez cebra transgénico adultoN/AUsamos Tg(nkx2.5:ZsYellow)
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Reactivos para la disociación celular
Agua doblemente destiladaN/A
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
NaClFisherScientificS271-3hacer stock en agua y uso para tampón de desyema
KClSigma AldrichP5405hacer stock en agua y usar para tampón de desyema
NaHCO3Sigma AldrichS6014hacer caldo en agua y uso para tampón de desyema
Leibovitz's L-15Gibco21083-027
FBSFisherScientific03-600-511Inactivado por calor; cualquier marca de FBS debe estar bien
Reactivo de disociación celular 1 -TrypLELife Technologies12605-010Almacenar a temperatura ambiente.
Reactivo de disociación celular 2 - FACSmaxGenlantisT200100Store -20; descongelar en hielo; llevar a temperatura ambiente antes de usar
Pronase (opcional)SigmaP5147
L/D Dye - Sytox BlueLife TechnologiesS34857Cualquier tinción viva/muerta adecuada para la citometría de flujo funcionará
Azul TrypanGibco15250-061
Nombre CompanyNúmero de catálogoComments
Reactivos para uso en placas IFC y qRT-PCR
Gene Specific Sondassondas variarán según el experimento
Sonda TaqMan ef1aLife TechnologiesDr03432748_m1
Sonda TaqMan gata4Life TechnologiesDr03443262_g1
Sonda TaqMan nk2-5Life TechnologiesDr03074126_m1
Sonda TaqMan myl7Life TechnologiesDr03105700_m1
Sonda TaqMan vmhcLife TechnologiesDr03431136_m1
Sonda TaqMan isl1Life TechnologiesDr03425734_m1
Mezcla maestra de expresión génica TaqManTechnologies 4369016
Reactivos incluidos en el protocolo
IFC Kit de reactivos C1Fluidigm100-5319Reactivos para la carga de células en la placa IFC
Ambion Single Cell-to-CTTMLife Technologies4458237Reactivos para las etapas de transcripción inversa y preamplificación
Biología molecular Agua de calidadCorning46-000CM
C1 IFC para PreAmp (5-10 mmm)Fluidigm100-5757Placa IFC para celdas pequeñas
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
Equipo
Máquina C1 AutoPrepFluidigm100-5477Para uso de placa IFC
Hemocitómetro Sigma AldrichZ359629Para el recuento de células y la evaluación del tamaño de las células
MicroscopioPara extraer embriones de corion
MicroscopioPara evaluar la digestión de una sola célula
MáquinaPara aislar células de interés
Las Life del fabricante de disección de cultivo de tejidos FACS

Referencias

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