Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Leigh Ann Samsa; Nicole Fleming; Scott Magness; Li Qian; Jiandong Liu

doi:10.3791/53877

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Artículo de método

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

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DOI:

10.3791/53877

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12 de marzo de 2016

Leigh Ann Samsa¹^,² , Nicole Fleming²^,³ , Scott Magness¹ , Li Qian²^,³ , Jiandong Liu²^,³

¹Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, ²McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Resumen

El pez cebra (Danio rerio) es un poderoso organismo modelo para estudiar el desarrollo de los vertebrados. Aunque muchos aspectos del desarrollo embrionario del pez cebra se han descrito a nivel morfológico, se sabe poco sobre las bases moleculares de los cambios celulares que ocurren a medida que el organismo se desarrolla. Con los recientes avances en microfluídica y tecnologías de multiplexación, ahora es posible caracterizar la expresión génica en células individuales. Esto permite investigar la heterogeneidad entre células individuales de poblaciones celulares específicas para identificar y clasificar subtipos de células, caracterizar estados intermedios que ocurren durante la diferenciación celular y explorar respuestas celulares diferenciales a estímulos. Este estudio describe un protocolo para aislar células individuales viables de embriones de pez cebra para ensayos de multiplexación de alto rendimiento. Este método se puede aplicar rápidamente a cualquier tipo de célula embrionaria de pez cebra con marcadores fluorescentes. Una extensión de este método también se puede utilizar en combinación con tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para caracterizar completamente el transcriptoma de células individuales. Como prueba de principio, se evaluó la abundancia relativa de marcadores de diferenciación cardíaca en células individuales aisladas derivadas de progenitores cardíacos nkx2.5 positivos. Mediante la evaluación de la expresión génica a nivel de una sola célula y en un solo punto de tiempo, los datos respaldan un modelo en el que los progenitores cardíacos coexisten con la progenie en diferenciación. El método y el flujo de trabajo descritos aquí son ampliamente aplicables a la comunidad de investigación del pez cebra, ya que solo requieren una línea de peces transgénicos etiquetados y acceso a tecnologías de microfluídica.

Introducción

La mayoría de los estudios actuales de la biología celular y molecular se basan en promedios de la población. Sin embargo, importantes eventos biológicos pueden estar enmascarados por estos análisis tradicionales basados en la población ya que las poblaciones de menor importancia pueden desempeñar un papel importante en los procesos biológicos y evolución de la enfermedad. La comprensión de la expresión de genes en poblaciones heterogéneas a nivel de una sola célula puede (y tiene) conducir a conocimientos biológicos y clínicos ^1,2. De interés para los estudios de desarrollo embrionario, en una población mayor de células, las células progenitoras son a m....