Artículo de método

Conversión epigenética como un método seguro y simple para obtener células secretoras de insulina a partir de fibroblastos de la piel de adultos

DOI:

10.3791/53880

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18 de marzo de 2016

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1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

En este artículo

Resumen

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Aquí, se presenta un nuevo método que permite la conversión de fibroblastos adultos de la piel en células secretoras de insulina. Esta técnica se basa en la conversión epigenética, no implica el uso de vectores retrovirales ni la adquisición de un estado pluripotente estable. Por lo tanto, es muy prometedor para aplicaciones de medicina traslacional.

Resumen

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La medicina regenerativa requiere células nuevas y completamente funcionales que se entregan a los pacientes para reparar los tejidos degenerados o dañados. Cuando estas células no están fácilmente disponibles, pueden obtenerse utilizando diferentes enfoques que incluyen, entre los muchos, la reprogramación y la transdiferenciación, con ventajas y limitaciones que son específicas de las diferentes técnicas. Aquí se describe una nueva estrategia para la conversión de un fibroblasto maduro adulto en una célula secretora de insulina, designada arbitrariamente como células epigenéticas convertidas (EpiCC). El método se ha desarrollado sobre la base de la creciente comprensión de los mecanismos que controlan la regulación epigenética del destino y la diferenciación celular. En particular, el primer paso utiliza un modificador epigenético, a saber, la 5-aza-citidina, para llevar a las células adultas a un estado "altamente permisivo". A continuación, aprovecha esta breve y reversible ventana de plasticidad epigenética para redirigir las células hacia un linaje diferente. El enfoque se denomina "conversión celular epigenética". Es una forma sencilla y robusta de obtener un conmutador interlinaje celular eficiente, controlado y estable. Dado que el protocolo no implica el uso de ninguna transfección de genes, está libre de vectores virales y no implica un estado pluripotente estable, es muy prometedor para aplicaciones de medicina traslacional.

Introducción

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Un objetivo fundamental de la medicina regenerativa es la generación de células nuevas y funcionales que se pueden utilizar para reparar o reemplazar dañado, degenerado tejidos. Rehacer células adultas fácilmente disponibles en otros nuevos, mediante la conversión de un tipo de célula a otra, es un enfoque particularmente atractivo, especialmente cuando la población de células requerido no es abundante o de difícil acceso. Sin embargo, las células adultas son extraordinariamente estables. Adquieren su estado diferenciado a través de una restricción gradual en sus opciones y, una vez que lleguen a la terminal de especialización madura, que se retengan de manera estable 1.

En los últimos años se han desarrollado una serie de protocolos, que permitan la reasignación a la pluripotencia de una célula somática (iPS) logrado a través de la expresión forzada de un conjunto de factores de transcripción 2,3. Alternativamente, la conversión de células puede obtenerse por transdiferenciación linaje directo, la introducción de un solo 4 o una combinación de factores de transcripción 5-7. Esta estrategia no implica la transición a través de un estado de-diferenciado, pero sí requiere una alta expresión de los factores de la transcripción específica 8.

Hemos desarrollado recientemente un protocolo de conversión basado en la breve exposición de las células adultas a las propiedades de desmetilación del análogo de citidina 5-azacitidina (5-aza-CR), un inhibidor de la metiltransferasa de ADN bien caracterizado. La etapa de desmetilación es seguido inmediatamente por un protocolo de diferenciación específica 9-11 que permite obtener el fenotipo de terminal requerida. Este método es capaz de convertir células maduras, diferenciadas en células de un linaje diferente y tiene la ventaja sustancial para evitar tanto el uso de vectores virales y la transfección de los factores de transcripción exógenas. La adquisición de un estado pluripotente estable, y el aumento de la susceptibilidad relacionada con la inestabilidad celular también se evita.

El protocolo detallado que permite la conversión de fibroblastos de piel humana adultas en células completamente funcionales secretoras de insulina se presenta aquí. Sin embargo, vale la pena señalar que la técnica se ha aplicado a diferentes tipos de células y ha generado resultados positivos, al dirigirse a células hacia diferentes vías de diferenciación. Además, la conversión epigenética se ha utilizado con éxito en la especie humana y porcina 9-13, así como en el perro (manuscrito presentado) lo que sugiere una amplia eficacia y la robustez de la aproximación.

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Protocolo

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Nota: Todos los procedimientos descritos a continuación deben realizarse bajo campana de flujo laminar en condiciones estériles. Asegúrese de que todos los procedimientos de cultivo se llevan a cabo en etapas termostáticas y las células se mantienen a 37 ° C en toda su manejo.

1. Aislamiento de fibroblastos de la piel

  1. Preparar Cultura Solución de revestimiento del plato
    1. Disolver 0,1 g de gelatina porcina en 100 ml de agua (concentración final 0,1%). Esterilizar la solución con autoclave.
    2. Añadir 1,5 ml de gelatina porcina estéril 0,1% a 35 mm placas de Petri. Esperar 2 horas para revestir, manteniéndolas a temperatura ambiente.
      Nota: las biopsias de piel humana son recogidos por escisión bajo anestesia local de una zona avascular de la cara anterior del antebrazo y se almacenaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) suplementado con solución antimicótica antibiótica 2% a 4 ° C antes de su uso.
  2. Lavar las biopsias con nueva PBS suplementado con 2% de antibisolución antimicótica ótica.
  3. Biopsias lugar en un plato de Petri de 100 mm y cortar en aproximadamente 2 mm 3 fragmentos con bisturís estériles.
  4. Eliminar el exceso de solución de revestimiento inmediatamente antes de chapado fragmentos.
  5. Coloque 5-6 fragmentos de piel en la placa de Petri pre-revestido 35 mm.
  6. Preparar medio de cultivo de fibroblastos: 77% de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) alto nivel de glucosa, 20% suero bovino fetal (FBS), 1% de solución de L-glutamina y 2% de solución antimicótica antibiótica.
  7. Añadir una gota de medio de fibroblastos sobre cada fragmento (por lo general 100 l por fragmento) y la cultura de ellos a 37 ° C en 5% de CO 2.
  8. Después de 24 horas, añadir 500 l de medio de cultivo de fibroblastos en los fragmentos para mantenerlos húmedos a 37 ° C en 5% de CO 2.
  9. Cambiar el medio con una pipeta al menos una vez cada 48 horas.
  10. Después de 6 días de incubación, retirar cuidadosamente los fragmentos de tejido y desecharlos.
    Nota: Después de 6 días, fibroblastoss comienzan a crecer fuera de los fragmentos de tejido y comienzan a formar una monocapa de células.
  11. Refrescar medio, agregar 2 ml de medio de cultivo de fibroblastos y continuar el cultivo en monocapa de células a 37 ° C en 5% de CO2.

2. cultivo de fibroblastos

  1. Fibroblastos de cultivo a 37 ° C en CO2 al 5% hasta 80% de confluencia
  2. Para los pases, medio de cultivo de fibroblastos de aspirado de placas de cultivo de tejidos. Lavar las células tres veces con 4 ml de PBS suplementado con solución antimicótica antibiótica 1%.
  3. Añadir una capa fina (10% del volumen de medio de cultivo) de solución de tripsina-EDTA (0,5 g de tripsina / L porcina y 0,2 g / L de EDTA) y se incuba a 37 ° C hasta que monocapa de células comienza a desprenderse de la parte inferior del tejido placa de cultivo y las células se disocian.
  4. Diluir la suspensión de células con 9 partes de medio de cultivo de fibroblastos para neutralizar la acción de la tripsina. La centrifugación no es necesario.
  5. células de la placa en nuevas placas de cultivo (confuera de gelatina) y el cultivo a 37 ° C en 5% de CO2. Mantener la relación de paso entre 1: 2 y 1: 4, dependiendo de la tasa de crecimiento.
  6. Cuando las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia, el paso de ellos (por lo general dos veces por semana).

3. fibroblastos Chapado de epigenética Conversión

  1. Añadir 0,26 ml / cm 2 de 0,1% de gelatina porcina (preparar como se describe en 1.1) a placas de cultivo celular. Esperar 2 horas para cubrir.
  2. Retire el exceso de solución de revestimiento min 10-30 antes de chapado fibroblastos.
  3. Retire el medio de cultivo de fibroblastos de placas de cultivo. Lavar las células tres veces con PBS suplementado con solución antimicótica antibiótica 1%.
  4. Añadir una capa fina (10% del volumen de medio de cultivo) de solución de tripsina-EDTA (0,5 g de tripsina / L porcina y 0,2 g / L de EDTA) y se incuba a 37 ° C hasta que monocapa de células comienza a desprenderse de la parte inferior del tejido placa de cultivo y las células se disocian.
  5. Diluir la suspensión de células con 9 partes de fibroblmedio de cultivo ast para neutralizar la acción de la tripsina.
  6. Recuento de células utilizando una cámara de recuento bajo un microscopio a temperatura ambiente. Calcular el volumen requerido de medio de cultivo de fibroblastos para resuspender las células, para obtener una concentración de células de 7,8 x 10 4 fibroblastos / cm 2. Esto dependerá del tipo específico de la cámara utilizada.
    Células / l = Promedio del número de células por rejilla (factor de multiplicación) de dilución x 90 x pequeña
  7. suspensión de células Centrifugar a 150 g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire las células sobrenadante y resuspender con el volumen calculado previamente de medio de cultivo de fibroblastos.
  8. Células de la placa en un 0,1% de gelatina platos y cultivarlas durante 24 horas a 37 ° C en 5% de CO2 pre-recubiertos.

4. Aumentar la plasticidad celular utilizando el De-metilación agente 5-aza-CR

  1. día 0
    1. Preparar 5 aza-CR-solución madre disolviendo 2,44 mg de 5-aza-CR en 10 ml de DMEM de alta glucosa medium. Esterilizar por filtración. Preparar 5-aza-CR de stock inmediatamente antes de su uso.
    2. Diluir 1 l de 5-aza-CR solución madre en 1 ml de medio de cultivo de fibroblastos (concentración final 1 mM).
    3. Para aumentar la plasticidad de las células, 24 horas después de la siembra de células (subpartida 3,8), retire el medio de cultivo de fibroblastos sembrados y añadir 1 M 5-aza-CR solución madre y la cultura durante 18 horas a 37 ° C en 5% de CO2.
  2. Día 1
    1. Preparar medio fresco Pluripotentes (HP) tal como se describe en la Tabla 1.
    2. Después de la incubación con 1 M 5-aza-CR, retire medio y lavar las células tres veces con PBS para garantizar que el 5-aza-CR se enjuaga de distancia.
    3. Incubar 5-aza-CR fibroblastos tratados con medio de HP durante 3 horas (periodo de recuperación) a 37 ° C en 5% de CO 2.
    4. Después de que el período de recuperación, eliminar medio, lavar tres veces con PBS.
    5. Para monitorizar la eficacia del tratamiento 5-aza-CR, comprobar en esta etapa fo la presencia de cambios morfológicos (detalla en la sección Resultados). Las células pierden la típica morfología alargada de fibroblastos y adquieren una forma redonda u ovalada, cada vez más pequeños en tamaño, con núcleos grandes.
    6. Proceder con la diferenciación de páncreas.

5. protocolo de diferenciación pancreático

  1. 1-6 días
    1. Preparar pancreático medio basal tal como se describe en la Tabla 2.
    2. Preparar una solución madre de activina: disolver 5 g de proteína activina A humana recombinante en 166,6 l de agua estéril.
    3. Cultura 5-aza-CR fibroblastos tratados de 0,26 ml / cm2 de páncreas medio basal suplementado con 1 l / ml activina una solución de reserva (véase 5.1.2) durante 6 días a 37 ° C en 5% de CO2. Cambiar de un día medio.
  2. 7-8 días
    1. Preparar la solución de ácido retinoico de stock mediante la adición de 16,6 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 50 mg de aci retinoicore.
    2. Células de cultivo de 0,26 ml / cm2 de páncreas medio basal suplementado con 1 l / ml de activina una solución de reserva (véase 5.1.2) y 1 l / solución de ácido retinoico Stock ml (ver 5.2.1) durante 2 días a 37 ° C en 5% de CO 2. Cambiar de un día medio.
  3. 9-36 días
    1. Células de cultivo en 0,26 ml / cm 2 de páncreas medio basal suplementado con 1% (v / v) de insulina-transferrina-selenio (ITS), 2% (v / v) B27 y 0,1% (v / v) recombinante FGF humano básico (bFGF) solución de reserva (véase la Tabla 1) a 37 ° C en 5% de CO2. Cambiar el medio al día durante los primeros 15 días.
    2. De día 16 en adelante, volver a cargar medio cada dos días, con un microscopio, ya que la formación de células de agregado puede separar de la parte inferior de la placa de cultivo.

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Resultados

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Establecimiento de cultivo primario a partir de biopsias de la piel
Las biopsias de piel se cortaron en fragmentos pequeños y se colocan en platos de gelatina pre-revestidas. Después de 6 días, los fibroblastos empezaron a crecer fuera de los fragmentos de tejido y formaron una monocapa de células (Figura 1A). Las células mostraron una típica forma alargada y, como se esperaba, mostraron una inmune-positividad uniforme para el fibroblasto vimentina marcador específi...

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Discusión

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El presente manuscrito describe un método que permite la conversión de fibroblastos de piel humana en células productoras de insulina, a través de una exposición transitoria y breve a 5-aza-CR, seguido de un protocolo de inducción específica de tejido. Este enfoque permite un interruptor del mesodermo a las células relacionadas con endodermo, sin la expresión forzada de factores de transcripción o microRNAs ni la adquisición de un estado pluripotente estable, que hace que las células más inestable y propenso a errores <...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Carraresi y la Fundación Europea para el Estudio de la Diabetes (EFSD). GP es apoyado por una beca post-doctoral de la Universidad de Milán. Los autores son miembros de la Acción COST FA1201 Epiconcept: Epigenética y periconcepción medio ambiente y la Acción COST avanza en modelos animales grandes BM1308 Sharing (Salaam). TALB de es miembro de la Acción COST CM1406 epigenética Biología Química (EPICHEM).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoSigmaD5652PBS; para el lavado celular y la preparación de soluciones
Solución antibiótica antimicóticaSigmaA5955Componente de fibroblastos, HP y medios pancreáticos
Placa de Petri de 100 mmSarstedt83.3902Para el aislamiento de fibroblastos
Gelatina porcinaSigmaG1890Para el recubrimiento de platos
WaterSigmaW3500Para la preparación de soluciones
Placas de Petri de 35 mmSarstedt83.39Para el aislamiento de fibroblastos
DMEM, glucosa alta, piruvatoLife Technologies41966052Para medio de cultivo de fibroblastos
Suero fetal bovinoLife Technologies 10500064FBS; Componente de fibroblastos y medios HP
Solución de L-glutaminaSigmaG7513Componente de fibroblastos, HP y medios pancreáticos
Solución de tripsina-EDTASigmaT3924para la disociación de fibroblastos
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 CON REJILLASHycor Biomedical87144Recuento
de células 5-AzacitidinaSigmaA23855-aza-CR, para células crécreas Plasticidad en fibroblastos
Mezcla de nutrientes F-10Life Technologies31550031para medio HP
DMEM, glucosa baja, piruvatoLife Technologies31885023para medio HP
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828028componente de la
solución de aminoácidos no esenciales MEMLife Technologies11140035Componente de HP y medios basales pancreáticos
2-MercaptoetanolSigma M7522Componente de HP y medios basales pancreáticos
GuanosinaSigmaG6264Componente de stock de mezcla de nucleósidos del medio HP
AdenosinaSigmaA4036Componente de stock de mezcla de nucleósidos del medio HP
CytidineSigmaC4654Componente de stock de mezcla de nucleósidos del medio HP
UridineSigmaU3003Mezcla de nucleósidos componente de stock de medio HP
ThymidineSigmaT1895Mezcla de nucleósidos componente de stock de medio HP
Millex-GS 0,22 & mMilliporeSLGS033SBPara la esterilización de la solución
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human ProteinLife TechnologiesPHG0261bFGF; Componente del medio basal HP y pancreático
Albúmina sérica bovina SigmaA3311BSA; Componente del medio basal pancreático
DMEM/F-12Life Technologies11320074para medio basal pancreático
B-27 Suplemento Menos Vitamina ALife Technologies12587010Componente del medio pancreático
N-2 SuplementoTechnologies17502048componente del medio basal pancreático
Activina A Proteína humana recombinanteTechnologiesPHG9014Para el medio pancreático
Ácido retinoicoSigmaR2625Para el medio pancreático
DimetilsulfóxidoSigmaD2650DMSO; para la preparación de caldos de ácido retinoico
Insulina-Transferrina-SelenioLife Technologies41400045ITS; para el medio final pancreático
Anticuerpo anti-Vimentina Abcamab8069Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:100
4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidratoSigma32670DAPI. Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo  1 y micro; g/ml
5-MetilcitidinaEurogentecMMS-900P-BPara análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:500
Anticuerpo de péptido anti-C  Abcamab14181Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:100
Anticuerpo anti-PDX1 Abcamab47267Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:500
Mercodia Insulina ELISAMercodia10-1113-10Para la detección de liberación de insulina
de Ham medio HP Life Life

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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